Name: primordial germ cell transplantation for crispr/cas9-based leapfrogging in xenopus
Uploaded: 2018-02-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus at JoVE.com

이 작품은 보조금의 지원으로 수행 되었다 5R21HD080684-02, 아동 건강의 국가 학회 및 인간 발달에서. 저자 켄 조 그의 지속적인 열정과 지원에 대 한 감사를 기원 합니다. 저자 또한 싶습니다 원고, 숀 맥 나 마라와 국가 Xenopus 자원 (RRID:SCR_013731)에 마 Wlizla의 중요 한 독서에 대 한 그의 카메라, 리브가 Charney의 사용에 대 한 브루스 블 룸 베르크를 인정 하는 가치에 대 한 X. tropicalis 수 유 및 동물 관리 식이요법에 관한 대화.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용, Irvine가 주 대학의 위원회에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. PGC 식 위한 준비
<ol><li>앞에서 설명한23으로 해 부 도구를 사전에 준비 합니다. 참고: 눈 썹 머리 칼 수술을 수행 하는 동안 태아를 안정 시키기 위해 머리 루프의 도움으로 절 개를 만드는 데 사용 됩니다. 눈 썹 머리와 머리 루프 붕 규 산 ?...

<ol>
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이 보고서에서는 PGCs. 이식의 PGCs를 포함 하는 식물 조직의 이식에 대 한 상세한 프로토콜을 수정 하는 생식을 게놈 편집 기술 (예: CRISPR/Cas9)와 함께에서 사용 하면서 동물의 거의 모든 그것의 체세포 조직 유전자 야생 유형으로 유지. 성공 하려면 leapfrogging 위해 수행 간이식을 수행 하기 전에 고려해 야 할 중요 한 요인의 수가 있다.
돌연변이 체 대립 유전자와는 생식의...

