Name: semi-automated biopanning of bacterial display libraries for peptide affinity reagent discovery and analysis of resulting isolates
Uploaded: 2017-12-06T12:30:00
Duration: 13 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates at JoVE.com

Gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno di US Army Research Laboratory (ARL) Postdoctoral Fellowship Program, amministrato da Oak Ridge Associated Università attraverso un contratto con ARL, attraverso la nomina del Dr. Justin P. Jahnke. Restanti finanziamenti è stata fornita dai sensori e direzione di dispositivi elettrone alle ARL. Gli autori inoltre vorrei ringraziare il laboratorio Daugherty alle UCSB per condividere la libreria batterica display e informazioni per la clonazione il reagente YPet Mona, Dr. Bryn Adams per supporto nella clonazione il reagente YPet Mona a ARL, Dr. Joshua Kogot per il suo lavoro iniziale su e formazione in biopanning di librerie visualizzazione batterica, Alena calma di Edgewood chimico e biologico Center per la condivisione di plasmidi utilizzati per esprimere e purificare Elser e proteine rivax, Brandi Dorsey per il supporto tecnico per isolamento di PA associazione peptidi, Qin Guo per il supporto tecnico di esperimenti preliminari per l'isolamento di peptidi associazione Elser e Dr. Jessica Terrell per utili discussioni riguardanti questo manoscritto.

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Biopanning esposizione batterica librerie è stato un approccio di successo per l'isolamento dei reagenti di affinità, e peptidi offrono un'alternativa utile agli anticorpi per riconoscimento quando criteri specifici sono necessari, come la stabilità in ambienti estremi. Biopanning di queste librerie è stato semplificato utilizzando i metodi di autoMCS descritti qui, e una piattaforma di autoMCS disponibili in commercio si estende questa tecnologia ad un pubblico più ampio. Rispetto ai tradizionali alternati MCS/FACS metodi di ordinamento per batterico visualizzano librerie, metodi di autoMCS sono meno costosi perché non richiedono un investimento in uno strumento più costoso, FACS capace di cernita e di isolare le cellule associate, piuttosto che il tipo del citometro a flusso utilizzato qui, che solo è capace di analisi 14. I passaggi critici per il successo biopanning di autoMCS includono la separazione programma selezione, negativo l'ordinamento contro potenziali cross-reattivi per ridurre i falsi positivi, arricchimento libreria utilizzando FACS per determinare quando smettere di biopanning, di monitoraggio e analisi intelligente della piscina candidato per evitare la selezione di ingombrante di centinaia di candidati.
Negli esempi descritti nel presente documento viene biopanning successo della libreria display batteriche selezionate per due obiettivi separati, PA ed Elser, anche se con strategie di analisi leggermente diversa a causa delle differenze nelle sequenze del peptide per ciascun pool di candidati dopo quattro turni di biopanning. PA è stato il caso più semplice, con l'analisi di sequenza che dimostrano tendenze chiare dalle sequenze peptidiche che ripetuto almeno una volta in 144 colonie. Questo è stato da solo sufficiente a determinare una sequenza di consenso per la destinazione di PA e quelle colonie che conteneva il consenso o una sequenza simile sono stati i migliori candidati in termini del rapporto di associazione alla PA contro associazione per il controllo negativo di streptavidina. Tuttavia, questo non sarà sempre il caso. Per la destinazione di Elser, 100 colonie sequenziamento ha portato cinque sequenze ripetute, ma la tendenza in queste sequenze era meno chiara, diverso da una tendenza a contenere residui dell'amminoacido aromatico e acido aspartico o asparagina. Il predetto "consenso" delle sequenze ripetute solo potrebbe sono stati prodotto e testato per affinità di Elser, ma poiché nessuna sequenza padre contenuto quella sequenza consenso esatto, siamo tornati alla lista delle colonie sequenziate e osservato che altri candidati che aveva tendenze più in comune tra loro. Infatti, due colonie conteneva una sequenza simile al "consenso" dalle ripetizioni da solo, (FWDTWF invece di FWAWF), che aveva la stessa tendenza dei residui di acido aspartico, fenilalanina e triptofano, ma con diversa spaziatura. Uno di questi peptidi era una sequenza ripetuta, uno non era. Queste due sequenze, insieme a una terza sequenza contenente una variante simile, sono stati tra i primi 5 leganti testati in termini di affinità per Elser. Il raccoglitore superiore generale, AX-A05, visualizzato anche tendenze simili. I risultati per Elser dimostrano che un approccio che alterna diverse volte tra l'analisi di sequenza e l'analisi di affinità e specificità a volte sarà necessario, a seconda della destinazione scelta. I risultati per la destinazione di Elser dimostrano anche il livello di specificità che possono essere raggiunti nel corso di una proteina molto simile (rivax 1,15).
