Name: semi-automated biopanning of bacterial display libraries for peptide affinity reagent discovery and analysis of resulting isolates
Uploaded: 2017-12-06T12:30:00
Duration: 13 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates at JoVE.com

الكتاب يود أن ينوه الدعم من "برنامج زمالة ما بعد الدكتوراه في مختبر أبحاث الجيش الأمريكي" (ARL)، يديرها أوك ريدج المرتبطين بها الجامعات من خلال عقد مع ARL، من خلال تعيين الدكتور جوستين ص جانك. وقدم المتبقية التمويل من أجهزة الاستشعار ومديرية أجهزة إلكترون في ARL. الكتاب أيضا يود أن يشكر "المختبر دوتري" في UCSB لتقاسم العرض البكتيرية المكتبة والمعلومات لاستنساخ الكاشف مني يبيت، الدكتور برين آدامز لتقديم الدعم في مجال الاستنساخ الكاشف مني يبيت في ARL، الدكتور جوشوا كوجوت لعمله الأولى في و التدريب في بيوبانينج البكتيرية عرض المكتبات، الهدوء إلينا "اجوود الكيميائية" والبيولوجية في مركز لتقاسم والبلازميدات المستخدمة للتعبير عن وتنقية أبراكس والبروتينات ريفاكس، براندي دورسي للدعم التقني لعزل السلطة الفلسطينية ملزمة الببتيدات، "قو تشين" الحصول على الدعم الفني من تجارب أولية لعزل الببتيدات ملزمة أبراكس، والدكتور تيريل جيسيكا لإجراء مناقشات مفيدة بشأن هذه المخطوطة.

