Name: semi-automated biopanning of bacterial display libraries for peptide affinity reagent discovery and analysis of resulting isolates
Uploaded: 2017-12-06T12:30:00
Duration: 13 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates at JoVE.com

Forfatterne ønsker å erkjenne støtte fra US Army Research Laboratory (ARL) Postdoctoral Fellowship Program, administrert av Oak Ridge tilknyttet universitetene gjennom en kontrakt med ARL, gjennom utnevnelsen av Dr. Justin P. Jahnke. Gjenværende midler ble gitt av sensorer og elektron enheter Direktoratet på ARL. Forfatterne vil også gjerne takke Daugherty laboratoriet UCSB for deling bakteriell vise biblioteket og informasjon for kloning YPet Mona reagens, Dr. Bryn Adams for støtte i kloning YPet Mona reagensen ARL, Dr. Joshua Kogot for sitt innledende arbeid på og opplæring i biopanning av bakteriell vise biblioteker, Alena rolige av Edgewood kjemiske og biologiske Center for deling plasmider brukes til å uttrykke og rense abrax og rivax proteiner, Brandi Dorsey kundestøtte for isolering av PA bindende peptider, Qin Guo kundestøtte foreløpige eksperimenter for isolering av abrax binding peptider og Dr. Jessica Terrell for nyttig diskusjoner om dette manuskriptet.

