Name: dna nanotubes as a versatile tool to study semiflexible polymers
Uploaded: 2017-10-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers at JoVE.com

Reconhecemos que o financiamento pelo DFG (1116/17-1) e da escola de Leipzig de ciências naturais "BuildMoNa" (GSC 185). Este trabalho foi apoiado através do projeto de Fraunhofer atrair 601 683. T. H. reconhece que o financiamento do Fundo Social Europeu (FSE-100077106).

1. preparação de n HTs Nota: aqui, n denota o número de diferentes cadeias de DNA simples envolvidos na formação dos tubos de um determinado tamanho de hélice. Para n = 8, oito diferentes cadeias de DNA simples compõem um anel unidade.
<ol><li>Sequências de DNA de compra (grau de pureza HPLC ou superior) de uma síntese de DNA adequada para o serviço ou realizar a síntese de alta qualidade e purificação (sequências exemplares indicadas na tab...

Para obter corretamente formadas redes, reunir os nanotubos de DNA é um passo crucial. Erros durante o processo de síntese impactar negativamente a qualidade do tubo; Portanto, é recomendável que ser usado para purificar os oligonucleotides HPLC ou um processo mais rigoroso. Desde que a formação de discretos ao invés de agregados nanotubos de DNA, bem como sua distribuição de comprimento, depende da estequiometria equimolar dos oligonucleotides constituintes n dentro do conjunto, é necessário para rem...

