Name: dna nanotubes as a versatile tool to study semiflexible polymers
Uploaded: 2017-10-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers at JoVE.com

Vi anerkender, at finansiering af DFG (1116/17-1) og Leipzig skole af Natural Sciences "BuildMoNa" (GSR 185). Dette arbejde er blevet støttet gennem projektets Fraunhofer tiltrække 601 683. T. Hansen erkender, at midler fra den Europæiske Socialfond (ESF-100077106).

1. forberedelse af n HTs NOTE: her, n angiver antallet af forskellige enkelt DNA-strenge, involveret i dannelsen af helix rør af en vis størrelse. For n = 8, otte forskellige enkelt DNA-strenge udgør en enhed ring.
<ol><li>Køb DNA sekvenser (HPLC renhed renhed eller højere) fra en egnet DNA syntese service eller udfører høj kvalitet syntese og rensning (eksemplarisk sekvenser som vist i tabel 1).</li>
	<li>Resuspend frysetørret oligonukle...

For at opnå korrekt udformet netværk, er samle DNA nanorør et afgørende skridt. Fejl under syntese processen indflydelse negativ på tube kvalitet; Det anbefales derfor, at HPLC eller en strengere processen bruges til at rense oligonukleotider. Siden dannelsen af diskret frem for aggregerede DNA nanorør, samt deres længde distribution, afhænger af den equimolar støkiometrisk af n konstituerende oligonukleotider inden for sæt, er det nødvendigt at remeasure koncentrationerne af indkøbte dele, siden giv...

