Name: semi-automated biopanning of bacterial display libraries for peptide affinity reagent discovery and analysis of resulting isolates
Uploaded: 2017-12-06T12:30:00
Duration: 13 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende støtten af US Army Research Laboratory (ARL) postdoc Fellowship Program, administreret af Oak Ridge associeret universiteter gennem en kontrakt med ARL, takket være udnævnelsen af Dr. Justin P. Jahnke. Resterende midler blev leveret af sensorer og elektron enheder direktorat på ARL. Forfatterne vil også gerne takke Daugherty Lab på UCSB til deling af bakteriel display bibliotek og information til kloning YPet Mona reagens, Dr. Bryn Adams for støtte i kloning YPet Mona reagens på ARL, Dr. Joshua Kogot for hans første arbejde på og uddannelse i biopanning af bakteriel display biblioteker, Alena ro i Edgewood kemiske og biologiske Center for deling plasmider bruges til at udtrykke og rense abrax og rivax proteiner, Brandi Dorsey for teknisk støtte til dyrkning af PA bindende peptider, Qin Guo for teknisk support af foreløbige forsøg til isolation af abrax bindende peptider, og Dr. Jessica Terrell til nyttige drøftelser om dette håndskrift.

Forfatterne har intet at videregive

Biopanning bakteriel display biblioteker har været en succesfuld tilgang til isolering af affinitet reagenser, og peptider tilbyder et nyttigt alternativ til antistoffer for anerkendelse, når bestemte kriterier er nødvendige, såsom stabilitet i ekstreme miljøer. Biopanning af disse biblioteker er blevet strømlinet ved hjælp af autoMCS metoder beskrevet her, og en kommercielt tilgængelig autoMCS platform udvider denne teknologi til et meget bredere publikum. I forhold til traditionelle skiftevis MCS/FACS sortering metoder for bakteriel display biblioteker, autoMCS metoder er billigere, fordi de ikke kræver investering i en dyrere FACS instrument i stand til at sortere og isolere de bundne celler, i stedet for typen af flow Flowcytometret, der bruges her, som kun er i stand til at analyse 14. Kritiske trin til vellykket biopanning af autoMCS omfatter adskillelse program udvalg, negative sortering mod potentielle cross-reaktanter at mindske falske positiver, overvågning bibliotek berigelse ved hjælp af FACS til at bestemme, hvornår de skal stoppe biopanning, og Smart analyse af kandidatdatabase at undgå besværlige screening af hundredvis af ansøgere.
Eksemplerne beskrevet heri viser vellykkede biopanning af det valgte bakterielle display bibliotek for to separate mål, PA og abrax, men med lidt forskellige analyse strategier på grund af forskelle i peptid sekvenser for hver pulje af kandidater efter fire runder af biopanning. PA var det mere ligetil med Sekvensanalyse viser klart tendenserne fra de peptid sekvenser, der gentages mindst en gang i 144 kolonier. Dette var alene nok til at bestemme en konsensus sekvens PA Target, og disse kolonier, der indeholdt konsensussen eller en lignende sekvens var de bedste kandidater med hensyn til forholdet mellem binding til PA versus binding til streptavidin negativ kontrol. Dette vil dog ikke altid være tilfældet. Abrax Target, sekventering 100 kolonier førte til fem gentagne sekvenser men tendensen i disse sekvenser var mindre klart, end en tendens til at indeholde aromatisk aminosyrerester og aspartinsyre eller asparagin. Den forudsagte "konsensus" fra de gentagne sekvenser kun kunne have været produceret og testet for affinitet til abrax, men da ingen overordnet sekvenser indeholdt den nøjagtige konsensus sekvens, vi vendte tilbage til listen over sekventeret kolonier og observeret, at andre kandidater, der havde flere tendenser til fælles med hinanden. Faktisk indeholdt to kolonier en lignende sekvens til "konsensus" fra det gentager alene, (FWDTWF i stedet for FWAWF), der havde den samme tendens af tryptofan og fenylalanin aspartinsyre rester, men med forskellig afstand. En af disse peptider var en gentaget sekvens, den ene var ikke. Disse to sekvenser, sammen med en tredje sekvens, som indeholder en lignende variant, var blandt de top 5 bindemidler testet med hensyn til affinitet for abrax. Den øverste bindemiddel samlede, AX-A05, vises også lignende tendenser. Resultaterne for abrax viser, at en tilgang, som veksler flere gange mellem Sekvensanalyse og affinitet og specificitet analyse undertiden vil være påkrævet, afhængigt af den valgte mål. Resultaterne for abrax mål viser også grad af specificitet, der kan opnås over en meget lignende protein (rivax 1,15).
AutoMCS programmer valgt til vores undersøgelser var Posselds og Posseld, som begge er til positiv udvælgelse af mærket målceller med lav frekvens, mindre end 5% af den oprindelige befolkning. I begge tilfælde passerer celler gennem to magnetiske kolonner. I forbindelse med programmet Posselds dog passere celler langsommere gennem den første kolonne til at øge eksponeringen tid 41. Ud over programmet beskrivelser af fabrikant af den kommercielle autoMCS enhed (Se Materialer tabel) 41, disse programmer blev valgt efter en indledende sammenligning af flere potentielle programmer. Hvert program evne til at undgå at trække ud af falske positiver fra en homogen kultur af negativ kontrol celler og med held isolere en kendt bindemiddel til et mål af interesse fra en blandingskultur, med negative kontrol celler spiket med en faldende procentdel af den kendte bindemiddel, blev sammenlignet. Hvis væsentligt afviger fra de programmer, der er beskrevet her, kunne en lignende sammenligning være nyttigt i programmet udvalg for det nye program. Dog tidligere offentliggjorte resultater at sammenligne disse to programmer (Posseld og Posselds) til isolation af peptid affinitet reagenser for PA viste, at bruge et af disse programmer for alle fire runder af biopanning førte til isolation af peptider med lignende affinitet og specificitet for PA og bestemmelse af WXCFTC konsensus. De væsentligste forskelle var at Posseld, med dens hurtigere strømningshastighed, sorteret hurtigere og bindende affinitet for målet var derfor højere efter kun to runder af biopanning, mens ved hjælp