Name: semi-automated biopanning of bacterial display libraries for peptide affinity reagent discovery and analysis of resulting isolates
Uploaded: 2017-12-06T12:30:00
Duration: 13 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates at JoVE.com

המחברים רוצה להכיר את התמיכה של מעבדת מחקר צבא ארה ב (ARL) לתוכנית המשתלמים הבתר, מנוהל על ידי אלון רכס Associated האוניברסיטאות באמצעות חוזה עם ARL, הודות למינויו של ד ר ג'סטין עמ' Jahnke. הנותרים מימון סופק על ידי חיישנים מנהל התקנים אלקטרונים ARL. המחברים גם רוצה להודות המעבדה דוהרטי-UCSB על שיתוף את התצוגה חיידקי ספרייה ומידע לקראת שיבוט הכימית YPet מונה, ד ר אדמס ברין לקבלת תמיכה בשיבוט הכימית YPet מונה-ARL, ד ר יהושע קוגוט עבור עבודתו הראשונית על ו הכשרה biopanning של חיידקי התצוגה ספריות, עופרה השקט של Edgewood כימית, ביולוגית מרכז לשיתוף פלסמידים נהגו לבטא ולטהר abrax וחלבונים rivax, ברנדי דורסי לקבלת תמיכה טכנית עבור בידוד של הרשות הפלסטינית איגוד פפטידים, צ'ין גואו לקבלת תמיכה טכנית של ניסויים ראשוני עבור בידוד של פפטידים איגוד abrax, ד ר טרל ג'סיקה לדיונים מועיל לגבי כתב היד הזה.

