Name: dna nanotubes as a versatile tool to study semiflexible polymers
Uploaded: 2017-10-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers at JoVE.com

Мы признаем, финансирование DFG (1116/17-1) и Лейпциг школа естественных наук «BuildMoNa» (GSC 185). Эта работа оказывалась через Fraunhofer привлечь проекта 601 683. Т. ч. признает финансирование из Европейского социального фонда (ЕСФ-100077106).

1. Подготовка n HTs Примечание: здесь, n обозначает количество различных одной нити ДНК, участвующих в формировании трубы спирали определенного размера. Для n = 8, восемь различных одной нити ДНК составляют блок кольцо.
<ol><li>Последовательностей ДНК покупки (ВЭ?...

Чтобы получить правильно сформированные сетей, монтаж нанотрубках ДНК представляет собой решающий шаг. Ошибки во время процесса синтеза отрицательно влияют на качество трубки; Поэтому рекомендуется использовать для очистки олигонуклеотиды ВЭЖХ или более строгий процесс. Поскольку ф...

Из-за сложного поведения, благодаря их уникальным механических свойств полугибких Полимеры являются базовыми стандартными блоками живой материи. В отличие от гибких полимеров полугибких полимеров принять вытянутой конфигурации из-за их не исчезает скованность позвоночника оставаясь при условии сильные термические флуктуации1. Таким образом чисто стохастических моделей не может применяться к их поведение, как и в случае с крайностями полностью гибкие или жесткие полимеров. Для количественной оценки этой жесткости через lp, который является константа распада тангенс тангенс корреляции вдоль нити накала4был разработан так называемый червь как цепь модель2,3,4 . Если lp сопоставима с контурной длины (lc) нити накала, полимер считается полугибких1. Аналогично поляков палатки, их механизмов в сетях или пучки стабилизирует всю коллективной системы при низкой громкости фракций, приводит к необычным вязкоупругие свойства5,6,7, 8,9. Эти структуры обеспечивают высокую эластичность в целом сетка Размеры10, поддержание механическую целостность то же время содействие диффузионные и процессы активного транспорта. Это свойство особенно подходит для биологических систем, таких как цитоскелета или внеклеточного матрикса, но она также широко используется в пищевой инженерных1,,1112.
Выходящие за рамки их значимости для живой материи, важно всесторонне изучить на физические свойства этих структур для того, чтобы иметь инструменты для разработки биоимитирующие материалы или Роман гидрогели. С точки зрения полугибких полимеров это предполагает систематическое определение коллективные свойства результате сингл накаливания свойства, такие как lp и развития описательный теоретические основы сетей. В первопроходца исследования сотовой биополимера актина была учреждена в качестве модельной системы для полугибких полимеров и до сих пор считается золотым стандартом5,13,14,15 , 16 , 17. Однако, исчерпывающего исследования ограничены с этой системой, поскольку они привязаны к имманентные свойства этого белка. Различные теоретические подходы нацелены на создание Описание нетривиальных механического поведения на уровне одной нити накала и привели к особенно различных масштабирования предсказания для зависимость модуль сдвига линейных упругих плато, G 0 (то есть, «эластичность» сети), в отношении концентрации (c) и lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Хотя концентрация масштабирование легко доступны в экспериментах с актин- или другие модели системы и теоретические прогнозы были тщательно проверены13,16,24, 25, масштабирование относительно lp оставалась экспериментально недоступны. Однако, это одним из основных ограничений с lp также независимой переменной, которая является определяющей количество полугибких полимеров.
Этот центральный, природные ограничения, введенные фиксированной lp актин или других биологически производные полимеры, такие как коллаген недавно была решена путем применения плитки основе ДНК трубки, которые перестраиваемый в их механические свойства 9 , 26 , 27 , 28. небольшие вариации в архитектурах труб (например, различное количество составляющих ДНК пряди в пределах подразделения кольца) дают различные значения lp, которые могут быть оценены через микроскопии флуоресцирования, анализ одного колебания трубы либо путем оценки изогнутой конфигурации нескольких придерживался трубок как описано ранее9,28. Эти анализы показали, что lp населения различных трубка значения за более чем один порядок величины и различные оценки методов дают постоянные результаты9,28.
Удивительно общее масштабирование линейных упругих плато сдвига модуль G0 в отношении концентрации и lp было сообщено быть несовместимым с всех предыдущих теоретических подходов 9, в частности демонстрируют гораздо сильнее, чем предсказано зависимость от lp. Эти выводы подчеркивают значение новой модели системы для изучения Центральной свойства полугибких полимеров. Использование n-трубы спирали ДНК значительно расширяет сферу этих расследований. Не только может lp свободно варьироваться без изменения основной материал, но присущие программируемый характер ДНК можно включить систематического рассмотрения дополнительных элементов, таких как сшивки или кинетическим переключения процессов. Кроме того эти трубы растворимы в воде и, в отличие от большинства белков, стабильная в адекватных pH и ионных условий в течение нескольких недель, без обнаружению деградации9.