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

بيوبانينج البكتيرية عرض المكتبات نهجاً ناجحاً لعزل الكواشف تقارب، والببتيدات توفر بديلاً مفيداً للأجسام المضادة للاعتراف عندما تلزم معايير محددة، مثل الاستقرار في البيئات المتطرفة. تم تبسيط بيوبانينج من هذه المكتبات باستخدام الأساليب أوتومكس الموصوفة هنا، ومنصة أوتومكس متاحة تجارياً وتمتد هذه التكنولوجيا إلى جمهور أوسع نطاقا بكثير. بالمقارنة مع التقليدية التناوب MCS/نظام مراقبة الأصول الميدانية عرض أساليب الفرز للبكتيريا المكتبات، وأساليب أوتومكس أقل تكلفة نظراً لأنها لا تتطلب الاستثمار في أداة نظام مراقبة الأصول الميدانية أغلى قادرة على فرز وعزل الخلايا ملزمة، بدلاً من نوع سيتوميتير تدفق المستخدمة هنا، وهو قادر على تحليل 14فقط. وتشمل الخطوات الحاسمة لنجاح بيوبانينج من أوتومكس فصل البرنامج اختيار، السلبية الفرز ضد الصليب كواشف مختبر المحتملة الحد من إيجابيات كاذبة، رصد إثراء المكتبة باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية لتحديد متى يتم إيقاف بيوبانينج، و تحليل الذكية مجموعة المرشحين لتجنب الفحص مرهقة لمئات مرشحين.
تبين الأمثلة الموضحة هنا بيوبانينج نجاح المكتبة عرض البكتيرية المختار لهدفين منفصلين، السلطة الفلسطينية وعابر، على الرغم من أن مع استراتيجيات تحليل مختلف قليلاً بسبب الاختلافات في تسلسل الببتيد لكل تجمع من المرشحين بعد أربع جولات من بيوبانينج. السلطة الفلسطينية الأمر أكثر وضوحاً، مع تحليل تسلسل إظهار اتجاهات واضحة من تسلسل الببتيد التي تتكرر مرة واحدة على الأقل في المستعمرات 144. وكان هذا وحدة ما يكفي لتحديد تسلسل توافق آراء للسلطة الفلسطينية للهدف، وتلك المستعمرات التي توافق الآراء الواردة أو تسلسل مماثلة كانت أفضل المرشحين من حيث نسبة ملزمة للسلطة الفلسطينية مقابل ملزمة لمراقبة سلبية streptavidin. ومع ذلك، هذا لن تكون دائماً القضية. لهدف عابر، تسلسل 100 المستعمرات أدت إلى تسلسلات مكررة خمسة لكن الاتجاه السائد في هذه التسلسلات كان أقل وضوحاً، عدا ميل إلى تحتوي على بقايا الأحماض الأمينية العطرية وحامض الأسبارتيك أو الهليونين. توقع "توافق الآراء" من تسلسلات مكررة فقط يمكن أنتجت واختبرت لتقارب لعابر، ولكننا منذ أية تسلسلات للأصل الوارد هذا التسلسل الدقيق إلى توافق في الآراء، عاد إلى قائمة المستعمرات متسلسلة ولاحظ أن الأخرى المرشحين التي كانت أكثر اتجاهات مشتركة مع بعضها البعض. وفي الواقع، الوارد المستعمرات اثنين تسلسل مماثلة "توافق الآراء" من يكرر وحدها، (فودتوف بدلاً من فواوف)، الذي كان في نفس الاتجاه من بقايا التربتوفان، فينيلالاناين، وحمض الأسبارتيك ولكن مع تباعد مختلفة. وكان من هذه الببتيدات تسلسل مكرر، واحد لم يكن. هذه تسلسلين، جنبا إلى جنب مع تسلسل ثالث يحتوي على متغير مماثلة، كانت من بين الاضبارات أعلى 5 اختبارها من حيث تقارب لعابر. أعلى الموثق العام، A05 AX، كما عرض اتجاهات مماثلة. وتبين النتائج لعابر في بعض الأحيان أن نهج الذي التبديل عدة مرات بين تحليل تسلسل وتحليل النسب وخصوصية المطلوبة، وفقا للهدف الذي تم اختياره. وتبين النتائج لهدف عابر أيضا مستوى الخصوصية التي يمكن أن يتحقق عبر بروتين مشابهة جداً (ريف 1،،15).
