Name: phase behavior of charged vesicles under symmetric and asymmetric solution conditions monitored with fluorescence microscopy
Uploaded: 2017-10-24T14:00:00
Duration: 10 min 8 s
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यह काम MaxSynBio कंसोर्टियम का हिस्सा है, जो संयुक्त रूप से जर्मनी के शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय के संघीय और मैक्स प्लैंक सोसायटी द्वारा वित्त पोषित है ।

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

कभी माइक्रोन के अवलोकन के बाद से तरल-तरल चरण-अलग विशाल unilamellar बुलबुले (GUVs) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा आकार, GUVs एक मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया गया है लिपिड बेड़ा परिकल्पना की जांच करने के लिए1,2 , 3 . अपने मुक्त खड़े bilayer के क्षेत्र के रूप में जैविक कोशिकाओं से है कि की सीमा में निहित है, वे प्लाज्मा की कल्पना की विशेषता बेड़ी के उपयुक्त नकल कर रहे हैं । ऐसे GUVs पर कई अध्ययनों शुद्ध पानी में फैलाया बुलबुले के साथ प्रदर्शन किया गया है, सुक्रोज या कम-लवणता समाधान4,5,6,7,8. इन स्थितियों, तथापि, उच्च-लवणता वातावरण और ट्रांस-झिल्ली समाधान विषमता के लिए शारीरिक रूप से प्रासंगिक प्रभाव को प्रतिबिंबित नहीं कोशिकाओं के लिए शर्तों के रूप में कर रहे हैं ।
इस काम में और हमारे समूह9से पिछले प्रकाशन में, आरोप multicomponent GUVs के चरण राज्यों झिल्ली भर में नमक और समाधान विषमता की उपस्थिति के एक समारोह के रूप में जांच की गई । GUVs dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), अंडा sphingomyelin (eSM), और कोलेस्ट्रॉल (चौल) में या तो सुक्रोज समाधान (osmolarity के साथ २१० mOsm/किग्रा) या उच्च-लवणता बफर (१०० मिमी NaCl, 10 मिमी Tris, पीएच ७.५, २१० के विभिन्न अनुपात के मिश्रण से तैयार किए गए mOsm/ लिपिड विकल्प पहले से ही इस मिश्रण6,8के चरण आरेख पर प्राप्त डेटा द्वारा उचित था ।
GUVs की तैयारी के लिए तरीकों की एक संख्या साहित्य में उपलब्ध है10,11,12 (ध्यान दें कि यहां, हम एक तेल से लिपिड के हस्तांतरण को शामिल उन पर विचार नहीं होगा एक जलीय चरण के आधार पर 13 , 14 क्योंकि शेष तेल झिल्ली जो चरण व्यवहार को प्रभावित कर सकते है में अवशेषों के अंतर्निहित खतरे की) । उच्च लवणता बफर में GUVs की तैयारी विशिष्ट चुनौतियों से जुड़ी है । कम ईओण ताकत के समाधान के लिए, electroformation विधि15,16 एक त्वरित तरीका है थोड़ा दोष10,17के साथ उच्च पैदावार में GUVs तैयार प्रस्तुत करता है । विधि एक प्रवाहकीय सतह पर लिपिड की एक परत जमा पर आधारित है (इलेक्ट्रोड), उन्हें सुखाने, और उन्हें एक जलीय समाधान के साथ हाइड्रेटिंग जबकि एक एसी क्षेत्र लागू. हालांकि, इस विधि के समायोजन की आवश्यकता है यदि नमक जलीय समाधान18,19में मौजूद है । यह माना जाता है कि electroformation द्वारा पुटिका वृद्धि के लिए ड्राइविंग बल electroosmosis16 है जो उच्च conductivities20पर बाधा है । इसलिए, उच्च लवणता समाधान में GUVs के electroswelling एक सीधा दृष्टिकोण नहीं है के रूप में यह सूजन समाधान में मौजूद विभिंन नमक सांद्रता के लिए अनुकूलन की आवश्यकता है । जेल असिस्टेड पुटिका सूजन21,22 भी तेजी से गठन के समय के साथ electroformation के लिए एक संभावित विकल्प है । यह दृष्टिकोण बढ़ाया लिपिड फिल्म जलयोजन पर बनाता है जब एक जेल (agarose या polyvinyl शराब (PVA)) एक सब्सट्रेट के रूप में प्रयोग किया जाता है । इन दृष्टिकोण, तथापि, agarose आधारित सूजन के मामले में झिल्ली संदूषण के जोखिम के साथ आ23 और/या तापमान सीमा के रूप में PVA के मामले में सूजन आधारित है । इसी तरह, एक फाइबर कागज सब्सट्रेट पर GUVs बढ़ने के लिए एक प्रोटोकॉल हाल ही में स्थापित किया गया है24. इस विधि के सामांय मुद्दों सब्सट्रेट पवित्रता पर नियंत्रण की कमी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लिपिड की बड़ी मात्रा के उपयोग कर रहे हैं । इस काम में, हम परिचय और गुव तैयारी के लिए सबसे पारंपरिक विधि के लाभों को पेश करेंगे, अर्थात् सहज सूजन विधि25,26। यह एक lipophobic सब्सट्रेट पर एक लिपिड परत सुखाने के होते हैं, यह पानी भाप वातावरण में हाइड्रेटिंग, और वांछित सूजन समाधान में बाद में सूजन ( चित्रा 1 देखें और प्रोटोकॉल अनुभाग में विवरण). इस विधि पुटिका आकार वितरण पर नियंत्रण प्रदान नहीं करता है और समग्र छोटे बुलबुले में परिणाम के रूप में तरीकों की तुलना में जहां उत्पादन बिजली के क्षेत्र द्वारा सहायता प्रदान की है, बहुलक सब्सट्रेट या microfluidic का मतलब है । हालांकि, पुटिका गुणवत्ता और आकार झिल्ली चरण राज्य की जांच के रूप में यहां तलाशी के लिए उपयुक्त है ।