af Posselds førte til flere unikke sekvenser efter fire runder af biopanning 14. lære af dette, strategien blev ændret lidt når biopanning for abrax bindende peptider at indarbejde begge fordele: Posselds blev brugt til runde 1 for at give mere eksponeringstid under dette kritiske trin hvor mangfoldighed er højest, men så den programmet var skiftet til Posseld for hurtigere isolering af de højeste affinitet bindemidler under runder 2-4 1,15. Dette syntes at være ideel til abrax, især da nMFI og procent bindende var begge højere for abrax sortering runde 4 i forhold til PA sortering runde 4 med enten programmet (figur 2 og figur 3 og Sarkes et al. 2015 14), men en direkte sammenligning ved hjælp af en strategi kontra den anden med den samme mål ville være behov for en mere afgørende sammenligning. Hvilket program er bedst for et bestemt program kan afhænge af den individuelle mål, sortering biblioteket anvendes og niveau af peptid udtryk, der er opnået med nogen ændring i betingelserne beskrevet her.
Ikke diskuteret her er potentielle resultater fra biopanning med abiotiske materialer, men vi har også brugt den samme bakterielle display bibliotek for biopanning mod bulk aluminium 2. Denne undersøgelse blev ikke udført ved hjælp af autoMCS, men lignende undersøgelser kan opnås ved hjælp af autoMCS, hvis materialet er tilgængelig på, eller kunne belagt på eller konjugeret med et magnetisk bead. I bulk aluminium undersøgelse var individuelle aminosyre analyse og sekundær struktur modellering nyttige i at forstå, hvad kørte bindingsaffinitet for de isolerede peptider, da ingen konsensus sekvens var fast besluttet på 2. Selv med biologiske mål, kan dette være nødvendigt at forstå, hvad der driver det bindende affinitet for nogle mål, hvilket er grunden til regnearket genereret fra makroen "eCPX_Sequencing" indeholder en fane med enkelte rester frekvens analyse. Hvis ingen gentagne sekvenser ses ud over manglen konsensus, og rest frekvens viser ingen mønster, men kan andre typer af analyse være påkrævet. Derudover kan yderligere sortering runder være nødvendigt at undgå screening et meget større antal kandidater til down-udvalg af dem med tilstrækkelig affinitet til det ønskede mål.
Med den øgede tilgængelighed af næste generation sequencing, kunne en mere grundig undersøgelse udføres til at bestemme de mest lovende kandidater før testning affinitet og at bestemme omfanget af berigelse efter hver runde af biopanning. Sekvenser går videre til bindende analyse trin kan dog skal gendannes ved kloning, hvis de ikke er af tilstrækkelig høj frekvens til let isolere med rutinemæssig koloni sekventering af snesevis eller hundredvis af kolonier. Som denne teknologi forskud, bliver billigere og mere rutine, og især med mulighed for kolonien isolation, vil det sandsynligvis være den bedste måde at analysere biopanning data. Det kan føre til udredning af de måde enkelte sekvenser, og hele biblioteket, udvikles. Derudover kan bakterierne i biblioteket sortering mutere over tid, som kunne skævhed sortering mod celler med hurtigere vækst priser eller bakterier, der overexpress genomisk proteiner stand til at binde et materiale selv uden display stillads og peptid udtryk, for instans. Derfor, når lovende kandidater opstår, er det værd at isolere plasmid DNA, retransforming friske E. coli, og bekræfter peptid bindende via FACS. Hvis planlægger at bruge peptid i en celle-fri format, vurderes også affinitet til den gratis peptid. For eksempel, var peptid affinitet reagenser opdaget gennem bakteriel display for target SEB syntetisk fremstillet off-celle og analyseret ved mere traditionelle metoder såsom enzym-forbundet immunosorbant assay (ELISA), og på celle (via FACS) og off-celle (via ELISA) affinitet blev sammenlignet ved hjælp af Kds bestemmes af begge metoder 7.
Selv om styrken af biotin-streptavidin interaktion gør det en ideel strategi for erobringen af protein mål og bundne peptider, kan denne procedure ændres til andre fange strategier. Direkte kobling af protein til magnetiske perler, som epoxy og carboxylsyre perler, har været en succes og fjerner en bindende trin. Dog kan direkte udlæg hindre potentielle bindingssteder i en specifik eller ikke-specifik måde, afhængigt af vedhæftet fil strategi. En yderligere fordel ved at bruge streptavidin perler er at mindre stabil protein mål kan være frisk biotinylated i 30 min eller opbevares frosset, hvis det er nødvendigt, mens perlerne, selv har tendens til at kræve længere inkubering med protein for danne tvaerbindinger og er generelt opbevares ved 2-8° C. Den foreslåede start koncentration af biotinylated protein målrette her, 600 nM, er det lykkedes for flere mål, men det kan være muligt at isolere peptid capture reagenser med øget affinitet, hvis denne koncentration er reduceret. Denne metode kan desuden udvidet til at omfatte og modificeret til andre bakterielle display biblioteker og andre organismer. For eksempel, kan disse trin udføres i mangel af ilt til brug med anaerober eller i andre miljøer til brug med extremophiles til at isolere peptider med unikke egenskaber. Peptider og/eller konsensus bestemmes for et bestemt mål af interesse kan være potentielt bruges på celle som et levende materiale, eller fremstilles syntetisk ud-celle. Syntetisk fremstillet peptider kan yderligere modnet for udviklingen af endnu højere affinitet og mere robust Protein katalyseret Capture (PCC) agenter til brug i sensorer, eller for andre applikationer, hvor antistoffer vil typisk blive brugt til bindende eller anerkendelse 38,55. Molecular modeling kan også bruges til at hjælpe med at bestemme bindende placering af peptid med sit mål, som for nylig blev uropført den abrax bindende peptider og konsensus fremgår af figur 5 c 1. Samlet set biopanning bakteriel display biblioteker for peptid affinitet reagenser er en hurtig, enkel og kraftfulde alternativ til produktion af antistoffer for anerkendelse og påvisning af protein mål, og denne semi-automatiske biopanning tilgang har produceret pålidelige resultater med vidtrækkende applikationer.