وكانت البرامج أوتومكس التي اخترتها لدراساتنا بوسيلدس وبوسيلد، وهما على حد سواء لاختيار الخلايا الهدف المسمى بتردد منخفض، أقل من 5% السكان الأولية إيجابية. وفي كلتا الحالتين، تمرير الخلايا من خلال عمودين المغناطيسية. في حالة البرنامج بوسيلدس، ومع ذلك، الخلايا يمر ببطء أكثر العمود الأول زيادة التعرض الوقت 41. بالإضافة إلى وصف البرنامج المقدمة من الشركة المصنعة للجهاز التجاري أوتومكس (انظر الجدول المواد) 41، وقد تم اختيار هذه البرامج بعد إجراء مقارنة أولية للعديد من البرامج المحتملة. كل برنامج القدرة على تجنب سحب المغلوطة من ثقافة متجانسة من خلايا المراقبة السلبية، وعزل binder معروفة بنجاح إلى هدف لمصلحة من ثقافة مختلطة التي تحتوي على خلايا المراقبة السلبية ارتفعت مع تناقص وتمت مقارنة النسبة المئوية للموثّق المعروفة،. إذا كان الانحراف إلى حد كبير من التطبيقات الموضحة هنا، مقارنة مماثلة قد تكون مفيدة في اختيار البرنامج للتطبيق الجديد. ومع ذلك، سبق نشرها نتائج المقارنة بين هذه البرامج اثنين (بوسيلد وبوسيلدس) لعزل الكواشف تقارب الببتيد للسلطة الفلسطينية أظهرت أن استخدام أي من هذه البرامج لكل أربع جولات من بيوبانينج أدى إلى عزلة الببتيدات مع مماثلة تقارب وخصوصية للسلطة الفلسطينية، وتحديد توافق وكسكفتك. الاختلافات الرئيسية هي أن بوسيلد، بمعدل تدفق أسرع، فرز أكثر سرعة وملزمة تقارب للهدف ولذلك أعلى بعد جولتين اثنتين فقط من بيوبانينج، في حين تستخدم بوسيلدس أدى إلى تسلسل فريد أكثر بعد أربع جولات من بيوبانينج 14. التعلم من هذا، تم تغيير الاستراتيجية قليلاً عند بيوبانينج لعابر الببتيدات ملزمة لإدماج كل الفوائد: بوسيلدس كانت تستخدم للجولة 1 لإتاحة مزيد من الوقت التعرض خلال هذه الخطوة الحاسمة حيث التنوع أعلى، لكن بعد ذلك كان تحول البرنامج إلى بوسيلد للعزلة أسرع من موثقات تقارب أعلى خلال جولات 2-4 1،15. وبدأ هذا أن تكون مثالية لعابر، لا سيما وأن نمفي وربط نسبة كلاهما أعلى بالنسبة لعابر الفرز 4 جولة بالمقارنة مع السلطة الفلسطينية فرز 4 جولة مع البرنامج أما (الشكل 2 و الرقم 3 وسركيس et al. عام 2015 14)، ولكن سيلزم إجراء مقارنة مباشرة باستخدام استراتيجية واحدة مقابل أخرى مع نفس الهدف لمقارنة أكثر حسما. البرنامج الذي هو أفضل لتطبيق معين قد تعتمد على الهدف الفردي والمكتبة الفرز المستخدمة ومستوى التعبير الببتيد الذي يتحقق مع أي تغيير للشروط الموضحة هنا.
لم تناقش هنا النتائج المحتملة من بيوبانينج مع المواد الأحيائية واللااحيائيه، ولكن أيضا أننا استخدمنا نفس المكتبة عرض البكتيرية بيوبانينج ضد مجمع الألومنيوم 2. لم يتم تنفيذ هذه الدراسة باستخدام أوتومكس، ولكن يمكن إنجازه بدراسات مماثلة باستخدام أوتومكس إذا المواد متاحة، أو يمكن المغلفة على أو مترافق بحبه مغناطيسية. في معظم الدراسة الألومنيوم، وتحليل الأحماض الأمينية الفردية ونمذجة هيكل الثانوية كان مفيداً في فهم ما كان يقود تقارب ملزم من الببتيدات المعزولة، ﻷن أي تسلسل توافق العزم 2. حتى مع الأهداف البيولوجية، وهذا قد يكون المطلوبة لفهم ما هو يقود تقارب ملزمة لبعض الأهداف، ولهذا السبب يتضمن جدول البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة الماكرو "eCPX_Sequencing" علامة تبويب مع تحليل التردد بقايا الفردية. إذا تعتبر أية تسلسلات مكررة بالإضافة إلى عدم وجود توافق في الآراء، وبقايا التردد يظهر أي نمط، ومع ذلك، قد تكون أنواع أخرى من التحليل المطلوبة. بالإضافة إلى ذلك، فرز جولات أخرى قد تكون ضرورية لتجنب فحص عدد أكبر بكثير من المرشحين لأسفل-انتقاء أولئك مع تقارب كافية إلى الهدف المنشود.
