Name: primordial germ cell transplantation for crispr/cas9-based leapfrogging in xenopus
Uploaded: 2018-02-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus at JoVE.com

Dit werk werd uitgevoerd met de steun van een subsidie, 5R21HD080684-02, van de National Institute of Child Health en menselijke ontwikkeling. De auteur wil Ken Cho bedanken voor zijn voortdurende enthousiasme en ondersteuning. De auteur wil ook Bruce Blumberg erkennen voor het gebruik van zijn camera, Rebekka Charney, voor de kritische lezing van het manuscript, en Sean McNamara en Marcin Wlizla de nationale Xenopus bron (RRID:SCR_013731), voor de waardevolle gesprekken met betrekking tot X. tropicalis voeding en verzorging van de dieren regimes.

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik van het Comité van de Universiteit van Californië, Irvine.
1. voorbereiding voor PGC transplantatie
<ol><li>Bereiden dissectie hulpmiddelen, als eerder beschreven23. Opmerking: Wenkbrauw haren messen worden gebruikt voor het maken van insnijdingen met de hulp van een haar lus te stabiliseren van het embryo tijdens het uitvoeren van de operaties. Wenkbrauw haren...

<ol>
	<li>Gurdon, J. B., Hopwood, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+introduction+of+Xenopus+laevis+into+developmental+biology:+of+empire,+pregnancy+testing+and+ribosomal+genes.">The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes.</a> Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).</li><li>Hellsten, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+Western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis.">The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Science. 328 (5978), 633-636 (2010).</li><li>Session, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+evolution+in+the+allotetraploid+frog+Xenopus+laevis.">Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis.</a> Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).</li><li>Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biallelic+genome+modification+in+F(0)+Xenopus+tropicalis+embryos+using+the+CRISPR/Cas+system.">Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system.</a> Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).</li><li>Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+and+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+targeted+mutagenesis+in+Xenopus+tropicalis.">Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis.</a> Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+RNA/Cas9-mediated+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis.">Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Development. 141 (3), 707-714 (2014).</li><li>Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+disruption+in+Xenopus+laevis+using+CRISPR/Cas9.">Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9.</a> Cell Biosci. 5, 15 (2015).</li><li>Jaffe, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c21orf59/kurly+Controls+Both+Cilia+Motility+and+Polarization.">c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization.</a> Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+of+genes+involved+in+neural+crest+development+using+the+CRISPR/Cas9+system+in+Xenopus+embryos.">Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos.</a> Cell Biosci. 6, 22 (2016).</li><li>Naert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+mediated+knockout+of+rb1+and+rbl1+leads+to+rapid+and+penetrant+retinoblastoma+development+in+Xenopus+tropicalis.">CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis.</a> Sci Rep. 6 (35264), (2016).</li><li>Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+Xenopus+laevis+F1+albino+J+strain+by+genome+editing+and+oocyte+host-transfer.">Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer.</a> Dev Biol. 426 (2), (2016).</li><li>Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9:+An+inexpensive,+efficient+loss+of+function+tool+to+screen+human+disease+genes+in+Xenopus.">CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus.</a> Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).</li><li>Shigeta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+analysis+of+gene+function+using+CRISPR-Cas9+in+Xenopus+tropicalis+founders.">Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders.</a> Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).</li><li>Hontelez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+transcription+is+controlled+by+maternally+defined+chromatin+state.">Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state.</a> Nat Commun. 6, 10148 (2015).</li><li>Peshkin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+Relationship+of+Protein+and+mRNA+Dynamics+in+Vertebrate+Embryonic+Development.">On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development.</a> Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).</li><li>Owens, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Absolute+RNA+Copy+Numbers+at+High+Temporal+Resolution+Reveals+Transcriptome+Kinetics+in+Development.">Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development.</a> Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).</li><li>Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leapfrogging:+primordial+germ+cell+transplantation+permits+recovery+of+CRISPR/Cas9-induced+mutations+in+essential+genes.">Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes.</a> Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).</li><li>Blackler, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+germ-cells+in+Xenopus+laevis.">Transfer of germ-cells in Xenopus laevis.</a> Nature. 185, 859-860 (1960).</li><li>Blackler, A. W., Fischberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+primordial+germ-cells+in+Xenopus+laevis.">Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis.</a> J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).</li><li>Bounoure, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> L'origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , (1939).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , (1979).</li><li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules.">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+dissection+and+micromanipulation+tools.">Embryo dissection and micromanipulation tools.</a> CSH Protoc. , (2007).</li><li>Nakayama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-based+genome+editing+in+Xenopus+tropicalis.">Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis.</a> Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).</li><li>Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+transgenesis+in+Xenopus+using+I-SceI+meganuclease.">High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , (2000).</li><li>Kay, B. K., Kay, B. K., Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+oocytes+and+embryos.">Injection of oocytes and embryos.</a> Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). , (1991).</li><li>Nieuwkoop, P., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. , (1994).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Res. 42 (22), e168 (2014).</li><li>Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+opposing+homeobox+genes+Goosecoid+and+Vent1/2+self-regulate+Xenopus+patterning.">The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning.</a> EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).</li><li>Bedell, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+using+a+high-efficiency+TALEN+system.">In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system.</a> Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).</li><li>Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotyping+with+CRISPR-Cas-derived+RNA-guided+endonucleases.">Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases.</a> Nat Commun. 5, 3157 (2014).</li><li>Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+human+cells+with+zinc+finger+nucleases+constructed+via+modular+assembly.">Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly.</a> Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).</li><li>Qiu, P., Shandilya, H., D'Alessio, J. M., O'Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutation+detection+using+Surveyor+nuclease.">Mutation detection using Surveyor nuclease.</a> Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).</li><li>Ota, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+identification+of+TALEN-mediated+genome+modifications+using+heteroduplex+mobility+assays.">Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays.</a> Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).</li><li>Dahlem, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Methods+for+Generating+and+Detecting+Locus-+Specific+Mutations+Induced+with+TALENs+in+the+Zebrafish+Genome.">Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome.</a> PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).</li><li>Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genotyping+of+CRISPR/Cas9-mediated+mutants+using+fluorescent+PCR-capillary+gel+electrophoresis.">High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis.</a> Sci Rep. 5, 15587 (2015).</li><li>Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9:+An+inexpensive,+efficient+loss+of+function+tool+to+screen+human+disease+genes+in+Xenopus.">CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus.</a> Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).</li><li>Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR+Based+Protocol+for+Detecting+Indel+Mutations+Induced+by+TALENs+and+CRISPR/Cas9+in+Zebrafish.">A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish.</a> PLoS ONE. 9 (6), e98282 (2014).</li><li>Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+to+assess+gene-editing+frequencies+(GEF-dPCR)+mediated+by+designer+nucleases.">Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases.</a> Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).</li><li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+gene+targeting+and+phenotyping+in+zebrafish+using+CRISPR/Cas9.">High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).</li><li>Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+cancer+drug+targets+by+CRISPR-Cas9+screening+of+protein+domains.">Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains.</a> Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).</li><li>Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elr-type+proteins+protect+Xenopus+Dead+end+mRNA+from+miR-18-mediated+clearance+in+the+soma.">Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).</li><li>Yang, J., Aguero, T., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+maternal-to-zygotic+transition+from+the+perspective+of+the+germline.">The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline.</a> Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).</li></ol>

Dit rapport bevat een gedetailleerd protocol voor de transplantatie van plantaardig weefsel bevattende PGCs. transplantatie van PGCs wordt gebruikt in combinatie met bewerken van genoom technologieën (b.v., CRISPR/Cas9) te wijzigen van de kiemcellen van een dier terwijl behoud van bijna alle van de somatische weefsels als genetisch wild type. Voor sprongen om succesvol te zijn, zijn er een aantal kritische factoren om te overwegen voordat presterende transplantaties wordt uitgevoerd.
<p class="jove_content"...