Чтобы собрать эти трубы, используется дискретный набор ДНК-олигонуклеотиды, каждый из которых содержит два домены, использующие дополнительные базовые последовательности для двух соседних нитей (из-за специфических последовательностей, одиночной стренги не может сформировать структуры, такие как шпильки). Дополнительные последовательности гибридизируйте циклическим образом, образуя замкнутые, половина перекроя кольца n в взаимосвязанные двойной винтовой сегментов (рис. 1а и B). Эти формы кольца на дискретные диаметр (рис. 1 c) и их половину перекрытие конфигурации предоставляет осевой липкие концы дополняет липкие концы другого кольца. Это селективный Добавление сопоставления олигонуклеотиды триггеров, укладывая колец, ведущих к эффективной полимеризации нитчатые трубы спирали ДНК размера n (nHT). Их контуров длины обычно измеряют несколько мкм в длину, и их распределение длины сопоставим с миозина нитей9,26,27,28. Для подобных нанотрубках ДНК показано, что они действительно обладают кинетика полимеризации аналогичны филаментов актина и микротрубочек<su></su>класс p = «внешней» > 29. В зависимости от числа n отдельных нитей ДНК, составляющих структуру основного кольца, nHT архитектуры, а также его окружности и диаметр, можно варьировать controllably. С помощью более нитей ДНК увеличивается окружность трубы кольца, и соответствующее изменение архитектуры смены механических свойств на более высокие значенияp l(рис. 1 c), соответствует более высокой жесткости. На шкале мезоскопических эти большие значенияp lперевести на менее изогнутой конформации из-за более высокой жесткости (рис. 1 d и E).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="667">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:169px;">AFM cantilever ACTA</td>
			<td style="width:196px;">AppNano</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">AFM - NanoWizard 3</td>
			<td style="width:196px;">JPK Instruments</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">CCD camera</td>
			<td style="width:196px;">Andor</td>
			<td style="width:123px;">iXon DV887</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">DMSO</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D2650</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">DNA oligonucleotides</td>
			<td style="width:196px;">Biomers.net</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;">For sequences see Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:169px;">DNA Cy3-labeled oligonucleotides</td>
			<td style="width:196px;">Biomers.net</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;">For sequence see Table 1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">EDTA</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">E-9884</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">Epi-fluorescence micro-scope</td>
			<td style="width:196px;">Leica</td>
			<td style="width:123px;">DM-IRB</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:169px;">MgCl2</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">M-8266</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">Mica &#34;V1&#34;, 12 mm round</td>
			<td style="width:196px;">Plano GmbH</td>
			<td style="width:123px;">50-12</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">MicroAmp&#174; Fast Optical 96-Well Reaction Plate</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:123px;">4346907</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">MicroAmp&#174; Optical Adhesive Film</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:123px;">4306311</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">100x objective</td>
			<td style="width:196px;">Leica5</td>
			<td style="width:123px;">506168</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">Purified water</td>
			<td style="width:196px;">Merk Millipore - Milli-Q &#38; Elix</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Sapphire PCR tubes</td>
			<td style="width:196px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:123px;">683271</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">TProfessional Standard PCR Thermocycler</td>
			<td style="width:196px;">Core Life Sciences Inc.</td>
			<td style="width:123px;">070- Standard</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">7900HT Fast Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:196px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:123px;">4351405</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Rheometer</td>
			<td style="width:196px;">TA Instruments</td>
			<td style="width:123px;">ARES</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:169px;">SYBR&#174; Green I nucleic acid gel stain</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td style="width:123px;">S7567</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Tris</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">T4661</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:169px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich Co.</td>
			<td style="width:123px;">X-100</td>
			<td style="width:180px;">Suppresses evaporation of sample at air-water interface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dna nanotubes as a versatile tool to study semiflexible polymers

