Name: using in vivo and tissue and cell explant approaches to study the morphogenesis and pathogenesis of the embryonic and perinatal aorta
Uploaded: 2017-09-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta at JoVE.com

Agradecemos a Dean Li para a partilha de protocolo do seu laboratório para isolamento de SMC da aorta. Apoio financeiro foi fornecido pelo National Institutes of Health (R21NS088854, R01HL125815 e R01HL133016 para D.M.G), a American Heart Association (14GRNT19990019 brasileira de D.M.G.) e Universidade de Yale (Brown-Coxe Fellowship para A.M. e inicialização fundos para D.M.G.).

todos os protocolos do mouse são aprovados pelo Comité de uso na Universidade de Yale e institucional Cuidado Animal.
 1. Clonal análise e mapeamento de destino embrionário In Vivo Nota: nós usamos essas abordagens amplamente para avaliar as origens das células e sua arquitetura clonal em modelos de desenvolvimento e doença 7 , 8 , 9 , <sup cla...

<ol>
	<li>Shankman, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KLF4-dependent+phenotypic+modulation+of+smooth+muscle+cells+has+a+key+role+in+atherosclerotic+plaque+pathogenesis.">KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis.</a> Nat Med. 21, 628-637 (2015).</li><li>Rowe, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+smooth+muscle+cell+apoptosis+in+aneurysmal,+occlusive,+and+normal+human+aortas.">Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas.</a> J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).</li><li>Rodella, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abdominal+aortic+aneurysm+and+histological,+clinical,+radiological+correlation.">Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation.</a> Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).</li><li>Lewandoski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+control+of+gene+expression+in+the+mouse.">Conditional control of gene expression in the mouse.</a> Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).</li><li>Lakso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+oncogene+activation+by+site-specific+recombination+in+transgenic+mice.">Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).</li><li>Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+site-specific+recombination+in+mammalian+cells+using+a+ligand-dependent+chimeric+Cre+recombinase.">Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).</li><li>Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+developing+artery+muscularization+in+pulmonary+hypertension.">Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension.</a> Cell Rep. 6, 809-817 (2014).</li><li>Greif, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+construction+of+an+arterial+wall.">Radial construction of an arterial wall.</a> Dev Cell. 23, 482-493 (2012).</li><li>Misra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+beta3+inhibition+is+a+therapeutic+strategy+for+supravalvular+aortic+stenosis.">Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis.</a> J Exp Med. 213, 451-463 (2016).</li><li>Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smooth+muscle+cell+progenitors+are+primed+to+muscularize+in+pulmonary+hypertension.">Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension.</a> Sci Transl Med. 7, (2015).</li><li>Wirth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G12-G13-LARG-mediated+signaling+in+vascular+smooth+muscle+is+required+for+salt-induced+hypertension.">G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension.</a> Nat Med. 14, 64-68 (2008).</li><li>Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+temporally-controlled+targeted+mutagenesis+in+smooth+muscle+cells+of+the+adult+mouse.">Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse.</a> Genesis. 47, 14-18 (2009).</li><li>Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+noninvasive+genetic/pharmacologic+strategy+for+visualizing+cell+morphology+and+clonal+relationships+in+the+mouse.">A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse.</a> J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).</li><li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells.">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143, 134-144 (2010).</li><li>Kumar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cells.+Defining+a+mesenchymal+progenitor+niche+at+single-cell+resolution.">Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution.</a> Science. 346, 1258810 (2014).</li><li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Dev Biol. 1, 4 (2001).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Li, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+is+an+essential+determinant+of+arterial+morphogenesis.">Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis.</a> Nature. 393, 276-280 (1998).</li><li>Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smooth+muscle+myosin+heavy+chain+exclusively+marks+the+smooth+muscle+lineage+during+mouse+embryogenesis.">Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis.</a> Circ Res. 75, 803-812 (1994).</li><li>Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+elastin+gene+is+disrupted+by+a+translocation+associated+with+supravalvular+aortic+stenosis.">The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis.</a> Cell. 73, 159-168 (1993).</li><li>Li, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+arterial+pathology+in+mice+and+humans+hemizygous+for+elastin.">Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin.</a> J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).</li><li>Li, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin+point+mutations+cause+an+obstructive+vascular+disease,+supravalvular+aortic+stenosis.">Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis.</a> Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).</li><li>Pober, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Williams-Beuren+syndrome.">Williams-Beuren syndrome.</a> N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).</li><li>Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+treatment+of+cardiovascular+disease+in+Williams-Beuren+syndrome.">Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome.</a> J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).</li><li>Holtwick, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smooth+muscle-selective+deletion+of+guanylyl+cyclase-A+prevents+the+acute+but+not+chronic+effects+of+ANP+on+blood+pressure.">Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).</li><li>Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRP:+role+in+vascular+wall+integrity+and+protection+from+atherosclerosis.">LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis.</a> Science. 300, 329-332 (2003).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+an+adult+smooth+muscle+cell-targeted+Cre+recombinase+mouse+model.">Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).</li><li>Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+bacterial+artificial+chromosome+transgenic+mice+expressing+mCherry+fluorescent+protein+substituted+for+the+murine+smooth+muscle+alpha-actin+gene.">Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene.</a> Genesis. 48, 457-463 (2010).</li><li>Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+reporter+gene+transgenic+mouse+demonstrates+heterogeneity+in+hepatic+fibrogenic+cell+populations.">A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations.</a> Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).</li><li>Yokota, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+lacks+a+transplantable+progenitor+for+smooth+muscle+type+alpha-actin-expressing+cells.">Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells.</a> Stem Cells. 24, 13-22 (2006).</li></ol>