Hoe genotype codeert fenotype is een grote vraag in de biologie sinds de herontdekking van wetten van Mendel. Inzicht in de rollen van genen, hun regelgeving en interacties binnen gene netwerken, en de functies van gecodeerde producten belooft te bieden hulpprogramma's voor het blootleggen nieuwe biologie en verbetering van ziekte staten. Voor meer dan de helft een eeuw1is de Afrikaanse klauwkikker kikker, Xenopus, een toonaangevende model voor studies over een breed scala aan onderwerpen in de fundamentele biologie en de biogeneeskunde, met inbegrip van de genetische controle van ontwikkeling. Historisch, meeste onderzoek op Xenopus hanteert de allotetraploid kikker, X. laevis, maar meer recentelijk als gevolg van de diploidy, X. tropicalis is ontwikkeld als een amfibie genetische model. Compleet genoom sequenties zijn samengesteld uit beide Xenopus soorten2,3. De "kikker Gemeenschap" is nu op een keerpunt waar fundamentele genoom modificatietechnologie toelaat de studie van de genfunctie, vrijwel op wil. Programmeerbare CRISPR/Cas9 enzym hebben de mutagenese van genen zeer efficiënt, met biallelic mutatie mogelijk in de meeste cellen van de dierlijke4,5,6,7, 8,9,10,11. Deze studies, onderstreept door Bhattacharya et al. 12 en Shigeta et al. 13, hebben aangetoond dat de functie van veel genen door mutagenese in F0 mozaïek dieren kan worden bestudeerd. Deze aanpak heeft vele voordelen; embryo's Cas9-sgRNA-microinjected wordt echter vaak een variabele fenotypen als gevolg van onvolledige verlies van functie (LOF) weergegeven. En wat nog belangrijker is, de generatie van mutant lijnen is zeer voordelig voor sommige toepassingen — in het bijzonder bij de studie van genen die een maternale mRNA-bijdrage hebben. Maternale mRNAs en proteïnen, en hun invloeden op de epigenetica, aanhouden gedurende een langere periode in embryogenese14,15,16, waardoor de vroege ontwikkeling bijdragen van vele genen vuurvaste tot F0 analyses. Andere benaderingen LOF zijn dus vereist.
Bij het zoeken naar mutant lijnen te maken, heeft het pad naar het verkrijgen van de embryo's homozygoot LOF verschillende obstakels. Eerste, efficiënte mutagenese voor de productie van biallelic mutaties kunnen nadelig zijn, omdat het verlies van essentiële gene functies resulteert in falen om te overleven naar seksuele volwassenheid, mengend in de productie van een levensvatbare lijn. Een gemeenschappelijke oplossing is de zorgvuldige titratie van het bedrag van Cas9-sgRNA geleverd. Hier, is het doel om een evenwicht tussen de vermindering van de letaliteit terwijl ook maximaliseren van de efficiëntie van germline mutagenese. Een tweede probleem vloeit voort uit de standaard fokken regeling, waar fenotypische analyses zijn uitgesteld tot de F2 generatie. Met behulp van de standaardbenadering, seksueel volwassen F0 dieren die mutant allelen via de germline zijn outcrossed zenden voor de productie van F1 heterozygoot "vervoerders", die zijn vervolgens uitgegroeid tot seksuele volwassenheid. Twee F1 heterozygoten zijn dan intercrossed om te produceren van F2 mutant embryo's bij een verwachte Mendelian frequentie van 25%. Twee generaties van de fok zijn dus nodig voor de analyse van de mutant fenotypen. Mutant dieren kunnen zijn homozygotes of samengestelde heterozygoten (dat wil zeggen, nakomelingen met twee verschillende allelen voor mutant, die afhangt van de genotypen van de ouderlijke proefdieren in de F-1 -intercross).
Deze obstakels kunnen worden weggenomen door het beperken van programmeerbare nuclease-gemedieerde mutagenese naar germinale cellen, die de basis vormt van een nieuwe methode genaamd sprongsgewijze17. Sprongen bestaat uit twee hoofdonderdelen: (1) de microinjection van de Cas mRNA samen met sgRNA, of nuclease-sgRNA complexen (of, in beginsel, TALENs of zink vinger nucleasen) stadium de eencellige efficiënt mutagenize embryonaal genoom, gevolgd door (2) de transplantatie van PGCs in wildtype broer/zus embryo's, waar de endogene PGCs werden verwijderd. Wanneer beide stappen zijn efficiënte, volledige germline vervanging en de mutant geslachtscellen kunnen worden verkregen. Blackler aangetoond in de vroege jaren 1960 dat