I programmi di autoMCS selezionati per i nostri studi sono stati Posselds e Posseld, entrambi per selezione positiva delle cellule bersaglio con etichetta con bassa frequenza, a meno di 5% della popolazione iniziale. In entrambi i casi, le cellule passano attraverso due colonne magnetiche. Nel caso del programma di Posselds, tuttavia, le cellule passano più lentamente attraverso la prima colonna per aumentare l'esposizione tempo 41. Oltre alle descrizioni programma fornite dal produttore del dispositivo commerciale autoMCS (Vedi Materiali tavolo) 41, questi programmi sono stati scelti dopo un iniziale confronto di diversi programmi di potenziale. Capacità di ogni programma per evitare di tirare fuori falsi positivi da una cultura omogenea delle cellule di controllo negativo e di isolare con successo un noto raccoglitore ad un target di interesse da una coltura mista che contiene le cellule di controllo negativo addizionate con una diminuzione percentuale di legante noto, sono stati confrontati. Se si discosti significativamente dalle applicazioni descritte qui, un simile confronto potrebbe essere utile nella selezione del programma per la nuova applicazione. Tuttavia, precedentemente pubblicato risultati confrontando questi due programmi (Posseld e Posselds) per l'isolamento dei peptidi affinità reagenti per PA hanno mostrato che utilizzando uno di questi programmi per tutti i quattro giri di biopanning ha condotto all'isolamento di peptidi con simili affinità e specificità per la PA e la determinazione del consenso WXCFTC. Le differenze principali sono stati quello Posseld, con il suo tasso di flusso più veloce, ordinato più rapidamente e affinità per la destinazione obbligatoria di conseguenza era più alto dopo solo due giri di biopanning, mentre usando il Posselds portato a ulteriori sequenze uniche dopo quattro turni di biopanning 14. imparare da questo, la strategia è stata cambiata leggermente quando biopanning per peptidi associazione Elser incorporare entrambi i benefici: Posselds è stato utilizzato per giro 1 per consentire più tempo di esposizione durante questo passaggio critico dove la diversità è più alto, ma poi la programma è stato commutato a Posseld per l'isolamento più veloce dei leganti affinità più alti durante i giri 2-4 1,15. Questo sembrava essere ideale per Elser, soprattutto perché il nMFI e le percentuali di legame erano entrambe più alto per Elser ordinamento giro 4 rispetto al PA ordinamento round 4 con entrambi i programmi (Figura 2 e Figura 3 e Sarkes et al 2015 14), ma un confronto diretto, utilizzando una strategia contro l'altro con la stessa destinazione sarebbe richiesto per un confronto più conclusivo. Quale programma è meglio per una particolare applicazione può dipendere l'obiettivo individuale, la libreria di ordinamento utilizzata e il livello di espressione di peptidi che si ottiene con qualsiasi variazione delle condizioni qui descritte.
