Name: phase behavior of charged vesicles under symmetric and asymmetric solution conditions monitored with fluorescence microscopy
Uploaded: 2017-10-24T14:00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phase Behavior of Charged Vesicles Under Symmetric and Asymmetric Solution Conditions Monitored with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Эта работа является частью MaxSynBio консорциум, который совместно финансируется федеральным министерством образования и научных исследований Германии и Общество Макса Планка.

Авторы не имеют ничего сообщать.

С тех пор наблюдения микронного размера доменов в жидкость жидкость фаза отделенный гигантских однослойных везикул (GUVs) по микроскопии флуоресцирования GUVs были использованы в качестве модели системы исследовать липидный Рафт гипотеза1,2 , 3 . Как район их свободностоящая бислой лежит в диапазоне, от биологических клеток, они являются подходящим имитирует плазменных мембран, показывая гипотетическая плоты. Были проведены многочисленные исследования по таким GUVs с везикулы, диспергированных в чистой воде, сахароза или низкой солености решения4,5,6,,78. Эти условия, однако, не отражает физиологически соответствующие воздействия засоленных сред и транс мембраны решение асимметрия биомембран, как условия для клеток.
В этой работе и в предыдущей публикации из нашей группы9фазовые состояния заряженных многокомпонентных GUVs были рассмотрены как функция присутствие соли и решения асимметрия через мембрану. GUVs были подготовлены из смеси различных соотношениях dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), яйцо сфингомиелин (eSM) и холестерина (Чхоль) раствора сахарозы (с осмолярности 210 мОсм/кг) или высокой солености буфера (100 мм NaCl, 10 мм трис, pH 7.5, 210 мОсм/кг). Выбор липидов было оправдано данных, уже полученных на схеме фаза этой смеси6,8.
Ряд методов для подготовки GUVs доступны в литературе10,,1112 (Обратите внимание, что здесь, мы не будем рассматривать те, связанных с передачей липидов из масляной основе в водной фазе 13 , 14 из-за опасность оставшихся нефтяных остатков в мембраны, которые могут повлиять на поведение фаза). Подготовка GUVs в буфере засоленных связан с конкретными проблемами. Для решения низкой ионной силы electroformation метод,1516 представляет быстрый способ подготовить GUVs в высоких урожаев с мало дефектов10,17. Метод основан на внесение слой липидов на проводящие поверхности (электродов), сушки их и увлажняет их водным раствором при применении переменного поля. Однако этот метод требует корректировки, если соли в растворе18,19. Предполагается, что движущей силой роста везикул, electroformation является электроосмос16 , препятствующее высокой проводимости20. Таким образом electroswelling GUVs в засоленных решения не является простой подход, как он требует оптимизации для различных концентраций соли присутствуют в решении отек. Гель помощь везикул, отек21,22 является потенциальной альтернативой electroformation с даже быстрее формирование раз. Этот подход основывается на расширенной липидных Фильм гидратации, когда гель (агарозы или поливинилового спирта (ПВС)) используется в качестве подложки. Эти подходы, однако, приходят с риском загрязнения мембраны в случае на основе агарозы отек23 и/или температуры ограничения как и в случае на основе ПВА отек. Аналогичным образом протокол расти GUVs на бумажной подложке целлюлозы недавно был установленным24. Общие вопросы этого метода являются отсутствие контроля над субстрата чистотой, а также использование большого количества липидов. В этой работе мы представляем и представить преимущества наиболее традиционным методом GUV подготовки, а именно спонтанные отек метод25,26. Он состоит из сушки липидного слоя на подложке реагирует, увлажняющий в атмосфере водяного пара и последующие припухлость в желаемое решение опухоль (см. Рисунок 1 и детали в разделе протокол). Этот метод не имеет контроля над распределением размер пузырьков и результаты в целом небольшие пузырьки по сравнению с методами, где производство оказывают электрического поля, полимерной подложке или microfluidic означает. Однако везикул качество и размер подходит для изучения мембраны фазового состояния как изучить здесь.
Создание асимметрия между решениями через везикул мембранных связано с определенными проблемами. Один из часто используемых подходов является прямым разрежения везикул подвеска в желаемого внешнего решения27,28. Однако это также снижает плотность распределения везикул. Другая стратегия заключается в медленно обмен внешние решения вокруг GUVs поселились в нижней части потока клетки, что позволяет для решения в - и outflux. Чтобы избежать беспокойства или даже потери везикулы с потоком, низкого расхода являются прикладной8, который делает этот подход время неэффективно. Кроме того ни один из этих подходов не гарантирует полное внешнее решение обмена. Очевидным решением является обездвижить пузырьки во избежание потерять их во время внешнего решения обмена. К примеру биотинилированным GUVs могут привязными на стрептавидина покрытием поверхности29. Однако этот подход может привести к композиционным вариации на придерживался и следовательно неприкрепленных мембраны сегментов30,31. Применение магнитных или электрических полей в ловушку везикулы результаты в навязывании мембраны напряженности32. Используя Оптический пинцет для улавливания везикул требует наличия ручкой прилагается (т.е. шарик), в то время как использование оптических носилках может включать в себя местное отопление33. Треппинг GUVs также может быть достигнуто путем выращивания их на Платиновый провода без окончательного отряд34. Однако это дает пузырьки, которые не являются изолированным и которые обычно связаны с провода или другие пузырьки, тонкий липидный трубы (тросов).
Представленные работы подчеркивает стратегии для преодоления вышеуказанных ограничений. Мы сначала представить подробное описание метода спонтанное отек адаптирована и оптимизирована для производства GUVs в засоленных буферов. Затем мы представляем два подхода к эффективно создавать асимметричные решения условий простой разрежения или использования microfluidic устройства. Потому, что наша цель заключается в анализе мембраны фазового состояния GUVs в условиях различных решений, в последующих разделах описываются критерии для успешного статистического анализа и настоящем подсказки для предотвращения ложных классификации.
Анализы при изотермических условиях, а также при различных температурах. Хотя температура control обычно работает, подробности о экспериментальный контроль температуры камеры редко описаны. Здесь представлен доме построен установки соблюдать GUVs в различных температурных условиях.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol), sodium salt</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840475C</td>
			<td>abbreviated as DOPG in the text</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chicken egg sphingomyelin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860061</td>
			<td>abbreviated as eSM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol (ovine wool, &#62; 98 %)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>700000</td>
			<td>abbreviated as Chol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#129;&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D-282</td>
			<td>abbreviated as DiIC18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, HPLC grade (&#8805; 99.8 %)</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (&#62; 99.8 %)</td>
			<td>Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (37 %)</td>
			<td>Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (&#8805; 99.9 %)</td>
			<td>Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (&#8805; 99.5 %)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded vial 45x27 mm, 15 mL</td>
			<td>Kimble</td>
			<td></td>
			<td>Soda flat bottom, white screw cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MP220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Gonotec</td>
			<td>Osmomat030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epi-fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 40x, 0.6 NA</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LD Achroplan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 40x, 0.75 NA</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 63x, 0.9 NA</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide, 56x26 mm, 0.17 &#177; 0.01 mm</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip, 22x22 mm, 0.17 &#177; 0.01 mm</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;aser</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Bremix Flexible Packaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 5 mL, 10 mL</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>GVS North America</td>
			<td>Cameo 25AS, 1213723</td>
			<td>Acetate, sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phase behavior of charged vesicles under symmetric and asymmetric solution conditions monitored with fluorescence microscopy

