Name: primordial germ cell transplantation for crispr/cas9-based leapfrogging in xenopus
Uploaded: 2018-02-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus at JoVE.com

Dette arbejde blev udført med støtte fra et tilskud, 5R21HD080684-02, fra National Institute of Child Health og menneskelig udvikling. Forfatteren ønsker at takke Ken Cho for hans fortsatte entusiasme og støtte. Forfatteren ønsker også at anerkende Bruce Blumberg for brug af sit kamera, Rebekka Charney, for kritisk læsning af manuskript, og Sean McNamara og Marcin Wlizla på de nationale Xenopus ressource (RRID:SCR_013731), for værdifuldt samtaler om X. tropicalis fodring og pasning af dyr regimer.

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af University of California, Irvine.
1. forberede PGC Transplantation
<ol><li>Forberede dissektion værktøjer på forhånd, som tidligere beskrevet23. Bemærk: Øjenbryn hår knive bruges til at gøre indsnit med bistand fra en hår løkke til at stabilisere fosteret under udførelse af operationer. Øjenbryn hår og hår sløjfer er limet til borsilikatglas Pasteur pipet...

<ol>
	<li>Gurdon, J. B., Hopwood, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+introduction+of+Xenopus+laevis+into+developmental+biology:+of+empire,+pregnancy+testing+and+ribosomal+genes.">The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes.</a> Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).</li><li>Hellsten, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+Western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis.">The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Science. 328 (5978), 633-636 (2010).</li><li>Session, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+evolution+in+the+allotetraploid+frog+Xenopus+laevis.">Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis.</a> Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).</li><li>Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biallelic+genome+modification+in+F(0)+Xenopus+tropicalis+embryos+using+the+CRISPR/Cas+system.">Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system.</a> Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).</li><li>Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis.">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+RNA/Cas9-mediated+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis.">Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Development. 141 (3), 707-714 (2014).</li><li>Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+disruption+in+Xenopus+laevis+using+CRISPR/Cas9.">Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9.</a> Cell Biosci. 5, 15 (2015).</li><li>Jaffe, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c21orf59/kurly+Controls+Both+Cilia+Motility+and+Polarization.">c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization.</a> Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+of+genes+involved+in+neural+crest+development+using+the+CRISPR/Cas9+system+in+Xenopus+embryos.">Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos.</a> Cell Biosci. 6, 22 (2016).</li><li>Naert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+knockout+of+rb1+and+rbl1+leads+to+rapid+and+penetrant+retinoblastoma+development+in+Xenopus+tropicalis.">CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis.</a> Sci Rep. 6 (35264), (2016).</li><li>Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+Xenopus+laevis+F1+albino+J+strain+by+genome+editing+and+oocyte+host-transfer.">Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer.</a> Dev Biol. 426 (2), (2016).</li><li>Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9:+An+inexpensive,+efficient+loss+of+function+tool+to+screen+human+disease+genes+in+Xenopus.">CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus.</a> Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).</li><li>Shigeta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+analysis+of+gene+function+using+CRISPR-Cas9+in+Xenopus+tropicalis+founders.">Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders.</a> Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).</li><li>Hontelez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+transcription+is+controlled+by+maternally+defined+chromatin+state.">Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state.</a> Nat Commun. 6, 10148 (2015).</li><li>Peshkin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Relationship+of+Protein+and+mRNA+Dynamics+in+Vertebrate+Embryonic+Development.">On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development.</a> Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).</li><li>Owens, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Absolute+RNA+Copy+Numbers+at+High+Temporal+Resolution+Reveals+Transcriptome+Kinetics+in+Development.">Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development.</a> Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).</li><li>Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leapfrogging:+primordial+germ+cell+transplantation+permits+recovery+of+CRISPR/Cas9-induced+mutations+in+essential+genes.">Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes.</a> Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).</li><li>Blackler, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+germ-cells+in+Xenopus+laevis.">Transfer of germ-cells in Xenopus laevis.</a> Nature. 185, 859-860 (1960).</li><li>Blackler, A. W., Fischberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+primordial+germ-cells+in+Xenopus+laevis.">Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis.</a> J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).</li><li>Bounoure, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> L'origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , (1939).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , (1979).</li><li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules.">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+dissection+and+micromanipulation+tools.">Embryo dissection and micromanipulation tools.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-based+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis.">Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).</li><li>Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+transgenesis+in+Xenopus+using+I-SceI+meganuclease.">High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , (2000).</li><li>Kay, B. K., Kay, B. K., Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+oocytes+and+embryos.">Injection of oocytes and embryos.</a> Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). , (1991).</li><li>Nieuwkoop, P., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. , (1994).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Res. 42 (22), e168 (2014).</li><li>Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+opposing+homeobox+genes+Goosecoid+and+Vent1/2+self-regulate+Xenopus+patterning.">The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning.</a> EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).</li><li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system.">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li><li>Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+with+CRISPR-Cas-derived+RNA-guided+endonucleases.">Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases.</a> Nat Commun. 5, 3157 (2014).</li><li>Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+cells+with+zinc+finger+nucleases+constructed+via+modular+assembly.">Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly.</a> Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).</li><li>Qiu, P., Shandilya, H., D'Alessio, J. M., O'Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+detection+using+Surveyor+nuclease.">Mutation detection using Surveyor nuclease.</a> Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).</li><li>Ota, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+identification+of+TALEN-mediated+genome+modifications+using+heteroduplex+mobility+assays.">Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays.</a> Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).</li><li>Dahlem, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Methods+for+Generating+and+Detecting+Locus-+Specific+Mutations+Induced+with+TALENs+in+the+Zebrafish+Genome.">Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome.</a> PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).</li><li>Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genotyping+of+CRISPR/Cas9-mediated+mutants+using+fluorescent+PCR-capillary+gel+electrophoresis.">High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis.</a> Sci Rep. 5, 15587 (2015).</li><li>Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9:+An+inexpensive,+efficient+loss+of+function+tool+to+screen+human+disease+genes+in+Xenopus.">CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus.</a> Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).</li><li>Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR+Based+Protocol+for+Detecting+Indel+Mutations+Induced+by+TALENs+and+CRISPR/Cas9+in+Zebrafish.">A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish.</a> PLoS ONE. 9 (6), e98282 (2014).</li><li>Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+to+assess+gene-editing+frequencies+(GEF-dPCR)+mediated+by+designer+nucleases.">Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases.</a> Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).</li><li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+gene+targeting+and+phenotyping+in+zebrafish+using+CRISPR/Cas9.">High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).</li><li>Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains.">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).</li><li>Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elr-type+proteins+protect+Xenopus+Dead+end+mRNA+from+miR-18-mediated+clearance+in+the+soma.">Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).</li><li>Yang, J., Aguero, T., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+maternal-to-zygotic+transition+from+the+perspective+of+the+germline.">The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline.</a> Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).</li></ol>