Em contraste com as extensas investigações de murino aorta e seus ramos principais em adultos condições patológicas, tais como modelos de aterosclerose, menos é conhecido sobre a morfogênese e a patogênese da aorta embrionária e perinatal. Aqui, nós centrar-se na aorta embrionárias/perinatal, especificamente as SMCs e fornecer protocolos para estudar a aorta através na vivo, explante de tecido, e isolamento de SMC se aproxima. Essas abordagens complementares fornecem o investigador com diversas abord...

Os sistemas circulatórios de função de organismos multicelulares para fornecer nutrientes e oxigênio para as células que são não em contato com o ambiente externo e para remover resíduos de produtos e de dióxido de carbono dessas células. Nos vertebrados, o sistema circulatório principal consiste no coração, que bombeia sangue através de uma série de vasos sanguíneos. As paredes dos vasos sanguíneos grandes, tais como as artérias e veias, consistem em três camadas: eu) a íntima, ou camada interna de células endoteliais; II) a mídia, ou camada média de alternância circunferencialmente alongadas células musculares lisas SMCs e lamelas elásticas; e iii) a adventícia, ou camada externa de tecido conjuntivo e fibroblastos. A grande maioria dos estudos em foco de biologia vascular em células endoteliais, investigando a formação de novos tubos de endoteliais célula-alinhado a angiogênese. Em comparação, a SMCs recebem relativamente pouca atenção. No entanto, SMCs são um tipo de célula fundamental na construção da parede arterial normal e em patologias vasculares.
A aorta é a artéria de maior calibre do corpo, recebendo o débito cardíaco do ventrículo esquerdo do coração. Ele está aflito por diversas doenças humanas, incluindo a arteriosclerose, aneurisma e dissecação. Em organismos adultos, a aorta e seus ramos principais são intensamente estudados modelos de doença vascular. Por exemplo, alta dieta gorda alimentou ratos que são nulos para o gene que codifica o receptor da lipoproteína de baixa densidade ou apolipoproteína E, desenvolver aterosclerose, e estudos de mapeamento de destino recentes indicam que SMCs pré-existentes dão origem a vários tipos de células no placa aterosclerótica1. Em aneurismas da aorta, as alterações patológicas incluem SMC apoptose e remodelação de2,3da matriz extracelular.
Substancialmente menos é conhecido sobre a morfogênese SMC e patogênese durante os períodos embrionários e perinatais. Aqui, nós fornecemos protocolos para o estudo embrionário e perinatal da aorta SMCs na vivo, em explantes de tecidos e de células isoladas. Por exemplo, a primeira seção do protocolo delineia destino mapeamento e análise clonal em camundongos embrionários. CRE recombinase expressado sob o controle de um promotor específico células facilita a marcação de células específicas e sua progênie4,5,6; no entanto, controle temporal de células específicas de rotulagem pode ser desafiador durante o desenvolvimento embrionário em camundongos. Neste contexto, com embriões expressando a CreER condicional sob um promotor ativo em SMCs (e.g.,Myh11 ou Acta2) e uma repórter de Cre, nós fornecemos métodos de injeção de tamoxifen ou seu metabólito ativo 4-OH-tamoxifeno em barragens de grávida e para analisar as pilhas etiquetadas em embriões ou prole pós-natal. Além disso, em contraste com os estudos de mapeamento de destino, que predominantemente utilizam Cre repórteres com um único repórter fluoróforo1,7, análise clonal é substancialmente reforçada com repórteres de multi cores Cre.
As segunda e terceiros seções do protocolo descrevem métodos para isolamento e cultivo embrionários explantes da aorta e da aorta SMCs de neonatos, respectivamente. Essas abordagens permitem a manipulação das vias de sinalização, especificamente em explantes aórtica ou SMCs e para analisar os efeitos diretos dos agentes farmacológicos. Assim, o papel de genes específicos no tecido de interesse pode ser projectado de forma muito mais rápida do que através de manipulações genéticas tradicionais em camundongos. Além disso, os estudos isolados de SMC facilitam a análise de migração celular e a adesão, que são tecnicamente limitado em vivo.
Finalmente, a quarta seção do protocolo delineia a colocação de uma bomba mini osmótica subcutânea carregada com agentes farmacológicos em camundongos grávidos (ou não-grávidas). Esse método facilita a análise dos efeitos sobre o desenvolvimento embrionário, causado por agentes que requerem infusão contínua por causa do metabolismo rápido. A alternativa de injeções frequentes não é prática para muitos agentes e deve ser evitada, como pode causar desconforto significativo na barragem grávida.