Фаза отделенный гигантских однослойных везикул (GUVs) экспонируется сосуществующих жидкость приказал и жидкости неупорядоченных домены общего биофизических инструмент исследовать липидный Рафт гипотезы. Многочисленные исследования, однако, игнорировать влияние условий физиологического раствора. На тот счет текущая работа представляет эффект засоленных буфера и транс мембраны решение асимметрии на разделение фаз жидкость жидкость в заряженных GUVs, от dioleylphosphatidylglycerol, яйцо сфингомиелин и холестерина. Последствия были изучены при изотермических и различных температурных условиях.
Мы описываем оборудования и экспериментальных стратегий для контроля стабильности сосуществующих жидкого доменов в заряженных везикулы условиях симметричных и асимметричных высокой солености раствора. Это включает в себя подход подготовить заряженных многокомпонентных GUVs в буфере засоленных при высоких температурах. Протокол предполагает возможность выполнить частичный обмен внешние решения простой разрежения шаг при сведении к минимуму везикул разрежения. Альтернативный подход представлен используя microfluidic устройство, которое позволяет для полного внешнего решения обмена. Изучались также влияние решения на разделение фаз при различных температурах. С этой целью мы представляем основные дизайна и полезности палаты управления внутренних построен температуры. Кроме того мы размышляем об оценке GUV фазового состояния, ловушки, связанные с ним и как обойти их.