המחברים אין לחשוף

ספריות התצוגה חיידקי Biopanning כבר הגישה מוצלחת של הבידוד של זיקה ריאגנטים, ויש פפטידים מציעים אלטרנטיבה יעילה נוגדנים עבור זיהוי כאשר נדרשים קריטריונים ספציפיים, כגון יציבות בסביבות קיצוניות. Biopanning של ספריות אלה התייעלה בשיטות autoMCS המתוארות כאן, פלטפורמה autoMCS זמינים מסחרית משתרע טכנולוגיה זו קהל הרבה יותר רחב. בהשוואה מסורתיים מתחלפים MCS/FACS שיטות המיון בקטריאלי להציג ספריות, שיטות autoMCS הן פחות יקר כי הם אינם מצריכים השקעה מכשיר FACS יקר יותר מסוגל מיון של בידוד תאי מאוגד, במקום סוג זרימת cytometer המשמש כאן, המסוגלת רק ניתוח 14. לשלבים הקריטיים עבור biopanning מוצלחת מאת autoMCS כוללים מבחר תוכנית ההפרדה, שלילי מיון נגד הצלב-המגיבים פוטנציאליים כדי לצמצם את תוצאות חיוביות שגויות, ניטור ספריית העשרה באמצעות FACS כדי לקבוע מתי להפסיק biopanning, ו ניתוח חכם של בין המועמדים כדי להימנע מסורבלת ההקרנה של מאות מועמדים.
הדוגמאות המתוארים בזאת להדגים biopanning מוצלחת של הספרייה התצוגה חיידקי שבחרת עבור שתי מטרות נפרדות, הרשות הפלסטינית והן abrax, אך עם אסטרטגיות ניתוח שונה במקצת עקב הבדלים ברצף פפטיד עבור כל מאגר של מועמדים לאחר ארבעה סיבובים של biopanning. הרשות הפלסטינית היה המקרה יותר הגונים, עם רצף ניתוח הוכחת מגמות ברורות מן הרצפים פפטיד זה חוזר על עצמו לפחות פעם אחת במושבות 144. זה לבד היה מספיק לקבוע רצף קונצנזוס עבור היעד הרשות הפלסטינית, ואת אלה מושבות שהכיל הקונצנזוס או רצף דומה היו המועמדים הטובים ביותר מבחינת היחס של איגוד הפלסטינית נגד איגוד אל הפקד streptavidin שלילי. עם זאת, זה לא תמיד יהיה המקרה. עבור המטרה abrax, מושבות 100 רצף הוביל חמש רצפים חוזרים אבל המגמה ברצפים אלה היה פחות ברור, מלבד נטייה להכיל שאריות חומצת אמינו ארומטיות, חומצה אספרטית או אספרגין. החזוי "הקונצנזוס" מן הרצף החוזר רק יכול יש כבר הפיק ונבדק זיקה abrax, אבל מאז רצפים האב לא הכיל את רצף הסכמה המדויק, אנו החזיר לרשימה של המושבות ברצף, נצפתה האחר מועמדים שהיה יותר מגמות המשותף לכל. למעשה, שתי מושבות הכיל רצף דומה ל "הקונצנזוס" מן חוזר לבד, (FWDTWF במקום FWAWF), שהייתה מגמה זהה גם שאריות טריפטופן, פנילאלנין, חומצה אספרטית אך עם מרווח שונים. אחד של פפטידים אלה היה רצף חוזר, אחד לא היה. רצפי שני אלה, יחד עם רצף השלישי המכיל גרסה דומה, היו בין החוברות למעלה 5 נבדקו מבחינת האהדה abrax. קלסר העליונה הכוללת, AX-A05, מוצגים גם מגמות דומות. התוצאות עבור abrax מדגימים כי גישה שיחליף מספר פעמים בין רצף ניתוח וניתוח זיקה וספציפיות לפעמים יהיה נדרש, בהתאם למטרה שבחרת. התוצאות עבור המטרה abrax גם להוכיח את רמת היחודיות אשר יכולה להיות מושגת על חלבון דומה מאוד ( 1,rivax15).