Non discusse qui sono risultati potenziali da biopanning con materiali abiotici, ma abbiamo anche usato la stessa libreria di esposizione batterica per biopanning contro massa alluminio 2. Questo studio non è stato eseguito utilizzando autoMCS, ma studi simili potrebbero essere compiuti utilizzando autoMCS se il materiale è disponibile su, o potrebbe essere rivestito su o coniugato a, magnetic beads. Nello studio alluminio alla rinfusa, struttura secondaria modellazione e analisi individuale dell'amminoacido era utile per capire che cosa stava guidando l'affinità di legame dei peptidi isolati, poiché nessuna sequenza di consenso era determinato 2. Anche con bersagli biologici, questo può essere necessario per comprendere ciò che sta guidando l'affinità di legame per alcune destinazioni, motivo per cui il foglio di lavoro generato dalla macro "eCPX_Sequencing" include una scheda con analisi di frequenza dei residui individuali. Se nessuna sequenza ripetuta è visto oltre alla mancanza di un consenso, e frequenza di residuo non mostra nessun modello, tuttavia, altri tipi di analisi possono essere richiesti. Inoltre, ulteriore ordinamento giri potrebbe essere necessario evitare lo screening di un numero molto maggiore di candidati per la down-selezione di quelli con affinità sufficienti per la destinazione desiderata.
Con la crescente disponibilità di sequenziamento di nuova generazione, uno studio più approfondito potesse essere eseguito per determinare i candidati più promettenti prima del test di affinità e a determinare il grado di arricchimento dopo ogni turno di biopanning. Tuttavia, sequenze di passare alla fase di analisi associazione potrebbero essere necessario essere ricreati per clonazione, se non sono abbastanza alta frequenza per isolare facilmente con sequenziamento sistematico Colonia di decine o centinaia di colonie. Come la tecnologia avanza, diventando meno costosi e più sistematico, e soprattutto con un'opzione per l'isolamento di Colonia, sarà probabilmente essere il modo migliore per analizzare i dati biopanning. Può portare alla delucidazione delle sequenze modo individuale e l'intera libreria, evolvere. Inoltre, i batteri nella libreria di ordinamento possono mutare nel tempo, che potrebbe influenzare ordinamento verso le cellule con tassi di crescita più veloce o batteri che iperesprimono genomici proteine capaci di legare un materiale anche senza visualizzazione dell'impalcatura e peptide espressione, per istanza. Per questo motivo, una volta candidati promettenti emergono, vale la pena di isolare il DNA del plasmide, retransforming fresco e. coli e confermando il legame del peptide via FACS. Se si prevede di utilizzare il peptide in un formato senza cellula, affinità anche dovrebbero essere valutati per il peptide gratis. Ad esempio, i reagenti di affinità del peptide scoperti attraverso display batterica per la destinazione SEB erano prodotta sinteticamente off-cellula ed analizzati con metodi più tradizionali quali analisi enzima-collegata metologie (ELISA) e il cellulare (via FACS) e fuori delle cellule (via ELISA) affinità sono stati confrontati usandoil dalul K determinato da entrambi metodi 7.
