Name: primordial germ cell transplantation for crispr/cas9-based leapfrogging in xenopus
Uploaded: 2018-02-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus at JoVE.com

Ce travail a été réalisé avec le soutien d’une subvention, 5R21HD080684-02, de l’Institut National de santé de l’enfant et le développement humain. L’auteur tient à remercier Ken Cho pour son enthousiasme et le soutien continus. L’auteur tiens également à remercier Bruce Blumberg utilisation de sa caméra, Rébecca Charney, à la lecture critique du manuscrit et Sean McNamara et Marcin Wlizla à la ressource nationale de Xenopus (RRID:SCR_013731), pour le précieux conversations au sujet de X. tropicalis d’alimentation et de régimes de protection des animaux.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité de l’urbanisme de l’Université de Californie, Irvine et d’institutionnels animalier.
1. les préparations destinés à la Transplantation de PGC
<ol><li>Préparer des outils de dissection à l’avance, comme décrit précédemment23. NOTE : Couteaux de cheveux sourcil servent à faire des incisions avec l’aide d’une boucle de cheveux pour stabiliser l’embryon tout en effectuant le...

<ol>
	<li>Gurdon, J. B., Hopwood, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+introduction+of+Xenopus+laevis+into+developmental+biology:+of+empire,+pregnancy+testing+and+ribosomal+genes.">The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes.</a> Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).</li><li>Hellsten, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+Western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis.">The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Science. 328 (5978), 633-636 (2010).</li><li>Session, A. 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Ce rapport fournit un protocole détaillé pour la transplantation de tissu végétal contenant PGC. Transplantation de PGC est utilisé en conjonction avec les technologies de modification du génome (p. ex., CRISPR/Cas9) pour modifier les cellules germinales d’un animal tout en maintien de la quasi-totalité de ses tissus somatiques comme génétiquement le type sauvage. Pour brûler les étapes pour réussir, il y a un certain nombre de facteurs critiques à considérer avant d’effectuer des transplantati...