התוכניות autoMCS שבחרת עבור המחקרים שלנו היו Posselds, Posseld, שהן שתיהן לבחירה חיובית של התאים היעד שכותרתו עם תדירות נמוכה, פחות מ- 5% מהאוכלוסייה הראשונית. בשני המקרים, התאים עוברים שני טורים מגנטי. במקרה של התוכנית Posselds, עם זאת, תאים עוברים לאט יותר העמודה הראשונה כדי להגדיל את זמן החשיפה 41. בנוסף לתיאורים התוכנית ניתנה על ידי היצרן של ההתקן autoMCS המסחרי (ראה טבלת חומרים) 41, תוכניות אלה נבחרו לאחר השוואה ראשונית של מספר תוכניות אפשריות. היכולת של כל תוכנית כדי למנוע הוצאת תוצאות חיוביות שגויות מתרבות הומוגנית של תאי בקרה שלילית, בהצלחה לבודד קלסר ידוע ליעד עניין מתרבות מעורב המכיל תאים שליטה שלילי מתובל הפחתת אחוז קלסר ידוע, הושוו. אם באופן משמעותי לסטות היישומים המתוארים כאן, השוואה דומה יכול לעזור בבחירה תוכנית עבור היישום החדש. עם זאת, שפורסמו קודם לכן תוצאות השוואת שתי תוכניות אלה (Posseld ו- Posselds) עבור בידוד של פפטיד זיקה ריאגנטים עבור הרשות הפלסטינית הראה כי באחת מתוכניות אלה עבור כל ארבעה סיבובים של biopanning הוביל לבידוד של פפטידים דומים זיקה, ירידה לפרטים עבור הרשות הפלסטינית והנחישות של הקונצנזוס WXCFTC. ההבדלים העיקריים היו Posseld הזה, עם קצב הזרימה מהירה יותר שלה, למיין במהירות רבה יותר, מחייב אהדה עבור היעד היה לכן גבוה יותר לאחר שני סיבובים של biopanning, ואילו שימוש Posselds הוביל רצפים ייחודי נוסף לאחר ארבעה סיבובים של biopanning 14. ללמוד מזה, האסטרטגיה השתנה מעט כאשר biopanning עבור abrax פפטידים איגוד לשלב שני יתרונות: Posselds שימשו עגול 1 כדי לאפשר יותר זמן חשיפה במהלך שלב זה קריטי איפה הגיוון הוא הגבוה ביותר, אבל אז תוכנית הוחלפה Posseld עבור בידוד מהיר של החוברות זיקה הגבוהה ביותר במהלך סיבוב 2-4 1,15. זה הופיע להיות אידיאלי abrax, במיוחד מאז nMFI ואיגוד אחוז גבוה יותר עבור abrax מיון עגול 4 לעומת הרשות מיון 4 עגול עם תוכנית או שניהם היו (איור 2 ו. איור 3 ו- Sarkes et al. 2015 14), אבל השוואה ישירה באמצעות אסטרטגיה אחת מול השנייה לאותו היעד להידרש להשוואה יותר חד משמעיות. איזו תוכנית היא הטובה ביותר עבור יישום מסוים שעשוי להיות תלוי על המטרה בודדים, הספרייה מיון המשמש את רמת הביטוי פפטיד מושגת עם כל שינוי בתנאים המתוארים כאן.
לא נדון להלן התוצאות האפשריות של biopanning עם חומרים והאביוטיים, אבל השתמשנו גם באותה ספריה חיידקי התצוגה עבור biopanning נגד בצובר אלומיניום 2. מחקר זה לא בוצעה באמצעות autoMCS, אך מחקרים דומים יכול להתבצע באמצעות autoMCS אם החומר זמין, או יכול להיות מצופה על או מצומדת כדי, חרוז מגנטי. במחקר אלומיניום בתפזורת, חומצת אמינו בודדות ומודלים מבנה שניוני עזר להבנת מה נהג על זיקה מחייבת של פפטידים מבודד, מאז אין רצף הסכמה היה נחוש 2. אפילו עם מטרות ביולוגיות, ייתכן שהדבר נדרש להבין במה הוא נוהג על זיקה מחייבת עבור מטרות מסוימות, ולכן הגיליון המופקים המאקרו "eCPX_Sequencing" כוללת כרטיסיה עם ניתוח תדירות שאריות בודדים. אם אין רצפים חוזרים נראים בנוסף היעדר קונצנזוס, שאריות תדירות מראה שום דפוס, עם זאת, סוגים אחרים של ניתוח עשוי להידרש. בנוסף, מיון נוסף סיבובים ייתכן שיהיה צורך להימנע הקרנת מספר גדול יותר של מועמדים לבחירה למטה-כאלה עם זיקה מספקת המטרה הרצויה.