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	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Tamoxifen</td>
			<td style="width:216px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">T5648</td>
			<td style="width:412px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Corn oil</td>
			<td style="width:216px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">C-8267</td>
			<td>Vehicle for tamoxifen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">4-OH-tamoxifen</td>
			<td style="width:216px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">H7904</td>
			<td>Active metabolite of tamoxifen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Progesterone</td>
			<td style="width:216px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P8783-5G</td>
			<td>Use at half the concentration of tamoxifen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">OCT compound</td>
			<td style="width:216px;">Sakura tissue tek</td>
			<td style="width:111px;">4583</td>
			<td>For making cryoblocks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Cryomolds</td>
			<td style="width:216px;">Polysciences inc</td>
			<td style="width:111px;">18986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">DAPI</td>
			<td style="width:216px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">D9542</td>
			<td>IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>IHC staining of SMA, final dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Anti-CD31 antibody</td>
			<td style="width:216px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:111px;">550274</td>
			<td>IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Anti-GFP antibody</td>
			<td style="width:216px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">A-11121</td>
			<td>IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647</td>
			<td style="width:216px;">Life Technologies</td>
			<td>a21244</td>
			<td>IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488</td>
			<td style="width:216px;">Life Technologies</td>
			<td>a11008</td>
			<td>IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">DMEM</td>
			<td style="width:216px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">10567-014</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">FBS</td>
			<td style="width:216px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Anti-integrin beta3 blocking antibody</td>
			<td style="width:216px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:111px;">553343</td>
			<td>Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>44H14977A</td>
			<td>For digesting aorta</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Elastase</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp</td>
			<td>34K15139</td>
			<td>For digesting aorta</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Antibiotic-antimycotic (100X)</td>
			<td style="width:216px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Recombinant human FGF</td>
			<td style="width:216px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">G5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Recombinant human EGF</td>
			<td style="width:216px;">Promega</td>
			<td style="width:111px;">G5021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Penicillin/streptomycin (10,000 U/ml)</td>
			<td style="width:216px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:216px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">15290026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Tissue culture plates</td>
			<td style="width:216px;">Corning</td>
			<td style="width:111px;">CLS430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:323px;height:21px;">Alzet osmotic mini-pump</td>
			<td style="width:216px;">Durect Corporation</td>
			<td style="width:111px;">2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope</td>
			<td style="width:216px;">Nikon </td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"> TCS SP5</td>
			<td style="width:216px;">Leica</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Branson Sonifier 450</td>
			<td style="width:216px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Myh11-CreERT2 mice</td>
			<td style="width:216px;">The Jackson Laboratory </td>
			<td>19079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acta2-CreERT2 mice</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSA26R-CreERT2 mice</td>
			<td style="width:216px;">The Jackson Laboratory </td>
			<td style="width:111px;">8463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSA26R(mTmG/mTmG) mice</td>
			<td style="width:216px;">The Jackson Laboratory </td>
			<td> 026862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSA26R(EYFP/EYFP) mice</td>
			<td style="width:216px;">The Jackson Laboratory </td>
			<td> 006148 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSA26R(Confetti/Confetti) mice</td>
			<td style="width:216px;">The Jackson Laboratory </td>
			<td>13731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ROSA26R(Rb/Rb) mice</td>
			<td style="width:216px;">Lab of Dr. Irv Weissman</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:412px;">Obtained from lab of Dr. Irv Weissman</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using in vivo and tissue and cell explant approaches to study the morphogenesis and pathogenesis of the embryonic and perinatal aorta