Comment le génotype encode phénotype a été une question majeure en biologie depuis la redécouverte des lois de Mendel. Comprendre les rôles des gènes, leur régulation et interactions au sein des réseaux de gènes et les fonctions des promesses de produits codés de fournir des outils pour découvrir nouvelle biologie et amélioration des états pathologiques. Pour plus d’un demi siècle1, l’africaine Xenopus laevis, Xenopus, a été un modèle pour les études sur un large éventail de sujets en biologie fondamentale et de la biomédecine, y compris le contrôle génétique du développement. Historiquement, la plupart des recherches sur Xenopus a utilisé la grenouille allotétraploïde, X. laevis, mais plus récemment, en raison de la diploïdie, X. tropicalis a été conçu comme un modèle génétique amphibie. Séquences de génomes complets ont été assemblés entre les deux espèces de Xenopus 2,3. La « communauté de la grenouille » est maintenant à un moment charnière où la technologie de modification du génome de base permet l’étude de la fonction des gènes, pratiquement à volonté. Programmable CRISPR/Cas9 endonucléases ont fait la mutagénèse de gènes très efficace, avec mutations bialléliques possible dans la plupart des cellules de l’animal4,5,6,7, 8,9,10,11. Ces études, mise en évidence par Blais et al. 12 et Shigeta et al. 13, ont montré que la fonction de plusieurs gènes peut être étudiée par mutagenèse chez les animaux de mosaïque de0 F. Cette approche présente de nombreux avantages ; Cependant, embryons Cas9-sgRNA-micro affichent souvent des phénotypes variables en raison de la perte incomplète de la fonction (LOF). Plus important encore, la génération des lignées mutantes est très avantageuse pour certaines applications, en particulier lorsque l'on étudie les gènes qui ont une contribution d’ARNm maternels. ARNm maternels et protéines et leurs influences sur l’épigénétique, persistent pendant une longue période dans l’embryogenèse14,15,16, rendant les contributions du développement précoces de plusieurs gènes réfractaire aux analyses de0 F. Par conséquent, les autres approches LOF sont nécessaires.
Lorsqu’on cherche à créer des lignées mutantes, le chemin d’accès à l’obtention d’embryons homozygotes de LOF a plusieurs obstacles. Mutagenèse tout d’abord, efficace pour produire des mutations bialléliques peut être désavantageux car perte des fonctions des gènes essentiels se traduit par l’incapacité à survivre à la maturité sexuelle, interférant avec la production d’une ligne viable. Une solution commune est le titrage minutieux d’un montant de Cas9-sgRNA envoyée. Ici, l’objectif est d’atteindre un équilibre entre réduction de létalité tout en optimisant également l’efficacité de la lignée germinale mutagenèse. Un autre problème se pose du schéma standard d’élevage, où les analyses phénotypiques sont différés jusqu'à la génération de2 F. À l’aide de l’approche standard, sexuellement matures animaux de0 F qui transmettent mutant allèles par le biais de la lignée germinale sont croisées pour produire des F1 hétérozygote « entreprises », qui sont ensuite cultivées à la maturité sexuelle. Deux hétérozygotes de1 F sont ensuite intercroisées pour produire des embryons mutants, F2 à une fréquence mendélienne prévue de 25 %. Ainsi, deux générations d’élevage sont nécessaires pour l’analyse des phénotypes mutants. Animaux mutants pourrait être homozygotes ou hétérozygotes (c.-à-d. descendants contenant deux allèles mutants différents, qui dépend des génotypes des parents animaux utilisés dans la population de1 F).
Ces obstacles peuvent être surmontés en limitant programmable mutagenèse induite par la nucléase de cellules germinales, qui sous-tend une nouvelle méthode appelée former17. Saute-mouton possède deux composantes principales : (1) la microinjection des ARNm de Cas ainsi que sgRNA ou nucléase-sgRNA complexes (ou, en principe, TALENs ou zinc nucléases de doigt) au stade unicellulaire de mutagenize efficacement les génomes embryonnaires, suivie (2) la transplantation de PGC dans des embryons de frère de type sauvage, où le PGC endogènes ont été supprimés. Quand les deux étapes sont le remplacement de germline efficace, complète avec les cellules germinales mutantes peut être obtenue. Blackler démontré dans les années 1960 que Xenopus PGC pourrait être transplanté entre embryons à la neurula fin et18,de stades précoces tailbud19. Pour brûler les étapes, l’approche de Blackler modification en effectuant les transplantations d’organes au stade blastula17, lorsque PGC est localisées dans le pôle végétal de l’embryon20,21. Transplantation avant la gastrulation a deux principaux avantages. Tout d’abord, la prise de greffe des greffes et le développement subséquent de normal s’est avéré plus efficace lorsque la greffe est réalisée au stade blastula (inédites). Deuxièmement, en effectuant des transplantations d’organes stade blastula peu après que transcription zygotique a commencé, on peut éviter la létalité découlant du développement génétique mutations qui perturbent la gastrulation, ou qui autrement mener à neurula fin malformé. PGC transplantation portant les embryons (« leapfrogged ») sont cultivés à la maturité sexuelle, et les croisements entre ces animaux de0 F ont démontré que, dans bien des cas, 100 % de la progéniture de1 F afficher le phénotype LOF (la plupart étant composé hétérozygotes), indiquant la lignée germinale complète de remplacement avec les mutations ciblées.
Il est prévu que Bond s’accélérera les approches génétiques chez Xenopus. Brûler les étapes prévoit également une alternative à la méthode de « transfert d’accueil »22 pour l’analyse LOF des gènes effet maternel (inédites). Dans la présente publication, une description détaillée de la méthode, en focalisant sur la transplantation de PGC, est présentée dans X. tropicalis (avec des modifications mineures pour X. laevis). La transplantation du PGC est démontrée ici, pour faciliter un transfert plus rapid de cette technologie à d’autres laboratoires qui travaillent avec Xenopus. Les principes de cette méthode doivent être réussies chez les autres amphibiens (p. ex., urodèles), et modifications de l’organisme-spécifiques dans la méthodologie devraient permettre pour application à de nombreux autres animaux dont mutagénèse efficace peut être accompli et PGC est facilement transplantables.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20 or 11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyebrow hair knife</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair loop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, borosilicate glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy Glue (Cyanoacrylate-based)</td>
			<td>Elmer&#39;s Products, Inc.</td>
			<td>KG581</td>
			<td>To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligodeoxynucleotides, custom ordered</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Custom ordered</td>
			<td>Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megascript T7 kit</td>
			<td>Ambion/ThermoFisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol, Tris buffered</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High quality distilled phenol from any commercial supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High quality chloroform from any commercial supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High quality ethanol from any commercial supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma Chemical Co.</td>
			<td>D5758-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein, with nuclear localization signal</td>
			<td>PNA Bio, Inc.</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer&#39;s recommendations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Marc&#39;s Modified Ringers solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any Molecular Biology grade agarose is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 X15 mm Petri plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Chemical Co.</td>
			<td>C7352-100G</td>
			<td>Free base, not HCl salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03 115 828 001</td>
			<td>Typically ~20mg/ml from Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sera Micron</td>
			<td>sera</td>
			<td></td>
			<td>Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primordial germ cell transplantation for crispr/cas9-based leapfrogging in xenopus