Denne rapport indeholder en detaljeret protokol for transplantation af vegetabilsk væv indeholdende PGCer. Transplantation PGCs bruges sammen med genom-redigering teknologier (f.eks. CRISPR/Cas9) til at ændre germline dyrets mens opretholde næsten alle dens somatiske væv som genetisk vildtype. For kvantespring for at blive en succes, er der en række kritiske faktorer at overveje, inden du udfører udfører transplantationscentre.
For at sikre komplet udskiftning af germline med m...

Hvordan genotype koder fænotype har været et vigtigt spørgsmål i biologi da genopdagelsen af Mendels love. En forståelse af gener, deres forordning og interaktioner inden for genet netværk roller og funktioner af kodede produkter løfter at levere værktøjer til afsløring nye biologi og mildne sygdomstilstande. For over et halvt århundrede1været afrikanske jeg frøen, Xenopus, en førende model for undersøgelser på en bred vifte af emner i grundlæggende biologi og biomedicin, herunder den genetiske kontrol af udviklingen. Historisk set, de fleste forskning på Xenopus har brugt allotetraploid frøen, X. laevis, men mere for nylig, på grund af dens diploidy, X. tropicalis er blevet udviklet som en padde genetiske model. Komplet genom sekvenser er blevet samlet fra begge Xenopus arter2,3. Fællesskabets"frøen" er nu på et vendepunkt hvor grundlæggende genom ændring teknologi tillader undersøgelse af genfunktioner, næsten efter behag. Programmerbare CRISPR/Cas9 endonucleases har gjort mutagenese af gener højeffektive, med biallelic mutation muligt i de fleste celler af animalsk4,5,6,7, 8,9,10,11. Disse undersøgelser, understreget af Bhattacharya et al. 12 og Shigeta et al. 13, har vist, at funktionen af mange gener kan studeres af mutagenese i F0 mosaik dyr. Denne tilgang har mange fordele; Cas9-sgRNA-microinjected embryoner vises dog ofte variable fænotyper som følge af ufuldstændig tab af funktion (LOF). Flere betydeligt, generation af mutant linjer er meget fordelagtige for nogle programmer — især når man studerer gener, der har en maternel mRNA bidrag. Maternel mRNAs og proteiner og deres påvirkninger på Epigenetik, fortsætter i en længere periode i embryogenese14,15,16, gengivelse de tidlige udviklingsmæssige bidrag af mange gener Ildfaste F0 analyser. Andre LOF tilgange er derfor påkrævet.
Når de forsøger at oprette mutant linjer, har stien til at opnå homozygot LOF embryoner flere forhindringer. Første, effektiv mutagenese at producere biallelic mutationer kan være ufordelagtige, fordi tab af væsentlige genet funktioner resulterer i manglende evne til at overleve til seksuel modenhed, at blande sig med produktion af en levedygtig linje. En fælles løsning er omhyggelig med titrering af mængden af Cas9-sgRNA leveres. Her er målet at opnå en balance mellem at reducere dødelighed samtidig også maksimere kønscelleoverførsel mutagenese effektivitet. Et andet problem opstår fra standard avl ordningen, hvor fænotypiske analyser er udskudt indtil F2 generation. Ved hjælp af standardmetoden, kønsmodne F0 dyr, der overfører muterede alleler gennem germline er outcrossed til at producere F1 heterozygous "bærere", som dyrkes derefter til seksuel modenhed. To F1 heterozygote er derefter intercrossed til at producere F2 mutant embryoner med en forventet mendelske hyppighed på 25%. To generationer af avl er således nødvendige for analyse af mutant fænotyper. Mutant dyr kunne være enten homozygote eller sammensatte heterozygote (dvs. afkom der indeholder to forskellige mutante alleler, der afhænger af genotyper af forældrenes dyrene bruges i F1 intercross).