Anche se la forza dell'interazione biotina-streptavidina rende una strategia ideale per l'acquisizione del bersaglio di proteine e peptidi associati, questa procedura può essere modificata per altre strategie di acquisizione. Accoppiamento diretto della proteina a biglie magnetiche, come la resina epossidica e perle di acido carbossilico, ha avuto successo e rimuove un passaggio di associazione. Tuttavia, il collegamento diretto può ostacolare potenziali siti di legame in un modo specifico o non specifico, a seconda della strategia di attacco. Un ulteriore vantaggio a usando le perle di streptavidina è che meno stabile della proteina target può essere appena biotinilati in 30 min o memorizzati congelati, se necessario, mentre le perline se stessi tendono a richiedere più lunga incubazione con la proteina per cross-linking e sono generalmente conservato a 2-8° C. La concentrazione di partenza suggerita di proteine biotinilate target qui, 600 nM, ha avuto successo per bersagli multipli, ma potrebbe essere possibile isolare i reagenti di cattura del peptide con affinità aumentata se questa concentrazione è ridotta. Inoltre, questo metodo può essere esteso a e modificato per altre librerie di esposizione batterica ed altri organismi. Ad esempio, questi passaggi possono essere eseguiti in assenza di ossigeno per uso con gli anaerobi, o in altri ambienti per l'utilizzo con extremophiles per isolare i peptidi con proprietà uniche. I peptidi e/o consenso determinato per una particolare destinazione di interesse può essere potenzialmente utilizzato il cellulare come una vita materiale, o prodotta sinteticamente off-cellula. Peptidi prodotte sinteticamente possono essere ulteriormente regolate per lo sviluppo di maggiore affinità e agenti di proteina catalizzata Capture (PCC) più robusti per l'uso in sensori, o per altre applicazioni in cui gli anticorpi sarebbero stati utilizzati in genere per l'associazione o riconoscimento 38,55. Modellistica molecolare è utilizzabile anche per aiutare a determinare vincolante posizione del peptide con il suo obiettivo, come recentemente è stato effettuato per i peptidi associazione Elser e consenso elencati nella Figura 5 1. Nel complesso, biopanning esposizione batterica librerie per i reagenti peptide affinità è un'alternativa veloce, semplice e potente per la produzione di anticorpi per il riconoscimento e la rilevazione di bersagli proteici e questo semi-automatico biopanning approccio ha prodotto risultati affidabili con applicazioni di vasta portata.

Biopanning è una tecnica collaudata per la scoperta del reagente di affinità, con batterico visualizzare librerie una fonte conveniente per peptide affinità reagenti 1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24. Allo stesso modo dei fagi di visualizzazione 25,26 e lievito visualizzare 27,28, i peptidi sono esposti sulla superficie delle cellule e sono disponibili da associare agli obiettivi sia biotici ed abiotici, con queste interazioni guidato da sia la spina dorsale del peptide e le proprietà uniche delle catene laterali dell'amminoacido 29. In contrasto con visualizzazione dei fagi, i batteri stessi sono auto-replicanti e contengono tutto materiale genetico necessario per la visualizzazione senza eluizione del fago associato e reinfezione delle cellule. In contrasto con visualizzazione di lievito, display batterica è più veloce a causa il rapido (circa 20 min 30) raddoppiando il tempo di Escherichia coli. I reagenti di affinità del peptide risultante possono essere prodotto fuori cella da utilizzare in una varietà di piattaforme 16,17,26 di rilevamento e hanno il potenziale per uso come materiali viventi quando visualizzato su-cell 2 , 31 , 32. rispetto agli anticorpi monoclonali per il riconoscimento di obiettivi specifici, i peptidi sono molto più piccole e più flessibili, e librerie visualizzazione del peptide possono essere facilmente manipolate a livello del DNA, per evitare gli aminoacidi specifici, quale cisteina 33 . Peptidi sono sempre più sfruttati per terapeutica 34,35,36 e altre applicazioni dove gli anticorpi in genere sarebbero utilizzati a causa della loro facilità di individuazione, riproducibile sintetico (cella ) produzione e manutenzione superiore di prestazioni in ambienti estremi, fornendo un reagente funzionale anche dopo l'esposizione ad alte temperature o stoccaggio a lungo termine senza refrigerazione 37,38. La capacità di superare la catena del freddo per la conservazione dei reagenti è di particolare interesse per il dipartimento della difesa, per esempio, che deve operare in ambienti estremi. Stabilità termica è stata pertanto una caratteristica desiderabile per i reagenti di affinità riconoscendo le destinazioni selezionate date come esempi in questo manoscritto.