Xenopus PGCs kon worden getransplanteerd tussen embryo's op de late neurula en vroege tailbud fasen18,19. Voor sprongen, werd Blackler de aanpak gewijzigd door het uitvoeren van de transplantatiecentra op de blastocyste stadium17, wanneer PGCs zijn gelokaliseerd in de vegetal pool van het embryo20,21. Transplantatie voordat gastrulatie twee belangrijke voordelen heeft. Ten eerste is de engraftment van transplantaties en de verdere ontwikkeling van de normale bleek te zijn efficiënter wanneer de transplantatie wordt uitgevoerd in het stadium van de blastocyste (niet-gepubliceerde opmerkingen). Ten tweede, door blastocyste-fase transplantaties te voeren kort nadat zygotic transcriptie is begonnen, kan men de letaliteit als gevolg van ontwikkelingsstoornissen gen mutaties die gastrulatie of die verstoren anderszins tot misvormde laat neurulae leiden vermijden. PGC transplantatie-bevattende ("overgeslagen") embryo's worden geteeld naar seksuele volwassenheid, en intercrosses tussen deze F0 dieren hebben aangetoond dat, in veel gevallen, 100% van het nageslacht van F1 het fenotype van de LOF (meeste zijnde samengestelde weergeven heterozygoten), met vermelding van de volledige germline vervanging door de gerichte mutaties.
De verwachting is dat de sprongen genetische benaderingen in Xenopuszal versnellen. Sprongen biedt ook een alternatief voor de "overdracht van de ontvangst" methode22 voor de analyse van de LOF van moeders-effect genen (niet-gepubliceerde opmerkingen). In de huidige publicatie, wordt een gedetailleerde beschrijving van de methode, vooral gericht op PGC transplantatie, voorgesteld in X. tropicalis (met kleine wijzigingen voor X. laevis). De transplantatie van PGCs is hier gedemonstreerd om een snellere overdracht van deze technologie aan andere laboratoria die werken met Xenopus. De beginselen van deze methode moeten lukken in andere amfibieën (bijvoorbeeld urodeles) en organisme-specifieke wijzigingen in de methodologie ruimte laten voor toepassing op vele andere dieren waarin efficiënte mutagenese kan worden bereikt en PGCs zijn gemakkelijk transplanteerbaar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20 or 11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyebrow hair knife</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair loop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, borosilicate glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy Glue (Cyanoacrylate-based)</td>
			<td>Elmer&#39;s Products, Inc.</td>
			<td>KG581</td>
			<td>To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligodeoxynucleotides, custom ordered</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Custom ordered</td>
			<td>Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megascript T7 kit</td>
			<td>Ambion/ThermoFisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol, Tris buffered</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High quality distilled phenol from any commercial supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High quality chloroform from any commercial supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High quality ethanol from any commercial supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma Chemical Co.</td>
			<td>D5758-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein, with nuclear localization signal</td>
			<td>PNA Bio, Inc.</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer&#39;s recommendations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Marc&#39;s Modified Ringers solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any Molecular Biology grade agarose is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 X15 mm Petri plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Chemical Co.</td>
			<td>C7352-100G</td>
			<td>Free base, not HCl salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03 115 828 001</td>
			<td>Typically ~20mg/ml from Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sera Micron</td>
			<td>sera</td>
			<td></td>
			<td>Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primordial germ cell transplantation for crispr/cas9-based leapfrogging in xenopus