Watch this Scientific Journal Video about Phase Behavior of Charged Vesicles Under Symmetric and Asymmetric Solution Conditions Monitored with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Phase Behavior of Charged Vesicles Under Symmetric and Asymmetric Solution Conditions Monitored with Fluorescence Microscopy

Эксперименты по фазе отделены гигантских однослойных везикул (GUVs) часто пренебрегают условия физиологического раствора. Эта работа представляет подходы для изучения влияния высокой солености буфера на разделение фаз жидкость жидкость в заряженном многокомпонентных GUVs как функция транс мембраны решение асимметрии и температуры.

Фаза поведение заряженных везикулы условиях симметричные и асимметричные решения, контролировать с микроскопии флуоресцирования

Phase-separated giant unilamellar vesicles (GUVs) exhibiting coexisting liquid-ordered and liquid-disordered domains are a common biophysical tool to ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides

Определение газовой фазе кислотность олигопептидов

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue ...

Particles without a Box: Brush-first Synthesis of Photodegradable PEG Star Polymers under Ambient Conditions

Частицы без коробки: Щетка-первая Синтез фотодеградируемое ПЭГ Star полимеров в условиях окружающей среды

Convenient methods for the rapid, parallel synthesis of diversely functionalized nanoparticles will enable discovery of novel formulations for drug ...

Mizoroki-Heck Cross-coupling Reactions Catalyzed by Dichloro{bis[1,1',1''-(phosphinetriyl)tripiperidine]}palladium Under Mild Reaction Conditions

Mizoroki-Heck Cross-coupling Reactions Catalyzed by Dichloro{bis[1,1',1''-phosphinetriyltripiperidine]}palladium Under Mild Reaction Conditions

Mizoroki-Хека Реакции кросс-сочетания, катализируемой дихлор {бис [1,1 &#39;, 1&#39;&#39; - (phosphinetriyl) tripiperidine]} палладия в мягких условиях реакции

Dichloro-bis(aminophosphine) complexes of palladium with the general formula of [(P{(NC5H10)3-n(C6H11)n})2Pd(Cl)2] (where n = 0-2), belong to a new family ...

Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology

Синтетическая методология для асимметричных Ферроцен, полученных Bio-сопряженных систем через Solid методологии фазы смолу на основе

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. ...

A Simple Method for the Size Controlled Synthesis of Stable Oligomeric Clusters of Gold Nanoparticles under Ambient Conditions

Простой метод для размера контролируемого синтеза стабильных олигомерных кластеров наночастиц золота в условиях окружающей среды

Reducing dilute aqueous HAuCl4 with sodium thiocyanate (NaSCN) under alkaline conditions produces 2 to 3 nm diameter nanoparticles. Stable grape-like ...

Construction and Systematical Symmetric Studies of a Series of Supramolecular Clusters with Binary or Ternary Ammonium Triphenylacetates

Строительство и систематические симметричные Исследования из серии супрамолекулярных кластеров с двойная или тройная аммония Triphenylacetates

Functions of clusters in nano or sub-nano scale significantly depend on not only kinds of their components but also arrangements, or symmetry, of their ...

A Protocol for Electrochemical Evaluations and State of Charge Diagnostics of a Symmetric Organic Redox Flow Battery

Протокол для гальванических оценок и состояние заряда диагностики Симметричный органических Редокс Flow Батарея

Redox flow batteries have been considered as one of the most promising stationary energy storage solutions for improving the reliability of the power grid ...

Probing the Structure and Dynamics of Interfacial Water with Scanning Tunneling Microscopy and Spectroscopy

Проверка структуры и динамики межфазного воды с сканирование туннелирования микроскопии и спектроскопии

Water/solid interfaces are ubiquitous and play a key role in many environmental, biophysical, and technological processes. Resolving the internal ...

Fabricating High-viscosity Droplets using Microfluidic Capillary Device with Phase-inversion Co-flow Structure

Изготовления капель высокой вязкости, используя Microfluidic капиллярного устройства с фазы инверсии потока со структурой

The generation of monodisperse droplets with high viscosity has always been a challenge in droplet microfluidics. Here, we demonstrate a phase-inversion ...

Solid-phase Synthesis of [4.4] Spirocyclic Oximes

Твердофазный синтез [4.4] Оксимы Spirocyclic

A convenient synthetic route for spirocyclic heterocycles is well sought after due to the molecule&#39;s potential use in biological systems. By means of ...