पुटिका झिल्ली भर में समाधान के बीच विषमता पैदा करने के साथ ही कुछ चुनौतियों के साथ जुड़ा हुआ है । एक सामांय रूप से इस्तेमाल किया दृष्टिकोण वांछित बाह्य समाधान27,28में पुटिका निलंबन के प्रत्यक्ष कमजोर पड़ने है । हालांकि, यह भी पुटिका वितरण घनत्व कम हो जाती है । एक अंय रणनीति के लिए धीरे GUVs चारों ओर एक प्रवाह सेल कि समाधान के लिए अनुमति देता है और भाटा के नीचे बसे बाहरी समाधान विनिमय है । परेशान या यहां तक कि प्रवाह के साथ बुलबुले खोने से बचने के लिए, कम प्रवाह दर लागू कर रहे है8, जो इस दृष्टिकोण समय अक्षम renders । इसके अलावा, इन तरीकों में से न तो पूर्ण बाहरी समाधान विनिमय की गारंटी देता है । एक स्पष्ट समाधान के लिए बुलबुले स्थिर करने के क्रम में उंहें एक बाहरी समाधान विनिमय के दौरान खोने से बचने के लिए है । उदाहरण के लिए, biotinylated GUVs एक streptavidin-लेपित सतह29पर सीमित किया जा सकता है । हालांकि, इस दृष्टिकोण का पालन किया और इसलिए गैर का पालन झिल्ली क्षेत्रों30,31में संरचना रूपांतरों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । झिल्ली तनाव३२थोपे में बुलबुले जाल करने के लिए चुंबकीय या बिजली के खेतों के आवेदन । एक पुटिका जाल करने के लिए ऑप्टिकल चिमटी को रोजगार एक संलग्न संभाल (यानी एक मनका) की आवश्यकता है, जबकि ऑप्टिकल स्ट्रेचर का उपयोग स्थानीय हीटिंग३३शामिल हो सकते हैं । GUVs की ट्रैपिंग भी अंतिम टुकड़ी३४के बिना उंहें प्लैटिनम तारों पर बढ़ द्वारा पूरा किया जा सकता है । यह हालांकि पैदावार बुलबुले जो अलग नहीं कर रहे है और जो आम तौर पर पतले लिपिड ट्यूब (तार) द्वारा तारों या अंय बुलबुले से जुड़े हैं ।
प्रस्तुत काम aforementioned सीमाओं को दूर करने के लिए रणनीतियों पर प्रकाश डाला गया । हम पहले सहज सूजन विधि का एक विस्तृत विवरण प्रस्तुत अनुकूलित और उच्च लवणता बफ़र्स में GUVs के उत्पादन के लिए अनुकूलित । हम तो कुशलतापूर्वक सरल कमजोर पड़ने या एक microfluidic डिवाइस के उपयोग से असममित समाधान की स्थिति बनाने के लिए दो दृष्टिकोण लागू. क्योंकि हमारा लक्ष्य अलग समाधान की स्थिति में GUVs की झिल्ली चरण राज्य के विश्लेषण है, बाद के वर्गों सफल सांख्यिकीय विश्लेषण और झूठी वर्गीकरण से बचने के लिए वर्तमान संकेतों के लिए मानदंड का वर्णन ।
विश्लेषण के रूप में अच्छी तरह के रूप में अलग तापमान के तहत इज़ोटेर्माल शर्तों के तहत प्रदर्शन किया गया । जबकि तापमान सीontrol आमतौर पर कार्यरत है, प्रयोगात्मक तापमान नियंत्रण कक्षों के बारे में विवरण शायद ही कभी वर्णित हैं । यहां, एक में घर बनाया सेटअप विभिंन तापमान शर्तों पर GUVs निरीक्षण प्रस्तुत किया है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol), sodium salt</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840475C</td>
			<td>abbreviated as DOPG in the text</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chicken egg sphingomyelin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860061</td>
			<td>abbreviated as eSM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol (ovine wool, &#62; 98 %)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>700000</td>
			<td>abbreviated as Chol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#129;&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D-282</td>
			<td>abbreviated as DiIC18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, HPLC grade (&#8805; 99.8 %)</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (&#62; 99.8 %)</td>
			<td>Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (37 %)</td>
			<td>Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (&#8805; 99.9 %)</td>
			<td>Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (&#8805; 99.5 %)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded vial 45x27 mm, 15 mL</td>
			<td>Kimble</td>
			<td></td>
			<td>Soda flat bottom, white screw cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MP220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Gonotec</td>
			<td>Osmomat030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epi-fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 40x, 0.6 NA</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LD Achroplan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 40x, 0.75 NA</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 63x, 0.9 NA</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide, 56x26 mm, 0.17 &#177; 0.01 mm</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip, 22x22 mm, 0.17 &#177; 0.01 mm</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;aser</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Bremix Flexible Packaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 5 mL, 10 mL</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>GVS North America</td>
			<td>Cameo 25AS, 1213723</td>
			<td>Acetate, sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phase behavior of charged vesicles under symmetric and asymmetric solution conditions monitored with fluorescence microscopy