På grund af de komplekse adfærd aktiveres med deres unikke mekaniske egenskaber, er semiflexible polymerer grundlæggende byggesten af levende materiale. I modsætning til fleksibel polymerer vedtage semiflexible polymerer en fremstrakt konfiguration på grund af deres ikke-vanishing rygraden stivhed samtidig stadig underlagt stærke termisk udsving1. Således kan ikke rent stokastiske modeller anvendes på deres adfærd, som med ekstremer af fuldt fleksibelt eller stift polymerer. Den såkaldte ormelignende kæde model2,3,4 blev udviklet for at kvantificere denne stivhed via lp, som er konstanten henfald af tangent-tangent korrelation langs glødetrådens4. Hvis lp er sammenlignelig med den contour længde (lc) af glødetråden, betragtes polymeren semiflexible1. Svarende til polerne i et telt, deres ordninger i netværk eller bundter stabiliserer hele det kollektive system på lav volumenbrøkerne, fører til usædvanlige viskoelastiske egenskaber5,6,7, 8,9. Disse strukturer giver høj elasticiteter på store mesh størrelser10, opretholde mekaniske integritet stadig letter diffuserende og aktiv transport processer. Denne egenskab er især velegnet til biologiske systemer såsom cytoskelettet eller den ekstracellulære matrix, men det er også almindeligt anvendt i fødevarer engineering1,11,12.
Går ud over deres betydning til levende materiale, er det afgørende at grundigt undersøge de fysiske egenskaber af disse strukturer for at have værktøjer til at udvikle biomimetiske materialer eller roman hydrogels. Med hensyn til semiflexible polymerer indebærer dette systematisk bestemmelse af de kollektive egenskaber net som følge af single-filament egenskaber såsom lp og udviklingen af en beskrivende teoretisk ramme. I banebrydende undersøgelser, cellulære polymer actin blev etableret som et modelsystem for semiflexible polymerer og er stadig i vid udstrækning betragtes som guldstandarden5,13,14,15 , 16 , 17. men udtømmende undersøgelser er begrænset med dette system, da de er bundet til de iboende egenskaber af dette protein. Forskellige teoretiske tilgange har til formål at opbygge en beskrivelse af den ikke-trivielle mekaniske opførsel på single-filament niveau og ført til især forskellige skalering forudsigelser for afhængighed af lineære elastisk plateau shear modulus, G 0 (dvs. "elasticiteten" i netværket), koncentration (c) og lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Mens koncentrationen skalering er let tilgængelige i eksperimenter med actin-baseret eller andre modelsystemer og mens teoretiske forudsigelser har været strengt kontrolleret13,16,24, 25, skalering med hensyn til lp er forblevet eksperimentelt utilgængelige. Dette, er imidlertid en stor begrænsning, da lp er også en uafhængig variabel, der er definerende mængden af semiflexible polymerer.
Dette centrale, naturlige begrænsning, der fast lp af actin eller andre biologisk afledt polymerer såsom kollagen er for nylig blevet løst ved at ansætte flise-baseret DNA rør, som er afstemmelige i deres mekaniske egenskaber 9 , 26 , 27 , 28. små variationer i arkitekturen af rør (f.eks. forskelligt antal konstituerende DNA strands inden for enhed ring) giver forskellige værdier for lp, som kan evalueres via Fluorescens mikroskopi, enten ved at analysere en svingende tube eller ved at evaluere de buede konfigurationer af flere overholdt rør, som beskrevet tidligere9,28. Disse analyser viste, at lp værdier af de forskellige rør befolkninger varierer over mere end én størrelsesorden og at forskellige evalueringsteknikker give ensartede resultater9,28.
Overraskende, er den samlede skalering af lineære elastisk plateau shear modulus G0 med hensyn til koncentration og lp blevet rapporteret at være i strid med alle tidligere teoretiske tilgange 9, navnlig demonstrerer en meget stærkere end forudsagt afhængighed lp. Disse resultater understreger værdien af en ny modelsystem at studere centrale egenskaberne for semiflexible polymerer. Ansætte n-helix DNA rør dramatisk udvider anvendelsesområdet for disse undersøgelser. Ikke alene kan lp varieres frit uden at ændre den grundlæggende materiale, men den iboende programmerbare karakter af DNA kan aktivere systematisk undersøgelse af yderligere elementer, såsom krydsbindinger eller kinetisk skifte processer. Derudover disse rør er opløseligt i vand, og i modsætning til de fleste proteiner, stabil i passende pH og ioniske betingelser i flere uger, uden påviselig forringelse9.
At samle disse rør, et diskret sæt af DNA oligonukleotider bruges, hvoraf hver indeholder to domæner, der deler komplementær base sekvenser til to tilstødende tråde (på grund af de specifikke sekvenser, en enkelt streng kan ikke danne strukturer såsom hår pins). De komplementære sekvenser krydse sig på et cyklisk måde, danner lukkede, halv-overlappende ringe n sammenkoblet dobbelt heliske segmenter (figur 1A og B). Disse ringe form på en diskret diameter (figur 1 c), og deres halv-overlappende konfiguration udsætter aksial sticky ender supplement til sticky enderne af en anden ring. Denne selektive tilsætning af matchende oligonukleotider udløser en stabling af ringe, fører til den effektive polymerisering af trådformede DNA helix rør af størrelse n (nHT). Deres contour længder typisk måle flere mikron i længden, og deres længde distribution er sammenlignelig med actin filamenter9,26,27,28. Det har vist for lignende DNA nanorør at de faktisk udviser polymerisering kinetik ligner dem af actin filamenter og mikrotubuli<su></su>p class = "xref" > 29. Afhængigt af det antal n af enkelte DNA-strenge, der udgør den grundlæggende ring struktur, kan nHT arkitektur, såvel som dens omkreds og diameter, controllably varieres. Ved hjælp af flere DNA-strenge øger omkredsen af ringe/rør, og den tilsvarende ændring af arkitektoniske skifter de mekaniske egenskaber til højere lp værdier (figur 1 c), svarende til en højere stivhed. På mesoskopisk skala, disse større lp værdier omsættes til mindre bøjet konformationer på grund af den større stivhed (fig. 1 d og E).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="667">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:169px;">AFM cantilever ACTA</td>
			<td style="width:196px;">AppNano</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">AFM - NanoWizard 3</td>
			<td style="width:196px;">JPK Instruments</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">CCD camera</td>
			<td style="width:196px;">Andor</td>
			<td style="width:123px;">iXon DV887</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">DMSO</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D2650</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">DNA oligonucleotides</td>
			<td style="width:196px;">Biomers.net</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;">For sequences see Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:169px;">DNA Cy3-labeled oligonucleotides</td>
			<td style="width:196px;">Biomers.net</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;">For sequence see Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">EDTA</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">E-9884</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">Epi-fluorescence micro-scope</td>
			<td style="width:196px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">DM-IRB</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:169px;">MgCl2</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M-8266</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">Mica &#34;V1&#34;, 12 mm round</td>
			<td style="width:196px;">Plano GmbH</td>
			<td style="width:123px;">50-12</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">MicroAmp&#174; Fast Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:123px;">4346907</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">MicroAmp&#174; Optical Adhesive Film</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:123px;">4306311</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">100x objective</td>
			<td style="width:196px;">Leica5</td>
			<td style="width:123px;">506168</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">Purified water</td>
			<td style="width:196px;">Merk Millipore - Milli-Q &#38; Elix</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Sapphire PCR tubes</td>
			<td style="width:196px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:123px;">683271</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">TProfessional Standard PCR Thermocycler</td>
			<td style="width:196px;">Core Life Sciences Inc.</td>
			<td style="width:123px;">070- Standard</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">7900HT Fast Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:196px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">4351405</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Rheometer</td>
			<td style="width:196px;">TA Instruments</td>
			<td style="width:123px;">ARES</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">SYBR&#174; Green I nucleic acid gel stain</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:123px;">S7567</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Tris</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T4661</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:169px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td style="width:123px;">X-100</td>
			<td style="width:180px;">Suppresses evaporation of sample at air-water interface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna nanotubes as a versatile tool to study semiflexible polymers