Recentemente, librerie di visualizzazione batterica di biopanning è diventato ancora più semplice e affidabile con l'uso di semi-automatica magnetico-attivato delle cellule ordinamento (MACS o MCS) metodi 9,14,39. Questi metodi sono stati dimostrati per bersagli biologici utilizzando diversi simili piattaforme con diversi vantaggi, tra cui un commercialmente disponibile di ordinamento automatizzato magnetico-attivato delle cellule (autoMACS o autoMCS) strumento di ordinamento (Vedi tabella di materiali) 1,14,15 e dispositivi più specializzati che racchiudono il campione in una cartuccia usa e getta 7,9 o chip 39, una preziosa specifica per l'uso con gli organismi o le tossine che sono di livello 2 di biosicurezza (BSL-2) o superiore7. Questi metodi semi-automatizzati potrebbero essere esteso per ordinare per peptidi in grado di legarsi ai materiali abiotici in se i materiali sono magnetici o hanno la capacità di essere rivestito su magnetic beads e per l'uso con diversi organismi (come batteri anaerobici) se l'ordinamento e le condizioni di crescita sono alterate. Oltre alle librerie visualizzazione batterica di ordinamento, lo strumento di autoMCS commerciale utilizzato qui anche è stato utilizzato in parte per le fasi iniziali della scoperta di frammenti di anticorpo umano a catena singola visualizzata sulla superficie del lievito, seguita da ulteriore isolamento utilizzando fluorescente attivato Cell Sorting (FACS) 40. I vantaggi primari ad semi-automazione sono diminuiti ordinamento tempo e fatica e più robusto e riproducibile eliminazione delle cellule non associate da biglie magnetiche durante le fasi di lavaggio, che porta alla riduzione di falsi positivi, meno giri di ordinamento richiesti e meno complicati downstream analisi 9,14. Nel caso lo strumento commerciale autoMCS, ci sono più programmi pre-caricati che possono essere ottimale per diverse applicazioni, quali negativo pre-ordinamento (svuotamento), priorità purezza, minimizzando il volume di campione finale e aumentando o diminuendo la sensibilità per l'isolamento di cellule rare 41.
Il focus di questo lavoro è dimostrare la metodologia per biopanning una biblioteca di esposizione batterica utilizzando lo strumento di autoMCS disponibili in commercio e di esporre il processo di pensiero applicato nell'analisi e riducendo al minimo la piscina risultante dei candidati in al fine di facilitare l'estensione ad altre applicazioni. La libreria di display utilizzata qui (Vedi tabella materiali) 12,13 contiene circa 109- 1011 15-mer unico peptidi visualizzati tramite una versione modificata della proteina della membrana esterna batterica OmpX in un natura non vincolata alla superficie delle cellule, che dovrebbe essere rappresentativo del peptide libero in soluzione, se prodotta sinteticamente. Questa impalcatura di proteine inoltre contiene un peptide di controllo positivo P2X al C-terminale per il monitoraggio di espressione attraverso il legame YPet Mona. Tuttavia, una biblioteca acquistata o romanzo con diversità adatto e altre caratteristiche necessarie per l'applicazione specifica desiderata dovrebbe funzionare allo stesso modo con questa procedura di biopanning, anche se alcuni cambiamenti minori possono essere richiesti. Nella Figura 1è illustrato uno schema di questo protocollo di biopanning. Inoltre, il protocollo potrebbe essere adattato ad altri automatizzato piattaforme ordinamento magnetici e altre strategie di ordinamento. Cernita manuale magnetico con un magnete di benchtop è stata dimostrata con successo, anche se con analisi a valle più complicato e che richiede tempo richiesto dovuto aumentato falsi positivi 14e ciò nonostante fornisce un'opzione alternativa per la autoMCS passi se nessuna cella magnetica automatica l'ordinamento dispositivo è disponibile.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-545</td>
			<td>Automated cell separator for use with magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth, Miller (LB)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-500</td>
			<td>Thickening/geling agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library</td>
			<td>Cytomx Therapeutics</td>
			<td>N/A; http://cytomx.com/contact/</td>
			<td>On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arabinose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3256-500G</td>
			<td>Sugar, for induction of protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0780-10L</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI21327</td>
			<td>Adds biotin molecule to primary amines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Biotin Quantitation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI28005</td>
			<td>Ensures biotin molecule is covalently bound to protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65601</td>