Devido os comportamentos complexos habilitados por suas propriedades mecânicas únicas, semiflexível polímeros são blocos de construção fundamentais da matéria viva. Em contraste com polímeros flexíveis, polímeros semiflexível adotam uma configuração estendida devido a sua rigidez de espinha dorsal não desaparecendo enquanto ainda permanecem sujeitas a fortes flutuações térmicas1. Assim, modelos estocásticos puramente não podem ser aplicados a seus comportamentos, como com os extremos de polímeros totalmente flexíveis ou rígidos. A cadeia de tipo worm chamado modelo2,3,4 foi desenvolvido para quantificar essa rigidez através a lp, que é a constante de decaimento da correlação tangente-tangente ao longo do filamento de4. Se lp é comparável ao comprimento de contorno (l.c) do filamento, o polímero é considerado semiflexível1. Análogo aos polos de uma tenda, seus arranjos em redes ou feixes estabiliza todo o sistema coletivo em frações de baixo volume, levando a incomum viscoelástico propriedades5,6,7, 8,9. Essas estruturas fornecem altas elasticidades em grande malha tamanhos10, mantendo a integridade mecânica enquanto ainda facilitando difusiva e processos de transporte ativo. Esta propriedade é especialmente indicada para sistemas biológicos, tais como o citoesqueleto ou a matriz extracelular, mas é também amplamente utilizado na engenharia de alimentos1,11,12.
Indo além da sua importância com a matéria viva, é fundamental examinar exaustivamente as propriedades físicas destas estruturas a fim de ter as ferramentas para desenvolver materiais biomimético ou hidrogel romance. Em termos de polímeros semiflexível, isto implica a determinação sistemática das propriedades coletivas de redes resultantes de filamento único propriedades como lp e o desenvolvimento de um quadro teórico descritivo. Em estudos pioneiros, a actina biopolímero celular foi estabelecida como um sistema modelo para polímeros semiflexível e é ainda considerada o padrão-ouro5,13,14,15 , 16 , 17. no entanto, estudos exaustivos são limitados com este sistema, desde que eles são obrigados às propriedades inerentes desta proteína. Diversas abordagens teóricas têm visa construir uma descrição dos comportamentos não-trivial mecânicas a nível de filamento único e conduziram a notavelmente diferentes previsões dimensionamento para a dependência o módulo de cisalhamento do planalto elástica linear, G de 0 (ou seja, a "elasticidade" da rede), no que diz respeito a concentração (c) e lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Enquanto o dimensionamento de concentração é prontamente acessível em experimentos com actina-based ou outros sistemas modelo e enquanto predições teóricas têm sido rigorosamente verificados13,16,24, 25, o dimensionamento em relação ao lp manteve-se experimentalmente inacessível. Isto, porém, é uma limitação principal desde lp também é uma variável independente que é a definição quantidade de polímeros semiflexível.
Esta central, natural limitação imposta pelo fixo lp de actina ou outros polímeros derivados biologicamente como colágeno recentemente foi resolvida empregando tubos telha-baseado de DNA, que são ajustáveis em suas propriedades mecânicas 9 , 26 , 27 , 28. ligeiras variações nas arquiteturas dos tubos (por exemplo, números diferentes do DNA constituinte vertentes dentro do anel de unidade) produzem valores distintos para lp, que pode ser avaliada através de microscopia de fluorescência, analisando um tubo flutuante ou avaliando as configurações curvas de vários tubos aderidas, como descrito anteriormente9,28. Essas análises revelaram que valores dep ldas populações diferentes de tubo variam ao longo de mais de uma ordem de magnitude e que técnicas de avaliação diferentes produzem resultados consistentes9,28.
Surpreendentemente, a escala global do planalto elástica linear cisalhamento módulo G0 em relação à concentração e lp foi relatada para ser inconsistente com todas as abordagens teóricas anteriores 9, em particular, demonstrando um muito mais forte do que o previsto dependência lp. Esses achados enfatizam o valor de um novo sistema de modelo para estudar as propriedades centrais de polímeros semiflexível. Empregando n-tubos de DNA de hélice dramaticamente amplia o escopo destas investigações. Não só pode lp ser variado livremente sem alterar o material básico, mas a natureza inerente programável do DNA pode permitir o exame sistemático dos elementos adicionais, tais como as referências cruzadas ou processos cinéticos de comutação. Além disso, estes tubos são solúveis em água e, em contraste com a maioria das proteínas, estável em pH adequado e condições iônicas por várias semanas, sem degradação detectável9.
Para montar estes tubos, é utilizado um conjunto de oligonucleotídeos de DNA, cada uma das quais contém dois domínios que compartilham sequências base complementares às duas vertentes vizinhas (devido as sequências específicas, um único fio não pode formar estruturas como pinos de cabelo). As sequências complementares cruzam de forma cíclica, formando anéis fechados, metade-sobreposição de dupla-hélice segmentos n interligados (figura 1A e B). Estes formam anéis em um discreta de diâmetro (Figura 1) e sua configuração de meia-sobreposição expõe axiais extremidades pegajosas complementares às extremidades pegajosas de outro anel. Esta adição seletiva de correspondência oligonucleotides desencadeia um empilhamento dos anéis, levando à polimerização eficaz de filamentosas tubos de hélice de DNA de tamanho n (n-HT). Seus comprimentos contornos tipicamente medem vários microns de comprimento, e sua distribuição de comprimento é comparável de actina filamentos9,26,,27,28. Tem sido demonstrado para nanotubos de DNA semelhantes que eles de fato apresentam cinética de polimerização semelhante dos microtúbulos e filamentos de actina<su></su>classe p = "xref" > 29. Dependendo o número n de cadeias de ADN individuais que compõem a estrutura básica do anel, a arquitetura nHT, bem como a sua circunferência e diâmetro, podem ser botija variados. Usar mais de DNA aumenta a circunferência dos tubos/anéis, e a correspondente alteração arquitetônica desloca as propriedades mecânicas para valores mais elevados dep l(Figura 1), correspondente a uma maior rigidez. Na escala mesoscópica, estes grandes valores dep ltraduzem em conformações menos dobradas devido a rigidez superior (Figura 1 e E).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="667">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:169px;">AFM cantilever ACTA</td>
			<td style="width:196px;">AppNano</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">AFM - NanoWizard 3</td>
			<td style="width:196px;">JPK Instruments</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">CCD camera</td>
			<td style="width:196px;">Andor</td>
			<td style="width:123px;">iXon DV887</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">DMSO</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D2650</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">DNA oligonucleotides</td>
			<td style="width:196px;">Biomers.net</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;">For sequences see Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:169px;">DNA Cy3-labeled oligonucleotides</td>
			<td style="width:196px;">Biomers.net</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;">For sequence see Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">EDTA</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">E-9884</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">Epi-fluorescence micro-scope</td>
			<td style="width:196px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">DM-IRB</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:169px;">MgCl2</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M-8266</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">Mica &#34;V1&#34;, 12 mm round</td>
			<td style="width:196px;">Plano GmbH</td>
			<td style="width:123px;">50-12</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">MicroAmp&#174; Fast Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:123px;">4346907</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">MicroAmp&#174; Optical Adhesive Film</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:123px;">4306311</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">100x objective</td>
			<td style="width:196px;">Leica5</td>
			<td style="width:123px;">506168</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">Purified water</td>
			<td style="width:196px;">Merk Millipore - Milli-Q &#38; Elix</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Sapphire PCR tubes</td>
			<td style="width:196px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:123px;">683271</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">TProfessional Standard PCR Thermocycler</td>
			<td style="width:196px;">Core Life Sciences Inc.</td>
			<td style="width:123px;">070- Standard</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">7900HT Fast Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:196px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">4351405</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Rheometer</td>
			<td style="width:196px;">TA Instruments</td>
			<td style="width:123px;">ARES</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">SYBR&#174; Green I nucleic acid gel stain</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:123px;">S7567</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Tris</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T4661</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:169px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td style="width:123px;">X-100</td>
			<td style="width:180px;">Suppresses evaporation of sample at air-water interface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna nanotubes as a versatile tool to study semiflexible polymers