De oprichting van mutant lijnen door het bewerken van het genoom versnelt genetische analyse in vele organismen. CRISPR/Cas9 methoden zijn aangepast voor gebruik in de Afrikaanse klauwkikker kikker, Xenopus, een langdurige modelorganisme voor biomedisch onderzoek. Traditionele fokken regelingen voor het maken van homozygoot mutant lijnen met CRISPR/Cas9-gerichte mutagenese hebben verschillende tijdrovend en moeizaam stappen. Ter vergemakkelijking van de oprichting van mutant embryo's, met name voor het overwinnen van de obstakels die is gekoppeld aan het uitsparen van genen die essentieel voor embryogenese zijn, ontstond een nieuwe methode genaamd sprongen. Deze techniek maakt gebruik van de robuustheid van Xenopus embryo's "knippen en plakken" embryologische methoden. Sprongen maakt gebruik van de overdracht van primordiaal kiemcellen (PGCs) van efficiënt mutagenized donor embryo's in wildtype PGC-ablated worden broers en zussen. Deze methode zorgt voor de efficiënte mutatie van essentiële genen door het creëren van chimeer dieren met wildtype somatische cellen die een mutant germline dragen. Wanneer twee F0 dieren uitvoering "haasje transplantaties" (dat wil zeggen, mutant geslachtscellen) zijn intercrossed, ze produceren homozygoot of samengestelde heterozygote, null F1 embryo's, waardoor het opslaan van een volledige generatietijd om fenotypische gegevens te verkrijgen. Sprongen biedt ook een nieuwe aanpak voor het analyseren van maternale effect genen, die vuurvaste F0 fenotypische analyse na CRISPR/Cas9 mutagenese. Dit manuscript detailleert de methode van de sprongen, met speciale nadruk op het succesvol uitvoeren van PGC transplantatie.