Disse hindringer kan overvindes ved at begrænse programmerbare nukleasen-medieret mutagenese til kønsceller, der ligger til grund for en ny metode kaldet kassationsdomstolen17. Kvantespring har to hovedelementer: (1) mikroinjektion af Cas mRNA sammen med sgRNA eller nukleasen-sgRNA komplekser (eller i princippet, TALENs eller zink finger nukleaser) på én celle stadium til effektivt mutagenize embryonale genomer, efterfulgt af (2) transplantation af PGCs til vildtype søskende embryoner, hvor de endogene PGCs blev fjernet. Når begge trin er effektiv, komplet kønscelleoverførsel udskiftning med mutant kønsceller kan opnås. Blackler viste tidligt i 1960 ' erne at Xenopus PGCs kunne transplanteres mellem embryoner på den sene neurula og tidlige tailbud stadier18,19. For kvantespring, blev Blacklers tilgang ændret ved at udføre transplantationscentrene blastula fase17, når PGCs er lokaliseret i vegetal pole embryo20,21. Transplantation før gastrulation har to store fordele. Første blev engraftment transplantationer og den efterfølgende normale udvikling fundet for at være mere effektiv, når transplantation udføres på stadiet blastula (upublicerede observationer). For det andet ved at udføre blastula-fase transplantationscentre, kort tid efter zygotisk transskription er begyndt, kan man undgå dødelighed som følge af udviklingsmæssige gen mutationer, der forstyrrer gastrulation eller som ellers fører til forkert udformede sene neurulae. PGC transplantation-bærende ("leapfrogged") embryoner dyrkes til seksuel modenhed, og intercrosses mellem disse F0 dyr har vist, at 100% F1 afkom i mange tilfælde vise LOF fænotype (de fleste er sammensat heterozygote), der angiver komplet kønscelleoverførsel udskiftning med de målrettede mutationer.
Det forventes, at kvantespring vil fremskynde genetiske metoder i Xenopus. Kvantespring også udgør et alternativ til "host overførsel" metode22 til LOF analyse af maternel-effekt gener (upublicerede observationer). I den aktuelle publikation præsenteres en detaljeret beskrivelse af den metode, især med fokus på PGC transplantation, i X. tropicalis (med mindre ændringer til X. laevis). Transplantation af PGCs er vist her for at lette en mere hurtig overførsel af denne teknologi til andre laboratorier, der arbejder med Xenopus. Principperne i denne metode skal være vellykket i andre padder (f.eks. urodeles), og organisme-specifikke ændringer i metoden bør give mulighed for anvendelse til mange andre dyr, hvor der kan opnås effektive mutagenese og PGCs er let transplanterbare.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20 or 11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyebrow hair knife</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair loop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, borosilicate glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy Glue (Cyanoacrylate-based)</td>
			<td>Elmer&#39;s Products, Inc.</td>
			<td>KG581</td>
			<td>To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligodeoxynucleotides, custom ordered</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Custom ordered</td>
			<td>Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megascript T7 kit</td>
			<td>Ambion/ThermoFisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol, Tris buffered</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High quality distilled phenol from any commercial supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High quality chloroform from any commercial supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High quality ethanol from any commercial supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma Chemical Co.</td>
			<td>D5758-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein, with nuclear localization signal</td>
			<td>PNA Bio, Inc.</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer&#39;s recommendations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Marc&#39;s Modified Ringers solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any Molecular Biology grade agarose is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 X15 mm Petri plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Chemical Co.</td>
			<td>C7352-100G</td>
			<td>Free base, not HCl salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03 115 828 001</td>
			<td>Typically ~20mg/ml from Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sera Micron</td>
			<td>sera</td>
			<td></td>
			<td>Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primordial germ cell transplantation for crispr/cas9-based leapfrogging in xenopus