A aorta é a maior artéria do corpo. A parede da aorta é composta por uma camada externa de fibroblastos e a matriz extracelular, uma camada média de alternância de lamelas elásticas e células musculares lisas (SMCs) e uma camada interna de células endoteliais. Em contraste com o estudo generalizado dos modelos patológicos (por exemplo, aterosclerose) na aorta adulto, muito menos é sabido sobre a aorta embrionária e perinatal. Aqui, focalizamos SMCs e fornecer protocolos para a análise da morfogênese e patogênese da SMCs aórtica embrionários e perinatais em desenvolvimento normal e a doença. Especificamente, os quatro protocolos incluídos são: eu) na vivo embrionário destino mapeamento e análise clonal; II) cultura de aorta embrionárias explante; III) isolamento de SMC da aorta perinatal; e iv) colocação de bomba mini osmótica subcutânea em ratos grávidas (ou não-grávidas). Assim, essas abordagens facilitam a investigação da origem, destino e arquitetura clonal de SMCs no aorta em vivo. Eles permitem modulação aorta embrionárias morfogênese no útero por exposição contínua a agentes farmacológicos. Além disso, tecidos aórtico isolado explants ou SMCs aórtica podem ser usadas para obter insights sobre o papel dos alvos do gene específico durante processos fundamentais, tais como muscularization, proliferação e migração. Estas experiências de geração de hipótese SMCs isolados e a aorta explantada então podem ser avaliadas no contexto na vivo através de abordagens farmacológicas e genéticas.

Em uma análise clonal representativa da SMCs em mutante de embriões para o Eln (o gene que codifica a elastina de proteínas da matriz extracelular), Eln(+ /-), Acta2-CreERT2 ratos foram acoplados a Eln(+ /-) ratos também carregando o multi cor ROSA26R(Rb/Rb) repórter. Conforme descrito na etapa 1, plugues foram verificadas, grávidas barragens foram induzidas com uma injeção única tamoxifeno (1,5 mg) em E12.5...

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Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Usando In Vivo e tecido e célula explante abordagens para estudar a morfogênese e a patogênese da Aorta embrionária e Perinatal

Protocolos para o estudo da aorta murino embrionária e perinatal usando na vivo clonal análise e mapeamento de destino, explantes aórtica e isolado músculo liso, células são detalhadas aqui. Essas diversas abordagens facilitam a investigação sobre a morfogênese da aorta no normal desenvolvimento embrionária e perinatal e a patogênese na doença.

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

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The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

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Stem Cell-like<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionárias explantes Estudar características Neural desenvolvimento precoce<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

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Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

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Dissociação celular do Epitélio da Língua e Mesenquime/Tecido Conjuntivo de Ratos Embrionários 12,5 e 8 Semanas

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