Na transplantatie, de kwalitatieve bepaling van de efficiëntie van CRISPR/Cas9 mutagenese moet worden uitgevoerd voordat de inspanning in de veehouderij te groeien en te handhaven van de dieren naar seksuele volwassenheid gebruikten. Omdat dieren uitvoering leapfrog transplantaties somatically wildtype zijn en de germline is moeilijk toegankelijk voor directe metingen, wordt opslaan van de karkassen van donor embryo's belangrijker. DNA-analyse van de kadavers dient als een maatstaf voor ...

Watch this Scientific Journal Video about Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus at JoVE.com

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Genen essentieel voor overleving vormen technische hindernissen voor het maken van mutant lijnen. Sprongen omzeilt letaliteit door het combineren van genoom bewerken met primordiale geslachtscellen transplantatie wild-type dieren uitvoering germline mutaties maken. Sprongen maakt ook de efficiënte generatie homozygoot null mutanten in de F1 generatie. Hier, wordt de transplantatie stap aangetoond.

Primordiale geslachtscellen transplantatie voor CRISPR/Cas9 gebaseerde sprongen in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Grootbrengen en Double-stranded RNA-gemedieerde gen knock-down in het verbergen Kever,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Eencellige Gene Expression Profiling Met behulp van FACS en qPCR met interne standaarden

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection en transplantatie techniek voor Nasonia vitripennis genoom manipulatie

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Een Optogenetic methode te controleren en analyseren van gen expressiepatronen in cel-naar-cel interacties

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene eiwit Tagging in mens geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

Intraveneuze triculaire transplantatie van engineered neuronale precursoren voor in vivo Neuroarchitecture studies

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice

Zuivering en transplanteren van Myogenic Progenitor cel afgeleid Exosomes ter verbetering van de hartfunctie bij Duchenne Muscular Dystrofe muizen

Duchene Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked recessive genetic disease caused by a lack of functional dystrophin protein. The disease cannot be cured, ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

Afleidbare, cel Type-specifieke uiting in Arabidopsis thaliana via LhGR-gemedieerde Trans-activering

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

Het ontwerpen van geautomatiseerde, high-throughput, continue celgroei experimenten met behulp van evolver

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...