עם הזמינות הגוברת של רצף הדור הבא, לימוד יותר מעמיק יכול להתבצע כדי לקבוע את המועמדים המבטיחים ביותר לפני בדיקת זיקה וכדי לקבוע את מידת ההעשרה לאחר כל סיבוב של biopanning. עם זאת, רצפים הלאה לשלב ניתוח איגוד ייתכן שיהיה עליך ליצור מחדש על-ידי שיבוט, אם הם אינם של תדר גבוה מספיק כדי לבודד בקלות עם המושבה שגרתית רצף של עשרות או מאות מושבות. כמו טכנולוגיה זו מקדמות, הופך להיות פחות יקר, שגרתיות יותר, במיוחד עם אפשרות לבידוד המושבה, שכן סביר להניח להיות הדרך הטובה ביותר כדי לנתח נתונים biopanning. זה עלול להוביל הבהרה של הרצפים דרך בודדים, ואת כל ספריה, להתפתח. בנוסף, החיידק בספריה מיון אולי מוטציה לאורך זמן, אשר יכולת הטיה מיון לקראת תאים עם שיעורי צמיחה מהירה או חיידקים overexpress מסוגל לכריכת חומר גם ללא תצוגה לגרדום הבעה פפטיד, עבור גנומית חלבונים מופע. מסיבה זו, ברגע מועמדים מבטיחים להגיח, זה שווה לבודד את פלסמיד ה-DNA, retransforming טריים e. coli, ולאשר פפטיד איגוד באמצעות FACS. אם מתכנן להשתמש את פפטיד בתבנית ללא תאים, וצריך להעריך זיקה גם עבור פפטיד חינם. לדוגמה, פפטיד זיקה ריאגנטים שהתגלו במהלך התצוגה חיידקי עבור היעד SEB הופקו לאכסון את התא ואת שנותחה באמצעות שיטות מסורתיות יותר כמו מקושרים-אנזים immunosorbant assay (אליסה), ו על תאים (דרך FACS)-את-תא (דרך אליסה) זיקה הושוו באמצעותדK s נקבע על ידי שתי שיטות 7.
למרות עוצמת האינטראקציה ביוטין-streptavidin הופך אסטרטגיית אידיאלי עבור לכידה של חלבון המטרה, פפטידים מאוגד, הליך זה יכול להיות שונה עבור אחרים אסטרטגיות ללכוד. צימוד ישיר של חלבון כדי beads מגנטי, כמו אפוקסי ו חומצה קרבוקסילית חרוזים, הצליחה ומסירה צעד מחייב. עם זאת, ישיר של שעלולות להפריע אתרי קישור פוטנציאליים באופן ספציפי או בלתי מסוימים, בהתאם מצורף אסטרטגיה. יתרון נוסף של השימוש streptavidin חרוזים היא פחות חלבון יציב מטרות יכול להיות טרי biotinylated ב- 30 דקות או המאוחסנים קפוא, במידת הצורך, ואילו החרוזים עצמם נוטים לדרוש יותר זמן דגירה עם החלבון cross-linking, הם בדרך כלל מאוחסנים ב 2-8° c הריכוז ההתחלתי המוצע של biotinylated חלבון המטרה כאן, 600 nM, הצליחה עבור מטרות מרובות, אך ייתכן ניתן לבודד פפטיד ריאגנטים לכידת עם זיקה מוגברת, אם זה ריכוז מופחתת. בנוסף, שיטה זו ניתן יהיה להרחיב, שונה עבור ספריות אחרות התצוגה חיידקים ואורגניזמים אחרים. לדוגמה, ניתן לבצע שלבים אלה, בהעדר חמצן לשימוש עם anaerobes, או בסביבות אחרות לשימוש עם extremophiles כדי לבודד פפטידים עם מאפיינים ייחודיים. פפטידים ו/או הסכמה נחושה עבור מטרה מסוימת עניין יכול להיות פוטנציאל להשתמש על תאים כמקור פרנסה גשמי, או לאכסון המיוצר את התא. פפטידים לאכסון המיוצר יכול התבגר עוד יותר להתפתחות של זיקה גבוהה יותר וסוכנים עמידים יותר חלבון מזורז ללכוד (PCC) לשימוש בחיישנים, או עבור יישומים אחרים שבו נוגדנים בדרך כלל ישמש עבור איגוד או זיהוי 38,55. מידול מולקולרי יכול לשמש גם כדי לקבוע מחייב מיקום פפטיד עם המטרה שלו, כפי בוצעה לאחרונה כדי להפוך את abrax מחייב פפטידים קונצנזוס המופיעים 5C איור 1. בסך הכל, biopanning ספריות חיידקי התצוגה עבור פפטיד זיקה ריאגנטים היא חלופה מהירה, פשוטה ורבת בייצור נוגדנים עבור זיהוי זיהוי של מטרות חלבון ושל biopanning חצי אוטומטית זו הגישה הפיק תוצאות אמינות עם מרחיקת לכת יישומים.