Biopanning er en gennemprøvet teknik for affinitet reagens opdagelse, med bakteriel display biblioteker en bekvem kilde for peptid affinitet reagenser 1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24. På samme måde til phage display 25,26 og gær vise 27,28, peptider er udsat på celleoverfladen og er tilgængelige til at binde til både biotiske og abiotiske mål med disse interaktioner drevet af både peptid rygraden og de unikke egenskaber af aminosyre sidekæder 29. I modsætning til phage display, bakterier, selv er selvkopierende og indeholde alle genetiske materiale kræves for display uden eluering af bundne phage og geninfektion af celler. I modsætning til gær display er bakteriel display hurtigere på grund af den hurtige (ca 20 min. 30) fordobling tid af Escherichia coli. De resulterende peptid affinitet reagenser kan produceres fra celle til brug i en bred vifte af sensing platforme 16,17,26 og har potentiale til brug som levende materialer når vises cellen 2 , 31 , 32. i forhold til monoklonale antistoffer for anerkendelse af bestemte mål, peptider er meget mindre og mere fleksible, og peptid display biblioteker kan nemt manipuleres på DNA niveau for at undgå specifikke aminosyrer, som cystein 33 . Peptider er i stigende grad udnyttet til therapeutics 34,35,36 og andre applikationer, hvor antistoffer vil typisk blive udnyttet på grund af deres lethed af discovery, reproducerbare syntetisk (off-celle ) produktion og overlegen vedligeholdelse af ydeevnen i ekstreme miljøer, giver en funktionel reagens selv efter udsættelse for høje temperaturer eller langtidsopbevaring uden køling 37,38. Evnen til at overvinde kølekæden for opbevaring af reagenser er af særlig interesse for den Department of Defense, for eksempel, som skal fungere i ekstreme miljøer. Termisk stabilitet var derfor en ønskelig funktion for affinitet reagenser erkender de valgte mål som eksempler i dette håndskrift.
For nylig, biopanning bakteriel display biblioteker er blevet endnu mere enkel og pålidelig med brugen af halvautomatiske magnetisk aktiveret celle sortering (MACS eller MCS) metoder 9,14,39. Disse metoder har påvist for biologiske mål ved hjælp af flere lignende sortering platforme med forskellige fordele, herunder en kommercielt tilgængelig automatiseret magnetisk aktiveret celle sortering (autoMACS eller autoMCS) instrument (se tabel over materialer) 1,14,15 og mere specialiserede enheder, der omslutte prøven i et engangs patron 7,9 eller chip 39, en værdifuld specifikation til brug med organismer eller toksiner, der er biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) eller højere7. Disse semi-automatiserede metoder kan udvides for at sortere for peptider stand til at binde til abiotiske materialer, hvis materialerne er magnetisk eller har mulighed for at være belagt på en magnetisk bead, og til brug med forskellige organismer (såsom anaerobe bakterier) Hvis sortering og vækstbetingelser er ændret. Ud over sortering bakteriel display biblioteker, er kommerciel autoMCS instrument bruges her også blevet brugt i en del for de indledende trin i opdagelsen af menneskelige single-kæde antistof fragmenter vises på overfladen af gær, efterfulgt af yderligere isolation Brug af fluorescerende aktiveret celle sortering (FACS) 40. De primære fordele til semi-automation er faldet sortering tid og indsats, og mere robust og reproducerbare afskaffelse af ubundne celler fra de magnetiske perler under vask skridt, fører til reduceret falske positiver, færre krævede sortering runder, og mindre kompliceret down-stream analyse 9,14. I tilfælde af kommerciel autoMCS instrument, der er flere forudinstallerede programmer, som kan være optimalt for forskellige applikationer, såsom negative forsortering (nedbrydning), prioritering af renhed, minimering af slutprøven volumen, og øge eller aftagende følsomhed for isolation af sjældne celler 41.
Fokus for dette arbejde er at vise metodologien for biopanning en bakteriel display bibliotek ved hjælp af kommercielt tilgængelige autoMCS instrument og udlægge tankeproces anvendes i analysere og minimere den resulterende pulje af ansøgere i for at lette udvidelsen til andre programmer. Display biblioteket bruges her (se tabel over materialer) 12,13 indeholder ca. 109- 1011 unikke 15-mer peptider vises via en modificeret version af bakteriel ydre membran protein OmpX i en Ufikseret naturen på celleoverfladen, der forventes at være repræsentativ for den gratis peptid i løsning hvis fremstillet syntetisk. Dette protein stillads indeholder desuden en positiv kontrol P2X peptid på C-terminus for overvågning udtryk via binding til YPet Mona. Dog bør en købt eller roman bibliotek med passende mangfoldighed og andre karakteristika, der er nødvendige for den specifikke anvendelse ønskes arbejde på samme måde med denne biopanning fremgangsmåde, selv om nogle mindre ændringer kan være påkrævet. En skematisk af protokollens biopanning er illustreret i figur 1. Derudover protokollen kunne tilpasses til andre automatiske magnetisk sortering platforme og andre sortering strategier. Manuel magnetisk sortering med en benchtop magnet er påvist med succes, omend med mere kompliceret og tidskrævende downstream analyse skal skyldes øget falske positiver 14, og alligevel giver et alternativ til den autoMCS trin hvis ingen automatiseret magnetiske celle sortering enhed er tilgængelig.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-545</td>
			<td>Automated cell separator for use with magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth, Miller (LB)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-500</td>
			<td>Thickening/geling agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library</td>
			<td>Cytomx Therapeutics</td>
			<td>N/A; http://cytomx.com/contact/</td>
			<td>On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arabinose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3256-500G</td>
			<td>Sugar, for induction of protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0780-10L</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI21327</td>
			<td>Adds biotin molecule to primary amines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Biotin Quantitation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI28005</td>
			<td>Ensures biotin molecule is covalently bound to protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65601</td>
			<td>Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td>Protein, used as blocking agent for non-specific binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Sugar, for growth and impeding inducible protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ypet Mona</td>
			<td>UCSB and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488 NHS Ester</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46403</td>
			<td>For conjugating protein target to fluorophore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S866</td>
			<td>Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSFlow</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>342003</td>
			<td>Buffer for running FACS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-021-101</td>
			<td>For MACS Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Running Buffer &#8211; MACS Separation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Washing Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-092-987</td>
			<td>For autoMACS instrument maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E505-4L</td>
			<td>Decontamination of autoMACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6279-1L</td>
			<td>For bacterial freezer stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill 15 rack</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-952</td>
			<td>For MACS Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview</td>
			<td>For assessment of peptide binding to target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>659523</td>
			<td>For assessment of peptide binding to target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A13346</td>
			<td>Bench top cell separator for use with magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Sequencing</td>
			<td>Genewiz</td>
			<td>N/A; https://www.genewiz.com/</td>
			<td>DNA and Colony Sequencing Services</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400</td>
			<td>For use with sequence analysis macro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrax Protective Antigen (PA)</td>
			<td>List Biological Laboratories, Inc.</td>
			<td>171</td>
			<td>Target protein used as example for representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrax</td>
			<td>ECBC and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rivax</td>
			<td>ECBC and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated biopanning of bacterial display libraries for peptide affinity reagent discovery and analysis of resulting isolates