مع زيادة توافر التسلسل الجيل القادم، يمكن إجراء دراسة أكثر دقة لتحديد المرشحين الأكثر تبشيرا بالنجاح قبل اختبار تقارب وتحديد مدى تخصيب اليورانيوم بعد كل جولة من بيوبانينج. لكن، تسلسل الانتقال إلى الخطوة تحليل ملزمة قد تحتاج إلى إعادة إنشاء بواسطة الاستنساخ، إذا لم تكن تردد عالية بما يكفي لعزل بسهولة مع تسلسل مستعمرة الروتينية لعشرات أو مئات من المستعمرات. كما تقدم هذه التكنولوجيا، أصبحت أقل تكلفة وأكثر روتينية، وخصوصا مع وجود خيار لعزل مستعمرة، من المرجح أن تكون أفضل طريقة لتحليل البيانات بيوبانينج. قد تؤدي إلى توضيح تسلسل الطريقة الفردية، ومكتبة بأكملها، وتتطور. بالإضافة إلى ذلك، قد تتحول البكتيريا في مكتبة الفرز مع مرور الوقت، الذي يمكن أن التحيز فرز نحو الخلايا مع أسرع معدلات النمو أو البكتيريا التي أوفيريكسبريس البروتينات الجينوم قادرة على ربط مادة حتى بدون عرض التعبير سقالة والببتيد، مثيل. ولهذا السبب، وبمجرد ظهور المرشحين الواعدين، أنها تستحق عزل بلازميد الحمض النووي، ريترانسفورمينج الطازجة كولاي، ويؤكد الببتيد الربط عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية. في حالة التخطيط لاستخدام الببتيد في تنسيق الخلية الحرة، ينبغي أيضا تقييم تقارب الببتيد مجاناً. على سبيل المثال، الببتيد تقارب الكواشف اكتشافها من خلال عرض البكتيرية للهدف سيب أنتجت صناعيا خارج الخلية وتم تحليلها بطرق أكثر تقليدية مثل الإنزيم إيمونوسوربانت المرتبط بالانزيم (ELISA)، وفي الخلية (عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية) وخارج الخلية وقورنت تقارب (عن طريق أليسا) استخدام ال قدك يحدده كلا أساليب 7.
على الرغم من أن يجعل قوة التفاعل streptavidin البيوتين استراتيجية مثالية لالتقاط الهدف البروتين والببتيدات المنضم، يمكن تعديل هذا الإجراء لاستراتيجيات أخرى لالتقاط. نجحت اقتران مباشر من البروتين لحبات مغناطيسية، مثل الإيبوكسي وحمض الكربوكسيلية الخرز، ويزيل خطوة ملزمة. بيد الحجز المباشر قد يعيق إمكانية ربط المواقع بطريقة محددة أو غير محددة، اعتماداً على استراتيجية المرفق. ميزة إضافية لاستخدام الخرز ستريبتافيدين هو أن أهداف أقل بروتين مستقر يمكن أن تكون طازجة بيوتينيلاتيد في 30 دقيقة أو تخزينها مجمدة، إذا لزم الأمر، في حين تميل إلى تتطلب الحضانة أطول مع البروتين العابرة للربط الخرز أنفسهم وهي عموما المخزنة في 2-8 درجة مئوية. تستهدف تركيز البروتين بيوتينيلاتيد انطلاق المقترح هنا، 600 نانومتر، كانت ناجحة بالنسبة لأهداف متعددة، ولكن قد يكون من الممكن عزل الببتيد التقاط الكواشف مع زيادة تقارب إذا قل هذا التركيز. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تمتد إلى هذا الأسلوب وتعديل لمكتبات أخرى عرض البكتيريا والكائنات الحية الأخرى. على سبيل المثال، يمكن إجراء هذه الخطوات في غياب الأكسجين للاستخدام مع اللاهوائيات، أو في بيئات أخرى للاستخدام مع استخداماتها لعزل الببتيدات مع خصائص فريدة من نوعها. الببتيدات و/أو توافق الآراء مصممة لهدف محدد من الفائدة يمكن أن يحتمل أن تستخدم في الخلية كالعيش المادي، أو المنتجة صناعيا خارج الخلية. يمكن أن يكون كذلك نضجت الببتيدات المنتجة صناعيا لتطوير تقارب أكبر وأقوى عوامل التقاط حفزت البروتين (PCC) للاستخدام في أجهزة الاستشعار، أو لتطبيقات أخرى حيث عادة ما تستخدم الأجسام المضادة للربط أو الاعتراف 38،55. يمكن أيضا استخدام النمذجة الجزيئية للمساعدة في تحديد ملزم موقع الببتيد مع هدفه، كما أنجز مؤخرا الببتيدات ملزمة عابر وتوافق الآراء المذكورة في الشكل 5 1. عموما، بيوبانينج عرض البكتيرية المكتبات الكاشفات تقارب الببتيد بديل سريعة وواضحة وقوية لإنتاج أجسام مضادة للتعرف والكشف عن أهداف البروتين، وهذا بيوبانينج شبه الآلي النهج أسفر عن نتائج موثوق بها مع الآن الوصول إلى التطبيقات.