Biopanning היא טכניקה מוכחת לגילוי ריאגנט זיקה, עם בקטריאלי להציג ספריות מקור נוח עבור פפטיד זיקה ריאגנטים 1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24. באופן דומה כדי phage להציג 25,26 שמרים ויציג 27,28, פפטידים נחשפים על-פני התא, הינם זמינים לאגד-ביוטי והן והאביוטיים יעדים, באמצעות אינטראקציות אלה מונע על ידי עמוד השדרה פפטיד והן את המאפיינים הייחודיים של הצד-שרשראות חומצת אמינו 29. בניגוד phage תצוגה, החיידקים עצמם משכפלים ומכילים חומר גנטי כל הנדרש לתצוגה ללא • תנאי של phage מאוגד או הדבקה חוזרת של תאים. בניגוד שמרים תצוגה, תצוגה חיידקי הוא מהיר עקב המהירה (כ 20 דקות 30) הכפלת זמן של Escherichia coli. יכול להיות מיוצר ריאגנטים זיקה פפטיד שנוצר מחוץ תאים לשימוש במגוון רחב של פלטפורמות 16,17,26 חישה ויש פוטנציאל לשימוש כמו חומרי חיים כאשר הוא מוצג בהתא 2 , 31 , 32. לעומת נוגדנים חד-שבטיים זיהוי של מטרות ספציפיות, פפטידים הן הרבה יותר קטן וגמיש יותר, ניתן לטפל בקלות תצוגה מעבדות ברמת ה-DNA כדי להימנע חומצות אמינו ספציפיות, כגון ציסטאין 33 . פפטידים, יותר ויותר מנוצלות הרפוי 34,35,36 ויישומים אחרים שבו נוגדנים היה בדרך כלל להיות מנוצל הודות לקלות שלהם של גילוי, לשחזור סינתטיים (הנחה-תא ) ייצור ותחזוקה מעולה של ביצועים בסביבות קיצוניות, מתן חומר מגיב תפקודית גם לאחר חשיפה בטמפרטורה גבוהה או לאחסון לטווח ארוך ללא קירור 37,38. היכולת להתגבר על שרשרת קר עבור אחסון של ריאגנטים הוא עניין מיוחד למשרד ההגנה, למשל, אשר עליו לפעול בסביבות קיצוניות. יציבות תרמית היה לכן תכונה רצויה עבור ריאגנטים באהדה להכרת המטרות שבחרת לתת דוגמאות כתב יד זה.
לאחרונה, ספריות התצוגה חיידקי biopanning הפך להיות עוד יותר פשוטה ואמינה עם השימוש של חצי אוטומטי מגנטי תא לפעיל על-מיון (מקינטוש או MCS) שיטות 9,14,39. שיטות אלה הוכחו עבור מטרות ביולוגיות באמצעות מספר דומה מיון פלטפורמות עם יתרונות שונים, לרבות זמינים מסחרית האוטומטי המגנטי תא לפעיל על-מיון כלי נגינה (autoMACS או autoMCS) (ראה טבלה של חומרים) 1,14,15 והתקנים יותר מיוחדים אשר מכניס את הדגימה מחסנית חד פעמיות 7,9 או שבב 39, מפרט יקר עבור שימוש עם אורגניזמים או רעלים אבטחה ברמה 2 (BSL-2) או גבוה יותר7. אפשרות להאריך בשיטות אוטומטיות למחצה אלה כדי למיין על פפטידים מסוגל לקשור חומרים והאביוטיים אם החומרים מגנטיים או יש את היכולת להיות מצופה חרוז מגנטי, ועל לשימוש עם אורגניזמים שונים (כגון חיידקים אנאירוביים) אם המיון שונו תנאי הגידול. בנוסף מיון התצוגה חיידקי ספריות, הכלי autoMCS מסחרי המשמש כאן שימש גם בחלקו על השלבים הראשונים של גילוי של נוגדן חד-שרשרת אנושית קטעים המוצג על פני השטח של שמרים, ואחריו בבידוד נוסף באמצעות פלורסנט מופעל התא מיון (FACS) 40. היתרונות העיקריים של אוטומציה למחצה הן ירידה מיון זמן, מאמץ, יותר לשחזור ועמיד חיסול תאים לא מאוגד החרוזים מגנטי במהלך שטיפת צעדים, המוביל מופחתת תוצאות חיוביות שגויות, בפחות סיבובים המיון נדרש, ולא פחות ניתוח ה-down stream מורכב 9,14. במקרה של המכשיר autoMCS מסחרי, יש מספר תוכניות טעון מראש, אשר עשוי להיות אופטימלית ליישומים שונים, כגון שלילי-מיון (דלדול), מתן עדיפות טוהר, צמצום נפח דגימה הסופי, הגדלת או הפחתת רגישות עבור בידוד של תאים נדיר 41.
המוקד של עבודה זו היא להדגים את המתודולוגיה עבור biopanning ספריה חיידקי התצוגה באמצעות מכשיר autoMCS זמינים מסחרית, להסביר את התהליך המחשבתי המוחלת בניתוח וצמצום הבריכה וכתוצאה מכך של מועמדים סדר כדי להקל על סיומת ליישומים אחרים. הספרייה התצוגה המשמש כאן (ראה טבלה של חומרים) 12,13 מכיל כ 109-11 10 15 ייחודי-מר פפטידים מוצגים דרך גירסה שונה של החלבון הממברנה החיצונית חיידקי OmpX ב הטבע ללא הגבלה על פני התא, אשר צפוי להיות נציג פפטיד חינם בתמיסה אם הפיק לאכסון. להגיע לגרדום הזה חלבון בנוסף מכיל פפטיד בקרה חיובית P2X-קצה קרבוקסילי לניטור ביטוי באמצעות קשירה מונה YPet. עם זאת, ספרייה שנרכשו או רומן עם גיוון מתאימים ומאפיינים אחרים הדרושים עבור היישום הספציפי הרצוי יש לעבוד באופן דומה עם הליך זה biopanning, למרות כמה שינויים קלים העשויים להידרש. תיאור סכמטי של פרוטוקול biopanning זה מודגם באיור1. בנוסף, הפרוטוקול יכול להיות מותאם השני אוטומטית פלטפורמות מיון מגנטי ואסטרטגיות מיון אחרים. מיון מגנטי ידני עם מגנט benchtop בהצלחה הוכח, אמנם עם ניתוח במורד הזרם יותר מסובך וצורכת זמן נדרש עקב הגדילה תוצאות חיוביות שגויות 14, והוא בכל זאת מספק אפשרות חלופית צעדים autoMCS אם אין תא מגנטי אוטומטיות מיון המכשיר זמין.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-545</td>
			<td>Automated cell separator for use with magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth, Miller (LB)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-500</td>
			<td>Thickening/geling agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library</td>
			<td>Cytomx Therapeutics</td>
			<td>N/A; http://cytomx.com/contact/</td>
			<td>On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arabinose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3256-500G</td>
			<td>Sugar, for induction of protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0780-10L</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI21327</td>
			<td>Adds biotin molecule to primary amines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Biotin Quantitation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI28005</td>
			<td>Ensures biotin molecule is covalently bound to protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65601</td>
			<td>Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td>Protein, used as blocking agent for non-specific binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Sugar, for growth and impeding inducible protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ypet Mona</td>
			<td>UCSB and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488 NHS Ester</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46403</td>
			<td>For conjugating protein target to fluorophore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S866</td>
			<td>Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSFlow</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>342003</td>
			<td>Buffer for running FACS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-021-101</td>
			<td>For MACS Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Running Buffer &#8211; MACS Separation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Washing Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-092-987</td>
			<td>For autoMACS instrument maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E505-4L</td>
			<td>Decontamination of autoMACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6279-1L</td>
			<td>For bacterial freezer stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill 15 rack</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-952</td>
			<td>For MACS Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview</td>
			<td>For assessment of peptide binding to target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>659523</td>
			<td>For assessment of peptide binding to target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A13346</td>
			<td>Bench top cell separator for use with magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Sequencing</td>
			<td>Genewiz</td>
			<td>N/A; https://www.genewiz.com/</td>
			<td>DNA and Colony Sequencing Services</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400</td>
			<td>For use with sequence analysis macro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrax Protective Antigen (PA)</td>
			<td>List Biological Laboratories, Inc.</td>
			<td>171</td>
			<td>Target protein used as example for representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrax</td>
			<td>ECBC and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rivax</td>
			<td>ECBC and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated biopanning of bacterial display libraries for peptide affinity reagent discovery and analysis of resulting isolates