Механические свойства сложных, на полимерной основе мягкой материи, например клетки или биополимеров сетей, может пониматься в ни классической рамке гибких полимеров, ни жестких стержней. Основные нити остаются вытянутой вследствие их жесткость не исчезающие позвоночника, который количественно через сохранение длины (lp), но они также subject to сильные зыбкост тепловой. Их конечный изгиб жесткость приводит к уникальным, нетривиальные коллективных механики сыпучих сетей, позволяя формирования стабильных подмостей на низкой громкости фракций обеспечивая большие сетки размерами. Этот основополагающий принцип широко распространены в природе (например, в клетки или ткани), минимизации высокой молекулярной содержание и способствуя диффузионных или активного транспорта. Благодаря их биологические последствия и потенциальные технологические приложения в биосовместимые гидрогели полугибких полимеров претерпели значительные исследования. Однако понятной расследований остается сложной, поскольку они полагались на природные полимеры, такие как филаментов актина, которые не являются свободно перестраиваемый. Несмотря на эти ограничения и отсутствием синтетических, механически перестраиваемый и полугибких полимеров филаментов актина были созданы в качестве общей модели системы. Основным ограничением является, что Центральный количество lp не могут быть настроены свободно изучить ее влияние на макроскопических массовых структур. Это ограничение была решена путем применения структурно программируемых нанотрубках ДНК, включение контролируемые изменения жесткости накаливания. Они формируются через плитки основе конструкции, где дискретный набор частично дополнительные пряди гибридизировать в кольцевую структуру с дискретной окружности. Эти кольца имеют липкие концы, позволяя эффективные полимеризации в нити несколько мкм в длину и отображать аналогичные кинетика полимеризации как природные биополимеры. Из-за их программируемых механики эти трубы являются универсальным, Роман инструменты для изучения влияния lp на сингл молекулы, а также основная шкала. В отличие от филаментов актина они остаются стабильными в течение недель, без заметных дегенерации, и их обработка сравнительно проста.

Ассамблея нанотрубках ДНК через рампу температуры (рис. 2) является весьма надежный способ сформировать эти искусственные полугибких полимеров. Эти полимеры имеют сопоставимые характеристики их естественным аналогов, например филаментов актина, но о?...

Watch this Scientific Journal Video about DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers at JoVE.com

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Полугибких полимеров отображения уникальные механические свойства, которые широко применяются в живущих систем. Однако систематические исследования биополимеров ограничены, поскольку такие свойства, как жесткость полимера недоступны. Эта рукопись описывает, как обойти это ограничение, программируемые ДНК нанотрубок, позволяя экспериментальные исследования о влиянии накаливания жесткости.