بيوبانينج وأسلوب ثبت لتقارب كاشف الاكتشاف، مع البكتيريا عرض المكتبات مصدر مناسب الببتيد تقارب الكواشف 1،2،3،،من45، 6،،من78،9،10،11،،من1213،14، 15،16،17،،من1819،20،21،،من2223، 24. وعلى نحو مماثل بالعاثية عرض 25،26 والخميرة عرض 27،28، الببتيدات يتعرض على سطح الخلية، وهي متاحة لربط الأهداف الحيوية وغير الحيوية على حد سواء، مع هذه التفاعلات مدفوعا بالعمود الفقري الببتيد وخصائص فريدة من نوعها من جانب سلاسل الأحماض الأمينية 29. على عكس العرض بالعاثية، البكتيريا نفسها ذاتية وتحتوي على جميع المواد الوراثية اللازمة للعرض دون شطف بالعاثية منضم وتكرار الإصابة من الخلايا. على النقيض من الخميرة العرض، عرض البكتيرية أسرع بسبب السريع (20 دقيقة تقريبا 30) مضاعفة الوقت من الإشريكيّة القولونية. يمكن أن تنتج الكواشف تقارب الببتيد الناتجة خارج الخلية لاستخدامها في مجموعة متنوعة من الاستشعار منصات 16،،من1726 ولديها إمكانات لاستخدامها كمواد المعيشة عند عرضها في الخلية 2 , 31 , 32-بالمقارنة مع الأجسام المضادة للاعتراف بأهداف محددة، الببتيدات أصغر بكثير، وأكثر مرونة، ويمكن بسهولة التلاعب الببتيد عرض مكتبات على مستوى الحمض النووي لتجنب الأحماض الأمينية المحددة، مثل سيستين 33 . الببتيدات يستغلون متزايدة علاجات 34،،من3536 والتطبيقات الأخرى حيث عادة ما تستخدم الأجسام المضادة نظراً لسهولة اكتشاف، واستنساخه الاصطناعية (خارج الخلية ) إنتاج وصيانة فائقة الأداء في البيئات المتطرفة، توفير كاشف وظيفية حتى بعد التعرض لدرجة الحرارة العالية أو التخزين على المدى الطويل دون التبريد 37،38. القدرة على التغلب على سلسلة التبريد لتخزين المواد الكاشفة باهتمام خاص إلى وزارة الدفاع، على سبيل المثال، التي يجب أن تعمل في البيئات المتطرفة. وكان الثبات الحراري لذلك سمة مرغوب فيه الكاشفات تقارب الاعتراف بالأهداف المختارة التي تعطي كأمثلة في هذه المخطوطة.
في الآونة الأخيرة، أصبحت مكتبات العرض البكتيري بيوبانينج أكثر مباشرة وموثوق بها باستخدام الخلية شبه الآلي المغناطيسي المنشط الفرز (أجهزة ماكينتوش أو الإشراف) أساليب 9،،من1439. أثبتت هذه الأساليب للأهداف البيولوجية باستخدام عدة مماثلة الفرز منصات مع مزايا مختلفة، بما في ذلك متوفرة تجارياً الآلي المغناطيسي تنشيط الخلية فرز الصك (أوتوماكس أو أوتومكس) (انظر الجدول المواد) 1،،من1415 وأكثر تخصصا من الأجهزة الذي أرفق العينة في خرطوشة المتاح 7،9 أو رقاقة 39، مواصفات قيماً لاستخدامه مع الكائنات الحية أو السموم التي هي 2 مستوى السلامة الأحيائية (BSL-2) أو أعلى7. يمكن توسيع نطاق هذه الطرق شبه الآلية لفرز الببتيدات قادرة على ربط المواد الأحيائية واللااحيائيه إذا المواد المغناطيسية، أو لديها القدرة على أن تكون مغلفة على حبة مغناطيسية، و للاستخدام مع الكائنات المختلفة (مثل البكتريا اللاهوائية) إذا الفرز وتتغير ظروف النمو. بالإضافة إلى فرز مكتبات العرض البكتيرية، الصك أوتومكس التجارية المستخدمة هنا قد استخدمت أيضا في جزء منه للخطوات الأولى لاكتشاف أجزاء جسم واحد-السلسلة البشرية المعروضة على سطح الخميرة، متبوعاً بمزيد من العزلة استخدام الفلورية تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) 40. المزايا الأساسية لأتمتة شبه انخفضت الفرز الوقت والجهد، وأكثر قوية واستنساخه بالقضاء على خلايا غير منضم من الخرز المغناطيسي أثناء خطوات الغسيل، مما يؤدي إلى الحد من إيجابيات كاذبة، وجولات الفرز المطلوبة أقل، وأقل تحليل تيار أسفل تعقيداً 9،14. في حالة الصك أوتومكس التجارية، وهناك العديد من البرامج المحملة مسبقاً الذي قد يكون الحل الأمثل لتطبيقات مختلفة، مثل السلبية قبل الفرز (استنزاف)، وإعطاء الأولوية للنقاء، والتقليل من حجم العينة النهائي، وزيادة أو تقليل الحساسية لعزل خلايا نادرة 41.
أن التركيز في هذا العمل هو لإثبات منهجية بيوبانينج مكتبة عرض البكتيريا باستخدام أداة أوتومكس المتاحة تجارياً، وأن يشرح عملية التفكير في تطبيقها في تحليل والتقليل إلى أدنى حد من مجموعة المرشحين في الناتج من أجل تسهيل تمديد لتطبيقات أخرى. عرض مكتبة المستخدمة هنا (انظر الجدول للمواد) 12،13 يحتوي على حوالي 109-1011 15-مير فريدة الببتيدات عرضها عبر نسخة معدلة من البروتين البكتيري الغشاء الخارجي أومبكس في الطبيعة غير المقيد في سطح الخلية، التي من المتوقع أن يكون ممثل الببتيد مجاناً في الحل إذا المنتجة صناعيا. بالإضافة إلى ذلك تتضمن هذه السقالة البروتين ببتيد مراقبة إيجابية P2X في ج-المحطة لرصد التعبير عن طريق الربط إلى مني يبيت. بيد مكتبة تم شراؤه أو رواية مع تنوع مناسب وغيرها من الخصائص اللازمة للتطبيق المحدد المطلوب أن تعمل المثل مع هذا الإجراء بيوبانينج، على الرغم من بعض التغييرات الطفيفة قد تكون مطلوبة. ويتضح في الشكل 1تخطيطي لهذا البروتوكول بيوبانينج. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون البروتوكول يتكيف مع الآخر الآلي منصات الفرز المغناطيسي واستراتيجيات أخرى للفرز. الفرز المغناطيسي اليدوي مع مغناطيس benchtop تم بنجاح أثبت، أن كان ذلك مع تحليل المتلقين للمعلومات أكثر تعقيداً ومضيعة للوقت المطلوب نظراً لزيادة المغلوطة 14، ومع ذلك يوفر خياراً بديلاً تتوفر خطوات أوتومكس إذا لا خلية المغناطيسي الآلي الفرز الجهاز.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-545</td>
			<td>Automated cell separator for use with magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth, Miller (LB)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-500</td>
			<td>Thickening/geling agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library</td>
			<td>Cytomx Therapeutics</td>
			<td>N/A; http://cytomx.com/contact/</td>
			<td>On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arabinose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3256-500G</td>
			<td>Sugar, for induction of protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0780-10L</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI21327</td>
			<td>Adds biotin molecule to primary amines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Biotin Quantitation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI28005</td>
			<td>Ensures biotin molecule is covalently bound to protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65601</td>
			<td>Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td>Protein, used as blocking agent for non-specific binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Sugar, for growth and impeding inducible protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ypet Mona</td>
			<td>UCSB and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488 NHS Ester</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46403</td>
			<td>For conjugating protein target to fluorophore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S866</td>
			<td>Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSFlow</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>342003</td>
			<td>Buffer for running FACS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-021-101</td>
			<td>For MACS Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Running Buffer &#8211; MACS Separation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Washing Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-092-987</td>
			<td>For autoMACS instrument maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E505-4L</td>
			<td>Decontamination of autoMACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6279-1L</td>
			<td>For bacterial freezer stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill 15 rack</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-952</td>
			<td>For MACS Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview</td>
			<td>For assessment of peptide binding to target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>659523</td>
			<td>For assessment of peptide binding to target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A13346</td>
			<td>Bench top cell separator for use with magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Sequencing</td>
			<td>Genewiz</td>
			<td>N/A; https://www.genewiz.com/</td>
			<td>DNA and Colony Sequencing Services</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400</td>
			<td>For use with sequence analysis macro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrax Protective Antigen (PA)</td>
			<td>List Biological Laboratories, Inc.</td>
			<td>171</td>
			<td>Target protein used as example for representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrax</td>
			<td>ECBC and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rivax</td>
			<td>ECBC and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated biopanning of bacterial display libraries for peptide affinity reagent discovery and analysis of resulting isolates