Oprettelsen af mutant linjer af genom-redigering er accelererende genetisk analyse i mange organismer. CRISPR/Cas9 metoder er blevet tilpasset til brug i den afrikanske jeg frøen, Xenopus, en mangeårige model organisme for biomedicinsk forskning. Traditionelle avl ordninger for at skabe homozygot mutant linjer med CRISPR/Cas9-målrettet mutagenese har flere tidskrævende og besværlige trin. For at lette oprettelsen af mutant embryoner, især at overvinde de hindringer, der er tilknyttet udskære gener, der er afgørende for embryogenese, blev der udviklet en ny metode kaldet kvantespring. Denne teknik udnytter robustheden af Xenopus embryoner til at "klippe og klistre" embryologiske metoder. Kvantespring udnytter overførsel af primordiale kønsceller (PGCs) fra effektivt mutagenized donorembryoner i PGC-ablated vildtype søskende. Denne metode giver mulighed for effektiv mutation af væsentlige gener ved at oprette kimære dyr med vildtype somatiske celler, der bærer en mutant kønscelleoverførsel. Når to F0 dyr transporterer "leapfrog transplantationer" (dvs. mutant kønsceller) er intercrossed, de producerer homozygote eller sammensatte heterozygous, null F1 embryoner, hvilket sparer en fuld generationstid at opnå fænotypiske data. Kvantespring giver også en ny tilgang til at analysere moderens effekt gener, som er refraktære over for F0 fænotypiske analyser efter CRISPR/Cas9 mutagenese. Dette manuskript detaljer metoden for kvantespring, med særlig vægt på hvordan man med held udføre PGC transplantation.

Efter transplantation, kvalitativ bestemmelse af effektiviteten af CRISPR/Cas9 mutagenese bør udføres før expending indsats i dyrehold at dyrke og vedligeholde dyr til seksuel modenhed. Fordi dyr transporterer leapfrog transplantationer er somatically vildtype og germline er vanskeligt at få adgang til direkte målinger, bliver gemme slagtekroppe af donorembryoer vigtigt. DNA-analyser fra kroppe fungerer som en proxy for omfanget af mutagenese, der opstår i den transplanterede kønsc...

Watch this Scientific Journal Video about Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus at JoVE.com

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Gener afgørende for overlevelse udgør tekniske forhindringer for at skabe mutant linjer. Kvantespring omgår dødelighed ved at kombinere genom-redigering med primordiale kønsceller transplantation til skabe wild-type dyr transporterer kønscelleoverførsel mutationer. Kvantespring også tillader den effektive generation af homozygot null mutanter i F1 generation. Her, er trinnet transplantation påvist.

Primordiale kønsceller Transplantation til CRISPR/Cas9-baserede kvantespring i Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Opdræt og dobbelt-strenget RNA-medieret Gene Knockdown i Skjul Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning af Copy Number Ændringer Brug Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Single-celle Gene Expression Profiling Brug FACS og qPCR med interne standarder

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo mikroinjektion og Transplantation teknik for Nasonia vitripennis genom Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

En Optogenetic metode til at styre og analysere gen Expression mønstre i celle-til-celle interaktioner

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene Protein Tagging i menneskelige induceret pluripotente stamceller ved hjælp af CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Intraventrikulær transplantation af konstruerede neuronal prækursorer til in vivo Neuroarchitecture studier

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice

Rensning og Transplantation af Myogenic stamfader celle afledte Exosomes for at forbedre hjertefunktion i Duchenne muskuløs dystrofe mus

Duchene Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked recessive genetic disease caused by a lack of functional dystrophin protein. The disease cannot be cured, ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducerbar, celle Type-specifikke udtryk i Arabidopsis thaliana gennem LhGR-medieret Trans-aktivering

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

Design automatiseret, høj gennemløb, kontinuerlig cellevækst eksperimenter ved hjælp af eVOLVER

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...