어떻게 유전자 표현 형 인코딩합니다 Mendel의 법률의 재발견 이후 생물학에서 주요 질문 되었습니다. 인코딩된 제품 약속 잠복 새로운 생물학 및 장황 질병 상태에 대 한 도구를 제공 하기의 기능과 유전자, 그들의 규칙 및 유전자 네트워크 내에서 상호 작용의 역할의 이해. 절반 이상이 세기1, 아프리카 발톱된 개구리, Xenopus, 기초 생물학 및 의학, 발달의 유전 통제를 포함 하 여 다양 한 주제에 대 한 연구에 대 한 선도 모델을 하고있다. 역사적으로, Xenopus 에 대부분의 연구는 allotetraploid 개구리, X. laevis, 사용 하지만 더 최근에, 그것의 diploidy 인 X. tropicalis 개발 되었습니다 양서류 유전자 모델. 완전 한 게놈 시퀀스 두 Xenopus 종2,3에서 조립 되어 있다. "개구리 커뮤니티"입니다 지금 전환점에 어디 기본 게놈 수정 기술 허용 유전자 기능 연구 거의 것입니다. 프로그래밍 가능 CRISPR/Cas9 endonucleases 유전자의 mutagenesis를 biallelic 돌연변이 가능한 대부분의 세포에서 동물4,,56,7의 고효율 만들었습니다. 8,9,,1011. Bhattacharya 외 하 여 강조 하는 이러한 연구 12 및 Shigeta 외. 13, 많은 유전자의 기능 mutagenesis F0 모자이크 동물에 의해 공부 될 수 있다 나타났습니다. 이 접근에는 많은 이점이; 그러나, Cas9-sgRNA-microinjected 배아 종종 기능 (LOF)의 불완전 한 손실로 인해 가변 고기를 표시합니다. 더 크게, 돌연변이 라인의 세대는 매우 일부 응용 프로그램에 대 한 유리한-특히 모성 mRNA 기여 있는 유전자를 공부를 할 때. 모성 mRNAs 및 단백질, 그리고 epigenetics에 그들의 영향 embryogenesis14,,1516, 많은 유전자의 초기 발달 기여를 렌더링으로 오랜된 기간 동안 유지 F0 분석에의 내 화 따라서, 다른 LOF 방법이 제시해 주셔야 합니다.
돌연변이 체 라인을 만들 경우, 경로 homozygous LOF 배아를 얻는 몇 가지 장애물 있다. 첫째, 효율적인 mutagenesis biallelic 돌연변이 생산 하는 필수 유전자 기능의 손실이 가능한 라인의 생산을 방해 하는 성적 성숙에 살아남기 위해 실패에서 하기 때문에 불리 한 될 수 있습니다. 일반적인 솔루션은 Cas9-sgRNA 전달 금액의 주의 적정. 여기, 목표는 또한 생식 mutagenesis 효율성을 극대화 하면서 치 사 율 감소 사이의 균형을 달성 하는. 두 번째 문제 표준 사육 체계에서 발생 하는 phenotypic 분석 F2 세대까지 지연 됩니다. 표준 방식을 사용 하 여, 성적 돌연변이 체 대립 유전자는 생식을 통해 F1 heterozygous "캐리어", 성적 성숙 성장 다음 생산 outcrossed는 전송 하는 F0 동물 성숙. 2 F1 heterozygotes는 다음 25%의 예상된 Mendelian 주파수에서 F2 돌연변이 배아를 생산 하기 위해 intercrossed. 따라서, 번 식의 2 세대 돌연변이 고기의 분석을 위해 필요 하다. 돌연변이 동물 homozygotes 또는 복합 heterozygotes (즉, 자손 포함 하는 두 개의 다른 돌연변이 체 대립 유전자 F1 intercross에서 사용 하는 부모의 동물의 genotypes에 달려 있는) 수 있습니다.
프로그래밍 가능한 nuclease 중재 mutagenesis 세균 세포에 기초가 넘기17라는 새 메서드를 제한 하 여 이러한 장애물을 극복할 수 있습니다. 두 가지 주요 구성 요소는 leapfrogging: Cas mRNA sgRNA, 또는 nuclease sgRNA 단지 (또는, 원리, TALENs 또는 아연 손가락 nucleases)의 (1) microinjection 단일 셀 단계에서 효율적으로 배아 유전자 mutagenize를, 다음 (2) PGCs의 생 PGCs 제거 되었습니다 wildtype 형제 배아로 이식. 두 단계는 돌연변이 세균 세포로 효율적이 고 완전 한 생식 보충 때 얻어질 수 있다. Blackler 1960 년대 Xenopus PGCs 늦은 neurula에서 배아 초기 tailbud 단계18,19사이 이식 될 수 있는 시연. Leapfrogging, Blackler의 접근 PGCs 태아20,21의 식물성 극에 지역화는 blastula 단계17, 간이식을 수행 하 여 수정 되었습니다. Gastrulation 전에 이식 두 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, 이식 및 후속 표준 개발의 engraftment 이식 blastula 단계 (관찰 되지 않은)에서 수행 하는 경우 더 효율적으로 발견 되었다. 둘째, zygotic 녹음 방송 시작 직후 blastula 단계 간이식을 수행, 하나 치 발달 유전자 변이 gastrulation 또는 그 방해를 그렇지 않으면 잘못 된 늦은 neurulae 이어질에서 발생을 피할 수 있다. PGC 이식-베어링 ("사간") 배아는 성적 성숙, 성장 및 이러한 F0 동물 사이 intercrosses는, 많은 경우에, F1 자손의 100% (대부분 되 고 복합 LOF 형 표시 증명 heterozygotes), 대상된 돌연변이와 완전 한 생식 교체를 나타내는.
그것 leapfrogging Xenopus에 유전 접근을 가속화 될 것으로 예상 된다. 또한 임산부 효력 유전자 (게시 되지 않은 관찰) LOF 분석에 대 한 "호스트 전송" 방법22 에 대 한 대안을 제공 leapfrogging. 현재 발행물에서 PGC 이식에 초점 특히 방법에 대 한 자세한 설명을 제공 됩니다 X. tropicalis 에서 ( X. laevis에 대 한 작은 수정). Xenopus작업 다른 실험실에 더 빠른이 기술 이전을 촉진 하기 위하여 여기 PGCs의 식은 설명 했다. 이 방법의 원리 (예: urodeles), 다른 양서류에 성공 해야 하 고 방법론에서 유기 체 관련 수정 효율적인 mutagenesis 달성 될 수 있는 다른 많은 동물을 응용 프로그램에 대 한 허용 해야 하 고 PGCs는 쉽게 transplantable.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20 or 11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eyebrow hair knife</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair loop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes, borosilicate glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krazy Glue (Cyanoacrylate-based)</td>
			<td>Elmer&#39;s Products, Inc.</td>
			<td>KG581</td>
			<td>To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligodeoxynucleotides, custom ordered</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Custom ordered</td>
			<td>Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megascript T7 kit</td>
			<td>Ambion/ThermoFisher</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol, Tris buffered</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High quality distilled phenol from any commercial supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High quality chloroform from any commercial supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>High quality ethanol from any commercial supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylpyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td>Sigma Chemical Co.</td>
			<td>D5758-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 protein, with nuclear localization signal</td>
			<td>PNA Bio, Inc.</td>
			<td>CP01</td>
			<td>Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer&#39;s recommendations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Marc&#39;s Modified Ringers solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any Molecular Biology grade agarose is sufficient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 X15 mm Petri plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>3047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma Chemical Co.</td>
			<td>C7352-100G</td>
			<td>Free base, not HCl salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>03 115 828 001</td>
			<td>Typically ~20mg/ml from Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sera Micron</td>
			<td>sera</td>
			<td></td>
			<td>Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primordial germ cell transplantation for crispr/cas9-based leapfrogging in xenopus