Propriedades mecânicas da matéria mole complexa, à base de polímero, tais como células ou redes de biopolímero, podem ser entendidas em nem o quadro clássico de polímeros flexíveis nem de hastes rígidas. Filamentos subjacentes permanecem estendidos devido a sua rigidez de espinha dorsal não desaparecendo, que é quantificada através do comprimento de persistência (l.p), mas eles também estão sujeitos a fortes flutuações térmicas. Sua rigidez de flexão finito leva a mecânica coletiva única, não-trivial de redes em massa, permitindo a formação de andaimes estáveis em frações de baixo volume, proporcionando grande malha tamanhos. Este princípio subjacente é prevalente na natureza (por exemplo, em células ou tecidos), minimizando o alto teor molecular e facilitando difusiva ou transporte ativo. Devido a suas implicações biológicas e potenciais aplicações tecnológicas em hidrogel biocompatível, semiflexível polímeros têm sido objecto de estudo considerável. No entanto, investigações compreensíveis permaneceram desafiadoras desde que eles dependiam de polímeros naturais, tais como os filamentos de actina, que não são livremente ajustáveis. Apesar dessas limitações e devido à falta de polímeros sintéticos, mecanicamente ajustáveis e semiflexível, filamentos de actina estabeleceram-se como sistema comum de modelo. Uma grande limitação é que a quantidade central lp não pode ser livremente ajustado para estudar seu impacto nas estruturas macroscópicas em massa. Esta limitação foi resolvida empregando estruturalmente programáveis nanotubos de DNA, permitindo a alteração controlada de rigidez do filamento. Eles são formados por projetos baseados em azulejo, onde um conjunto discreto de costas parcialmente complementares cruzar em uma estrutura em anel com uma circunferência discreta. Estes anéis apresentam extremidades pegajosas, permitindo a efetiva polimerização em filamentos vários microns de comprimento e exibir semelhante cinética de polimerização como biopolímeros naturais. Devido à sua mecânica programável, estes tubos são ferramentas versátil, a novela para estudar o impacto da lp a único-molécula, bem como a escala em massa. Em contraste com os filamentos de actina, eles permanecem estáveis durante semanas, sem degeneração notável, e sua manipulação é comparativamente simples.

A montagem dos nanotubos de DNA através de uma rampa de temperatura (Figura 2) é um método muito confiável para formar estes polímeros semiflexível artificiais. Estes polímeros têm características comparáveis aos seus homólogos naturais, tais como os filamentos de actina, mas fornecem um quadro experimental muito mais amplo, uma vez que suas propriedades mecânicas podem ser botija alterado9,27 <...

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DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Polímeros semiflexível exibem propriedades mecânicas únicas que são aplicadas extensivamente por sistemas de viver. No entanto, estudos sistemáticos sobre biopolímeros são limitados desde propriedades tais como a rigidez do polímero são inacessíveis. Este manuscrito descreve como esta limitação é contornada por nanotubos de DNA programáveis, permitindo estudos experimentais sobre o impacto da rigidez do filamento.

Nanotubos de DNA como uma ferramenta versátil para estudar semiflexível polímeros

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

Research

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