Нанотрубках ДНК как универсальный инструмент для изучения полугибких полимеров

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

The overall goal of this new DNA-based model system is to understand the fundamental properties of a class of semiflexible polymers, which also describes the behavior of a vital class of biopolymers. This new method allows us to study key questions in the field of soft metaphysics, specifically, it allows to explore the behavior of semiflexible filaments and their arrangements into networks. The main advantage of this technique is that the mechanical properties of intravisive filaments are experimentally accessible and can be precisely tuned.Semiflexible polymers are defined by the special properties of the filaments which were previously only treated in the theoretical framework due to the lack of a tunable experimental systems. Though this method provides insight into the defining quantity of semiflexible polymers, it can also be applied as a new hydrogel to study cell migration in matrices of different stiffness's without changing the under laying mesh size. The smallest repetitive unit in the nanotube can be thought of as a unit ring.Several of these unit rings stack during hybridization. This leads to the formation of elongated nanotube's. To begin, re-suspend lyophilized oligonucleotides in purified water and follow the further re-suspension steps given in the corresponding manual from the company.Adjust the amount of water to obtain a final concentration of 200 micromolar. Determine the concentration's of the single DNA strands to verify the values given by the distributor since the exact stoichiometry is crucial for the assembly process. Using a micropipette, mix the DNA strands each of the same concentration in a container suitable for the thermocycler to form the desired DNA and helix tubes.Hybridize the DNA and helix tubes in a thermocycler using the parameters found in the text protocol. Store the hybridized DNA and helix tubes for up to 3 weeks at 4 degrees celsius without detectable degradation. Before performing rheology, carefully dilute the sample to the desired final concentration using the sample buffer if necessary.Choose an appropriate geometry for the dynamic shear rheometer. Then, load the sample on the rheometer. To prevent potential evaporation effects, passivate the air water interface of the sample and environment through 1 of 3 techniques.Either surround the sample with 2.5 milliliters of the sample buffer bath. Or, add a surfactant just below the micelle concentration to the sample. Alternatively, use the hamilton syringe to surround the sample with lipid to avoid direct contact of the sample with air.Seal the sample chamber using a cap equipped with wet sponges. And, if possible use an additional water bath to further suppress evaporation. Start the measurement using the rheometer specific software at room temperature allowing the sample to equilibrate for 2 hours at room temperature.The equilibration time is crucial to allow the thermoflect system to a complete isotropic randomized state since this is the only confirmation allowing comparison between the different measurements. Following measurement, process the data as described in the text protocol. Prepare 8 aliquots of 12 microliters for each sample using 1 to 4 micromolar DNA per strand, 12.5 millimolar magnesium chloride, and 1x nucleic acid gel stain.Also, make a negative control with no DNA, but include the nucleic acid gel stain. Transfer the aliquots to a real time PCR plate and seal with adhesive film. Centrifuge the plate at 100 times G for 1 minute at room temperature to remove the gas bubbles.It's critical to remove the gas bubbles because it can expand during measurements and the samples cannot be analyzed. Following centrifugation, load the sealed plate into a real time quantitative PCR system. Program an annealing program to denature the DNA at ninety degree celsius for 10 minutes and drop the temperature quickly to seventy two degrees celsius.Then the temperature should decrease slowly by 0.5 degrees celsius every thirty minutes. After the signal has decayed, accelerate the temperature ramp. Make sure that the lid of the cycler heats to at least one hundred degrees celsius to prevent the condensation of evaporated sample on the adhesive film.During the assembly, excite the samples with an argon ion laser at four hundred eighty eight nanometers and detect the fluorescence at five hundred fifty nanometers when using a CY3 dye. For other dyes, choose an appropriate excitation emission combination. Measure the fluorescence signal as often as possible to increase the overall signal quality using the built in camera.Representative raw data of a rheological measurement are shown revealing the elasticity of the network. Shown here is the time sweep during equilibration time. This plot reveals the strain dependent behavior of the network.In this plot, the frequency dependent behavior of the network is evident. At this point the values at a specific frequency are chosen. The values for the specific DNA helix tube population were plotted against the concentration.This process was repeated for all the DNA and helix tubes. The slope was then extracted in a log logged plot yielding the power law exponent. Finally, the values were replotted against the persistent length for each measured concentration.These graphs allow extraction of the scaling of the elastic plateau modulus with respect to the concentration and persistence length. After development, this technique paved the way for researchers in the field of soft matter and polymer physics to explore the effect of the filament stiffness for the class semiflexible polymers. Following this procedure, additional effects such as the recitation of the entangled networks, crossing networks in general, and structure formation process can be addressed.After watching this video you should have a good understanding on how to hybridize DNA nanotubes and how to measure the rheological properties of their networks.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Shape Memory Polymers for Active Cell Culture

С памятью формы полимеров для активного культуры клеток

Shape memory polymers (SMPs) are a class of "smart" materials that have the ability to change from a fixed, temporary shape to a pre-determined permanent ...

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Трехмерная реконструкция человеческой кожи Модель: инструмент для изучения нормальной кожи и меланомы Прогрессия

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Дизайн Циклические биореактора давление для Ex Vivo Изучение аортального клапанов сердца

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Simultaneous Synthesis of Single-walled Carbon Nanotubes and Graphene in a Magnetically-enhanced Arc Plasma

Одновременное Синтез однослойных углеродных нанотрубок и графена в магнитно-расширения плазменной дуги

Carbon nanostructures such as single-walled carbon nanotubes (SWCNT) and graphene attract a deluge of interest of scholars nowadays due to their very ...

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Кожа Татуировка как новый подход для доставки ДНК-вакцин

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Универсальная автоматизированная платформа для микро-масштабе Эксперименты стимуляции клеток

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Флуоресценции тушение липосомальной инкапсулированный в ближней инфракрасной области флуорофорные как инструмент для<em&gt; В Vivo</em&gt; Оптических изображений

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

Синтез РГД-функционализированного гидрогелей в качестве инструмента для терапевтических применений

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Инжиниринг Признание Молекулярный с Био-мимических Полимеры на одностенных углеродных нанотрубках

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Универсальный метод паттернирования белки и клетки

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...