بيوبانينج البكتيرية عرض المكتبات أسلوب ثبت لاكتشاف كاشف تقارب الببتيد للاعتراف بالأهداف الحيوية وغير الحيوية على حد سواء. الببتيد تقارب الكواشف يمكن استخدامها لتطبيقات مماثلة للأجسام المضادة، بما في ذلك الاستشعار والتداوي، ولكن أكثر قوة وقادرة على أداء في أكثر البيئات المتطرفة. تخصيب محددة من الببتيد القبض على عملاء لبروتين هدفا لمصلحة تعزيز استخدام أساليب الفرز شبه الآلية التي تحسين الربط وتغسل خطوات وبالتالي تقليل حدوث موثقات إيجابية كاذبة. أسلوب فرز شبه إليه الموصوفة هنا للاستخدام مع تجاري الآلي المغناطيسي تنشيط خلية الفرز الجهاز مع عرض بكتيرية غير مقيد الفرز مكتبة معربا عن الببتيدات عشوائية 15-مير. مع تعديلات طفيفة، هذه الأساليب قابلة للتمديد إلى الآخر الآلي الأجهزة وغيرها من المكتبات الفرز والكائنات الحية الأخرى. هدف أساسي من هذا العمل هو تقديم منهجية شاملة وشرح عملية التفكير تطبيقها في تحليل والتقليل إلى أدنى حد من مجموعة المرشحين الناتجة. هذه التقنيات تشمل تحليلاً للربط على الخلية باستخدام خلية تنشيط fluorescence الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)، لتقييم تقارب وخصوصية أثناء الفرز، وفي المقارنة بين المرشحين الأفراد، وتحليل الببتيد تسلسل لتحديد الاتجاهات و توافق الآراء تسلسلات لفهم وتحسين يحتمل أن تكون النسب إلى وخصوصية لهدف الفائدة.

Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates at JoVE.com

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

بيوبانينج البكتيرية عرض المكتبات أسلوب ثبت لاكتشاف ببتيد تقارب الكواشف، بديلاً قويا للأجسام المضادة. وقد تبسيط أسلوب الفرز شبه الآلي هنا بيوبانينج لتقليل حدوث إيجابيات كاذبة. نحن هنا لتوضيح عملية التفكير والتقنيات المطبقة في تقييم المرشحين والتقليل من تحليل المتلقين للمعلومات.

بيوبانينج شبه الآلي المكتبات عرض البكتيريا الببتيد تقارب كاشف اكتشاف وتحليل يعزل الناتجة

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

طريقة لتحديد الصغيرة جزيء مثبطات التفاعل البروتين البروتين بين HCN1 وTRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

العرض الداخلية غشاء البكتيريا لفحص مكتبة من الأجسام المضادة شظايا

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

تصميم عالية تقارب الأجسام المضادة مستضد حركية ملزم باستخدام أربعة منصات جهاز الاستشعار البيولوجي

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

سهل التلاعب بأبنية في الهلاميات المائية المستندة إلى البروتين لتطبيقات ثقافة الخلية

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

تحليل هيستون الأجسام المضادة خصوصية مع ميكروأرس الببتيد

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 في 1: انجذاب تطهير لتحليل مواز للبروتين-بروتين والبروتين-المستقلب المجمعات من خطوة واحدة

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

البروتين خارج الخلية ميكرواري تكنولوجيا للكشف عن ارتفاع الإنتاجية منخفضة تقارب مستقبلات-يجند التفاعلات

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

في الوقت الحقيقي ، وشبه التلقائي قياس الفلورسنت من الدرجة الهوائية السائل سطح المجري الجوي للخلايا الاساسيه الإنسان الظهاريه

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

غشاء الخلية الأصلية نظام الجسيمات النانوية لتحليل التفاعل البروتينية الغشاء

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases

استخدام شاشة Phage لتطوير المغيرات المتغيرة في كل مكان ل E3 Ligases

Ubiquitin is a small 8.6 kDa protein that is a core component of the ubiquitin-proteasome system. Consequently, it can bind to a diverse array of proteins ...