La création de lignées mutantes en éditant de génome s’accélère l’analyse génétique chez de nombreux organismes. Méthodes CRISPR/Cas9 ont été adaptés à l’africaine Xenopus laevis, Xenopus, un organisme modèle de longue date pour la recherche biomédicale. Régimes de reproduction traditionnelle pour la création de lignées mutantes homozygotes avec mutagénèse CRISPR/Cas9-ciblés ont plusieurs étapes longues et laborieuses. Pour faciliter la création d’embryons mutants, notamment pour surmonter les obstacles associés à assommer les gènes qui sont essentiels pour l’embryogénèse, une nouvelle méthode appelée Bond a été développée. Cette technique s’appuie sur la robustesse des embryons de Xenopus à « copier / coller » méthodes embryologiques. Saute-mouton utilise le transfert de cellules germinales primordiales (PGC) provenant d’embryons de donneurs efficacement-mutagénisées tant en frères et sœurs PGC-ablation de type sauvage. Cette méthode permet une mutation efficace de gènes essentiels en créant des animaux chimériques avec cellules somatiques de type sauvage qui transportent un mutant germline. Lorsque deux animaux de0 F porteurs « leapfrog greffes » (c'est-à-dire, les cellules germinales mutant) sont intercroisées, ils produisent des homozygotes, ou hétérozygotes, null F1 embryons, sauvant ainsi un temps de génération complet pour obtenir des données phénotypiques. Saute-mouton fournit également une nouvelle approche pour l’analyse des gènes effet maternel qui sont réfractaires à l’analyse phénotypique0 F suite CRISPR/Cas9 mutagenèse. Ce manuscrit détaille la méthode de brûler les étapes, avec un accent particulier sur la façon de réaliser avec succès la transplantation du PGC.

Après la transplantation, la détermination qualitative de l’efficacité de la mutagénèse CRISPR/Cas9 doit être effectuée avant de dépenser de l’effort dans l’élevage pour développer et maintenir les animaux à la maturité sexuelle. Parce que les animaux porteurs de leapfrog greffes est somatiquement type sauvage et la lignée germinale est difficile d’accès pour des mesures directes, il devient important de sauver les carcasses d’embryons de donneurs. Analyse de l’A...

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Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Gènes essentiels à la survie posent des obstacles techniques pour créer des lignées mutantes. Saute-mouton contourne la létalité en combinant génome édition avec la transplantation de cellules germinales primordiales pour créer des animaux sauvage porteurs de mutations germinales. Brûler les étapes permet également la génération efficace des homozygotes mutants null dans la génération de1 F. Ici, l’étape de la transplantation est démontrée.

Transplantation de cellules germinales primordiales pour base CRISPR/Cas9 saute-mouton chez Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

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