			<td>Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td>Protein, used as blocking agent for non-specific binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Sugar, for growth and impeding inducible protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ypet Mona</td>
			<td>UCSB and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488 NHS Ester</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46403</td>
			<td>For conjugating protein target to fluorophore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S866</td>
			<td>Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSFlow</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>342003</td>
			<td>Buffer for running FACS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-021-101</td>
			<td>For MACS Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Running Buffer &#8211; MACS Separation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Washing Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-092-987</td>
			<td>For autoMACS instrument maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E505-4L</td>
			<td>Decontamination of autoMACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6279-1L</td>
			<td>For bacterial freezer stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill 15 rack</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-952</td>
			<td>For MACS Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview</td>
			<td>For assessment of peptide binding to target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>659523</td>
			<td>For assessment of peptide binding to target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A13346</td>
			<td>Bench top cell separator for use with magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Sequencing</td>
			<td>Genewiz</td>
			<td>N/A; https://www.genewiz.com/</td>
			<td>DNA and Colony Sequencing Services</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400</td>
			<td>For use with sequence analysis macro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrax Protective Antigen (PA)</td>
			<td>List Biological Laboratories, Inc.</td>
			<td>171</td>
			<td>Target protein used as example for representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrax</td>
			<td>ECBC and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rivax</td>
			<td>ECBC and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated biopanning of bacterial display libraries for peptide affinity reagent discovery and analysis of resulting isolates

Librerie di visualizzazione batterica di Biopanning è una tecnica collaudata per la scoperta di reagente di affinità del peptide per il riconoscimento degli obiettivi sia biotici e abiotici. I reagenti di affinità del peptide possono essere utilizzati per applicazioni simili agli anticorpi, tra cui rilevamento e terapeutica, ma sono più robusti e in grado di eseguire in ambienti più estremi. Arricchimento specifico degli agenti di acquisizione di peptide ad un target di proteina di interesse è migliorata utilizzando metodi di ordinamento semi-automatizzati che migliorare associazione e lavare i passaggi e quindi diminuiscono l'avvenimento dei raccoglitori di falsi positivi. Un metodo di ordinamento semi-automatico è descritto nel presente documento per uso con una commerciale automatizzata magnetico attivato cella ordinamento dispositivo con un display batterico senza vincolato ordinamento biblioteca esprimendo casuale 15-mer peptidi. Con lievi modifiche, questi metodi sono estensibili ad altri automatizzato dispositivi, altre librerie di ordinamento e altri organismi. Un obiettivo primario di questo lavoro è quello di fornire una metodologia globale ed esporre il processo di pensiero applicato nell'analisi e riducendo al minimo la piscina risultante dei candidati. Queste tecniche includono l'analisi di associazione sul cellulare mediante fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS), per valutare l'affinità e specificità durante l'ordinamento e nel confronto tra singoli candidati, e l'analisi del peptide sequenze per identificare tendenze e sequenze di consenso per capire e potenzialmente migliorare l'affinità e specificità per la destinazione di interesse.

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Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Librerie di visualizzazione batterica di Biopanning è una tecnica collaudata per la scoperta dei reagenti di affinità del peptide, un'alternativa affidabile agli anticorpi. Il metodo di ordinamento semi-automatizzato nel presente documento ha razionalizzato biopanning per ridurre l'occorrenza di falsi positivi. Qui illustriamo il processo di pensiero e tecniche applicate nella valutazione dei candidati e minimizzazione dell'analisi a valle.

Biopanning semi-automatizzato di librerie visualizzazione batterica per Peptide affinità reagente scoperta e l'analisi degli isolati risultanti

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