편집 하는 게놈 돌연변이 라인의 창조 많은 유기 체에서 유전자 분석을 가속. CRISPR/Cas9 메서드가 아프리카 발톱된 개구리, Xenopus, 생물 의학 연구에 대 한 오랜 모델 유기 체에서에서 사용 하기 위해 적응 되었습니다. CRISPR/Cas9-타겟 mutagenesis와 homozygous 돌연변이 라인을 만들기 위한 전통적인 번 식 계획 몇 가지 어렵고 힘 드는 단계 있다. 특히 노크 embryogenesis에 필수적인 유전자와 관련 된 장애를 극복 하기 위해 돌연변이 배아의 생성을 촉진 하기 위하여 leapfrogging 이라는 새로운 방법을 개발 되었다. 이 기술을 활용 하 여 "잘라내기 및 붙여넣기" Xenopus 배아의 견고성 embryological 방법. Leapfrogging PGC 연기나 wildtype 형제에 효율적으로 mutagenized 기증자 배아에서 원시 생식 세포 (PGCs)의 전송을 사용합니다. 이 메서드는 공상 동물 wildtype 체세포 돌연변이 생식을가지고 작성 하 여 필수적인 유전자의 효율적인 돌연변이 대 한 수 있습니다. 때 두 F0 동물 운반 "도약 이식" (즉, 돌연변이 세균 세포)는 intercrossed, 그들은 생산 homozygous, 또는 복합 heterozygous, null F1 배아, phenotypic 데이터를 얻기 위해 전체 생성 시간 절약. F0 phenotypic 분석 CRISPR/Cas9 mutagenesis 다음 내 화물은 임산부 효력 유전자 분석을 위한 새로운 접근 방법을 제공 합니다 또한 leapfrogging. 이 원고 leapfrogging PGC 이식 성공적으로 수행 하는 방법에 대 한 특별 한 강조와 함께 하는 방법을 자세히 설명 합니다.

이식, 다음 CRISPR/Cas9 mutagenesis의 효능의 질적 결정 축산 성장과 성적 성숙 동물 유지에 노력을 소비 하기 전에 수행 되어야 합니다. 때문에 들고 토끼 뜀 이식 동물 somatically wildtype는 생식은 직접 측정을 위한 접근 하기 어려운, 기증자 태아의 시체를 저장 중요 해 집니다. 시체에서 DNA 분석 이식된 생식17에서 발생 하는 mutagenesis의 범위에 대 한 프록시 역할...

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Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

생존을 위해 필수적인 유전자 돌연변이 라인을 만들기 위한 기술 장애물 포즈. Leapfrogging 게놈 야생-타입 동물 생식 변이 들고 만드는 원시 생식 세포 이식으로 편집을 결합 하 여 치 사 율 circumvents. Leapfrogging 또한 F1 세대에서 null homozygous 돌연변이의 효율적인 생성을 허용합니다. 여기, 이식 단계는 보여 줍니다.

Xenopus 에 Leapfrogging CRISPR/Cas9-기반에 대 한 원시 생식 세포 이식

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

양육 및 숨기기 비틀에 RNA 매개 유전자 최저를 두 번 좌초,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

연구

유전학

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

내부 기준에 FACS 및 qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현 프로파일 링

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

인간에서 태그 생 단백질 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies

생체 내 신경 아키텍처 연구를 위한 엔지니어링된 신경 전구체의 내 측 통 이식

Gene control of neuronal cytoarchitecture is currently the subject of intensive investigation. Described here is a simple method developed to study in ...

Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice

정화와 조직적 조상 세포의 이식 파생 듀 켄 씨 근 Dystrophic 쥐에서 심장 기능을 개선 하기 위해 Exosomes

Duchene Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked recessive genetic disease caused by a lack of functional dystrophin protein. The disease cannot be cured, ...

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

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유도할 수 있는, 애기 thaliana 통해 LhGR 중재 트랜스에 셀 형식 관련 식-활성화

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

에 버 버를 사용 하 여 자동화 된 고 처리량, 지속적인 세포 성장 실험 설계

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...