Mekaniske egenskaber af komplekse, polymer-baserede blødt materiale, såsom celler eller polymer netværk, kan forstås i hverken klassisk ramme af fleksible polymerer eller af stiv stænger. Underliggende filamenter forbliver udstrakte på grund af deres ikke-vanishing rygraden stivhed, som skal være talbestemt via persistens længde (lp), men de er også underlagt stærke termisk udsving. Deres begrænsede bøjning stivhed fører til unikke, ikke-trivielle kollektive mekanik af bulk netværk, gør det muligt for dannelsen af stabil stilladser på lav volumenbrøkerne samtidig store maskestørrelser. Dette grundlæggende princip er udbredt i naturen (f.eks. i celler eller væv), minimere høj Molekylær indhold og dermed lette diffuserende eller aktiv transport. På grund af deres biologiske virkninger og potentielle teknologiske applikationer i biokompatible hydrogels, har semiflexible polymerer været genstand for betydelig undersøgelse. Men forståelige undersøgelser forblev udfordrende, da de har påberåbt sig naturlige polymerer, såsom actin filamenter, der ikke er frit afstemmelige. På trods af disse begrænsninger, og på grund af manglende syntetiske, mekanisk afstemmelige og semiflexible polymerer blev actin filamenter etableret som den fælles modelsystem. En stor begrænsning er, at centrale mængde lp ikke kan indstilles frit for at studere dens indvirkning på makroskopisk bulk strukturer. Denne begrænsning blev løst ved at ansætte strukturelt programmerbare DNA nanorør, gør det muligt for kontrolleret ændring af glødetrådens stivhed. De er dannet gennem flise-baseret design, hvor et diskret sæt af delvist supplerende tråde krydse sig i en ring struktur med en diskret omkreds. Disse ringe indslag sticky ender, muliggør den effektive polymerisering til filamenter flere mikron i længde, og vise lignende polymerisering kinetik som naturlige Biopolymerer. På grund af deres programmerbare mekanik er disse rør alsidige, Roman værktøjer til at undersøge virkningen af lp på enkelt-molekyle samt bulk skala. I modsætning til actin filamenter, de forbliver stabil i løbet af uger, uden bemærkelsesværdige degeneration, og deres håndtering er forholdsvis ligetil.

Samling af DNA nanorør via en temperatur rampe (figur 2) er en meget pålidelig metode til at danne disse kunstige semiflexible polymerer. Disse polymerer har lignende egenskaber til deres naturligt forekommende modparter, såsom actin filamenter, men giver en langt bredere eksperimentelle ramme siden deres mekaniske egenskaber kan controllably ændret9,27 . Ligesom Biopolymerer, de kan arrangeres i ...

Watch this Scientific Journal Video about DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers at JoVE.com

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Semiflexible polymerer vise enestående mekaniske egenskaber, der er i vid udstrækning anvendes af levende systemer. Systematiske undersøgelser på Biopolymerer er dog begrænset, da egenskaber såsom polymer stivhed er utilgængelige. Dette manuskript beskriver, hvordan denne begrænsning er omgået af programmerbare DNA nanorør, aktivering af eksperimentelle undersøgelser af virkningen af glødetrådens stivhed.

DNA nanorør som et alsidigt værktøj til at studere Semiflexible polymerer

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Hud tatovering som en ny tilgang til DNA Vaccine Delivery

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

En alsidig Automatiseret platform for Micro-skala cellestimulering Eksperimenter

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

En Mikrofluid Chip til Alsidig kemisk analyse af enkelte celler

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescens-quenching af et liposomalt indkapslet Near-infrarøde fluorofor som et værktøj til<em&gt; In Vivo</em&gt; Optisk Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

Syntesen af ​​RGD-funktionaliserede Hydrogeler som værktøj for terapeutiske applikationer

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Engineering Molekylær Anerkendelse med Bio-mimetiske Polymerer på Single Walled kulstofnanorør

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Et alsidigt Metode til mønstring Proteiner og celler

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...