चरण-अलग विशालकाय unilamellar बुलबुले (GUVs) के प्रदर्शन के लिए एक सहअस्तित्व तरल-आदेश दिया और तरल-परिक्रमा डोमेन एक आम भौतिक लिपिड बेड़ा परिकल्पना की जांच करने के लिए उपकरण हैं । कई अध्ययनों, तथापि, उपेक्षा शारीरिक समाधान शर्तों के प्रभाव । उस खाते पर, वर्तमान काम dioleylphosphatidylglycerol, अंडा sphingomyelin, और कोलेस्ट्रॉल से बड़े आरोपित GUVs में तरल-तरल चरण जुदाई पर उच्च लवणता बफर और ट्रांस झिल्ली समाधान विषमता का प्रभाव प्रस्तुत करता है । प्रभाव इज़ोटेर्माल और अलग तापमान की स्थिति के तहत अध्ययन किया गया ।
हम उपकरण और प्रयोगात्मक सममित और असममित उच्च लवणता समाधान की स्थिति के तहत आरोपित बुलबुले में एक साथ तरल डोमेन के स्थायित्व की निगरानी के लिए लागू रणनीतियों का वर्णन । यह उच्च तापमान पर उच्च-लवणता बफ़र में आरोपित multicomponent GUVs तैयार करने के लिए एक दृष्टिकोण भी शामिल है । प्रोटोकॉल पुटिका कमजोर पड़ने को कम करते हुए एक सरल कमजोर पड़ने के कदम से बाहरी समाधान के एक आंशिक विनिमय प्रदर्शन करने के लिए विकल्प पर जोर देता है । एक वैकल्पिक दृष्टिकोण एक microfluidic डिवाइस है कि एक पूरा बाहरी समाधान विनिमय के लिए अनुमति देता है का उपयोग प्रस्तुत किया है । चरण पृथक्करण पर समाधान प्रभाव भी अलग तापमान के तहत अध्ययन किया गया । यह अंत करने के लिए, हम बुनियादी डिजाइन और एक घर में निर्मित तापमान नियंत्रण कक्ष के उपयोगिता प्रस्तुत करते हैं । इसके अलावा, हम गुव चरण राज्य, इसके साथ जुड़े नुकसान और कैसे उंहें दरकिनार करने के आकलन पर प्रतिबिंबित ।

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Phase Behavior of Charged Vesicles Under Symmetric and Asymmetric Solution Conditions Monitored with Fluorescence Microscopy

विशाल unilamellar बुलबुले अलग चरण पर प्रयोग (GUVs) अक्सर उपेक्षा शारीरिक समाधान की स्थिति । इस काम के लिए उच्च लवणता बफर के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए दृष्टिकोण प्रस्तुत multicomponent GUVs में तरल चरण जुदाई ट्रांस झिल्ली समाधान विषमता और तापमान के एक समारोह के रूप में ।

सममित और असममित समाधान शर्तों के तहत आरोपित बुलबुले के चरण व्यवहार प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ नजर रखी

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Research

JoVE Journal

Chemistry

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