ספריות התצוגה חיידקי Biopanning היא טכניקה מוכחת לגילוי פפטיד זיקה ריאגנט לזיהוי של מטרות-ביוטי והן והאביוטיים. פפטיד זיקה ריאגנטים יכול לשמש עבור יישומים דומים כדי נוגדנים, כולל חישה הרפוי, אך מסוגל לבצע בסביבות קיצוניות יותר ועמיד יותר. העשרת ספציפי של פפטיד לכידת סוכנים מטרה חלבון עניין היא משופרת באמצעות שיטות המיון האוטומטי למחצה אשר לשפר את איגוד, לשטוף את השלבים, לכן להקטין את המופע של קלסרים חיובי כוזב. שיטת המיון האוטומטי למחצה מתואר בזאת לשימוש עם מסחרי האוטומטי המגנטי תא לפעיל על-מיון מכשיר עם צג חיידקי ולמשחקי מיון ספריית לבטא פפטידים 15 אקראי-מר. עם שינויים קלים, שיטות אלה ניתנת להארכה לשני אוטומטית התקנים, ספריות אחרות מיון אורגניזמים אחרים. מטרה ראשית של עבודה זו היא לספק מתודולוגיה מקיפה (התורה) בתהליך החשיבה המוחלת בניתוח וצמצום הבריכה וכתוצאה מכך של מועמדים. טכניקות אלה כוללים ניתוח של איגוד-תאים באמצעות תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS), כדי להעריך זיקה וספציפיות במהלך מיון, בהשוואה בין מועמדים בודדים, ואת הניתוח של פפטיד רצף לזהות מגמות ו רצפי הקונצנזוס ההבנה ושיפור באופן פוטנציאלי את זיקה וספציפיות עבור היעד עניין.

Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates at JoVE.com

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

ספריות התצוגה חיידקי Biopanning היא טכניקה מוכחת על גילוי של פפטיד זיקה ריאגנטים, אלטרנטיבה איתנה נוגדנים. בשיטת המיון האוטומטי למחצה בזאת יש יעיל biopanning כדי להקטין את המופע של תוצאות חיוביות שגויות. כאן אנו ממחישים את התהליך המחשבתי וטכניקות מתבצעת הערכת המועמדים וצמצום ניתוח במורד הזרם.

Biopanning חצי אוטומטי של התצוגה חיידקי ספריות פפטיד זיקה ריאגנט גילוי וניתוח של מבודד וכתוצאה מכך

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

שיטה לזיהוי מולקולה קטנה מעכבים של האינטראקציה בין החלבונים בין HCN1 ו TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Inner-קרום חיידקי תצוגה להקרנת ספרייה של שברי נוגדן

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

קביעת קינטיקה מחייב אנטיגן נוגדן גבוהה זיקה באמצעות ארבע פלטפורמות biosensor

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

טיפול קל של ארכיטקטורות ב Hydrogels חלבון מבוססת ליישומים תרבות תא

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

ניתוח של היסטון נוגדנים היסטון עם Microprays פפטיד

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

חלבון חוץ-תאית הטכנולוגיה Microarray לגילוי תפוקה גבוהה של אינטראקציות קולטן-ליגנד זיקה נמוכה

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

בזמן אמת, חצי אוטומטי מדידה פלורסנט של משטח נתיב האוויר הנוזלי של ה-pH העיקרי של תאים אפיתל דרכי האוויר האנושי

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases

שימוש בתצוגת Phage לפיתוח אפננים משתנים של אוביקוויטין עבור ליגות E3

Ubiquitin is a small 8.6 kDa protein that is a core component of the ubiquitin-proteasome system. Consequently, it can bind to a diverse array of proteins ...