Biopanning bakteriel display biblioteker er en gennemprøvet teknik for peptid affinitet reagens opdagelse for anerkendelse af både biotiske og abiotiske mål. Peptid affinitet reagenser kan anvendes til lignende applikationer til antistoffer, herunder sensing og therapeutics, men er mere robust og udføre i mere ekstreme miljøer. Specifikke berigelse af peptid capture agenter til et protein mål af interesse er forbedret ved hjælp af semi-automatiserede metoder som forbedre bindende og vaske trin og derfor reducere forekomsten af falsk positive bindemidler. En semi-automatiseret sortering metode er beskrevet heri til brug med en kommerciel automatiseret magnetisk aktiveret celle sortering enhed med en uhindret bakteriel visning sortering bibliotek udtryk for tilfældige 15-mer peptider. Med mindre ændringer, disse metoder er extendable hen til andre automatiske enheder, andre sortering biblioteker og andre organismer. Hovedformålet med dette arbejde er at give en omfattende metode og udlægge tankeproces anvendes i analysere og minimere den resulterende pulje af ansøgere. Disse teknikker omfatter analyse af-celle bindende ved hjælp af fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS), til at vurdere affinitet og specificitet under sortering og i at sammenligne individuelle kandidater, og analysen af peptid sekvenser til at identificere tendenser og konsensus sekvenser for forståelse og potentielt forbedre affinitet til og specificitet for mål af interesse.

Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates at JoVE.com

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning bakteriel display biblioteker er en gennemprøvet teknik til opdagelsen af peptid affinitet reagenser, en robust alternativ til antistoffer. Den semi-automatiske sorteringsmetoden heri er strømlinet biopanning for at mindske forekomsten af falske positiver. Her viser vi den tankeproces og metoder, der anvendes i evaluering af kandidater og minimere downstream analyse.

Semi-automatiske Biopanning af bakteriel Display biblioteker for peptid affinitet reagens opdagelse og analyse af resulterende isolater

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Fremgangsmåde til at identificere småmolekylære inhibitorer af protein-protein-vekselvirkning mellem HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Bakteriel Inner-membran Display til screening af et bibliotek af antistof fragmenter

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Bestemmelse af høj-affinitet antistof-antigen Bindende Kinetics Brug Fire Biosensor Platforme

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Let Manipulation af arkitekturer i Protein-baseret Hydrogels til celle kultur applikationer

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Analyse af histonantistofspecifikitet med peptidmikroarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: et-trins affinitet rensning for den parallelle analyse af Protein-Protein og Protein-metabolit komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi til High Throughput påvisning af lav affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-time, semi-automatiseret fluorescerende måling af luftvejene overflade flydende pH af primære Human luftvejs epitelial celler

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Native Cell Membrane Nanopartikler System for Membran Protein-Protein Interaktion Analyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases

Brug phage display til at udvikle Ubiquitin Variant Modulatorer til E3 Ligases

Ubiquitin is a small 8.6 kDa protein that is a core component of the ubiquitin-proteasome system. Consequently, it can bind to a diverse array of proteins ...