Forfatterne ikke avsløre

Biopanning bakteriell skjerm biblioteker har vært en vellykket tilnærming til isolering av affinitet reagenser, og peptider tilbyr et nyttig alternativ til antistoffer for anerkjennelse når bestemte kriterier, for eksempel stabilitet i ekstreme miljøer. Biopanning av disse bibliotekene har blitt strømlinjeformet med autoMCS-metodene som er beskrevet her, og en kommersielt tilgjengelig autoMCS plattform utvider denne teknologien til et mye større publikum. I forhold til tradisjonelle vekslende MCS/FACS Sorteringsmetodene for bakteriell viser biblioteker, autoMCS metoder er billigere fordi de ikke krever investeringer i en dyrere FACS instrument sortering og isolere bundet cellene, i stedet for typen flyt cytometer som brukes her som er bare i stand til analyse 14. Kritisk trinnene for vellykket biopanning ved autoMCS inkluderer separasjon favorittprogram, negative sortering mot potensielle kors-reaktantene å redusere falske positiver, overvåking biblioteket berikelse bruker FACS for å avgjøre når du skal stoppe biopanning, og Smart analyse av kandidaten å unngå tungvint screening av hundrevis av kandidater.
Eksemplene beskrevet her viser vellykkede biopanning av valgte bakteriell skjerm bibliotek for to separate mål, PA og abrax, men med litt annerledes analysen strategier skyldes forskjeller i peptid sekvenser for hvert utvalg av kandidater etter fire runder av biopanning. PA var enkel tilfelle, sekvens analyse demonstrere klare trender fra peptid sekvensene som gjentatt minst en gang i 144 kolonier. Dette var alene nok til å bestemme en konsensus sekvens for PA mål, og de koloniene som inneholdt konsensus eller en lignende sekvens var de beste kandidatene i forholdet mellom binding til PA versus bindingen til kontrollen streptavidin negativ. Men vil dette ikke alltid være tilfelle. For abrax målet, sekvensering 100 kolonier førte til fem gjentatte sekvenser, men trenden i disse sekvensene var mindre klar enn en tendens til å inneholde aromatiske aminosyre rester og aspartic syre eller asparagine. Den anslåtte "konsensus" fra gjentatte sekvenser bare kunne er produsert og testet for affinitet til abrax, men siden ingen overordnet sekvenser inneholdt eksakte konsensus sekvensen, vi tilbake til listen over sekvensert kolonier og observert at andre kandidater som hadde mer trender til felles. Faktisk inneholdt to koloniene en lignende sekvens til "konsensus" fra gjentakelser alene, (FWDTWF stedet for FWAWF), som hadde den samme trenden av tryptofan, fenylalanin, aspartic syre og rester, men med ulik avstand. En av disse peptider var en rekkefølge for repetisjon, var ikke. Disse to sekvenser, sammen med en tredje sekvensen som inneholder en lignende variant, var blant de topp 5 bindemidler testet i affinitet for abrax. Topp dokumentordneren samlet AX-A05, vises også lignende trender. Resultatene for abrax viser at tilnærming som veksler flere ganger mellom sekvens analyse og tilhørighet og spesifisitet analyse vil noen ganger være nødvendig avhengig av det valgte målet. Resultatene for abrax målet også viser graden av spesifisitet som kan oppnås over et ligner protein (rivax 1,15).
AutoMCS programmene valgt for våre studier var Posselds og Posseld, som begge for positiv utvalg av merket målcellene med lav frekvens, mindre enn 5% av befolkningen første. I begge tilfeller passere celler gjennom to magnetiske kolonner. Ved Posselds programmet, men passere celler sakte den første kolonnen til å øke eksponeringen tiden 41. I tillegg til programmet beskrivelsen gitt av produsenten av kommersielle autoMCS enheten (se Materialer tabell) 41, disse programmene ble valgt etter en innledende sammenligning av flere potensielle programmer. Hver programmets evne til å unngå trekke ut falske positiver fra en homogen kultur negativ kontroll celler, og med hell isolere kjent dokumentordneren til et mål av interesse fra en blandet kultur som inneholder negativ kontroll cellene spiked med en synkende prosentandel av kjente dokumentordneren ble sammenlignet. Hvis betydelig avvik fra programmene beskrevet her, kan en lignende sammenligning være nyttig i programmet utvalg for det nye programmet. Men tidligere publisert resultatene sammenligne disse to programmene (Posseld og Posselds) for isolering av peptid affinitet reagenser for PA viste at bruker en av disse programmene for alle fire budrunder biopanning førte til isolering av peptider med lignende tilhørighet og spesifisitet for PA og fastsetting av WXCFTC konsensus. De viktigste forskjellene var at Posseld, med sin raskere strømningsrate, sortert raskere og bindende affinitet for målet var derfor høyere etter to runder med biopanning, mens ved hjelp av Posselds førte til flere unike sekvenser etter fire runder med biopanning 14. lære fra dette, strategien ble endret litt når biopanning for abrax innbindingen peptider å innlemme både fordeler: Posselds ble brukt til runde 1 for å gi mer eksponeringstid under denne viktige skritt der mangfold er høyest, men da det programmet ble byttet til Posseld for raskere isolering av de høyeste affinitet bindemidler under runder 2-4 1,15. Dette viste seg å være ideell for abrax, spesielt siden den nMFI og prosent bindende var både høyere for abrax sortering 4.omg sammenlignet med PA sortering 4.omg med enten program (figur 2 og Figur 3 og Sarkes et al. 2015 14), men en direkte sammenligning med en strategi versus den andre med samme mål ville være nødvendig for en mer avgjørende sammenligning. Hvilket program er best for en bestemt applikasjon kan avhenge personlige mål og sortering biblioteket brukes nivået av peptid uttrykk som oppnås med endringer i betingelsene beskrevet her.
Ikke diskutert her er potensielle resultater fra biopanning abiotiske materiale, men vi har også brukt samme bakteriell Vis biblioteket for biopanning mot bulk aluminium 2. Denne studien ble ikke utført med autoMCS, men lignende studier kan oppnås med autoMCS hvis materialet er tilgjengelig på, eller kan være belagt på eller konjugert til en magnetisk perle. I bulk aluminium studien var personlige aminosyre analyse og sekundær modellering nyttig i å forstå hva kjørte den forpliktende tilhørighet av isolerte peptider, siden ingen konsensus sekvensen var bestemt 2. Selv med biologiske mål, kan dette være nødvendig å forstå hva som driver den forpliktende tilhørighet for noen mål, som er grunnen til regnearket generert fra makroen "eCPX_Sequencing" inneholder en kategori med personlige rester frekvensanalyse. Hvis ingen gjentatte sekvenser er sett i tillegg til manglende konsensus, og rester frekvens viser ingen mønster, men kan andre typer analyse være nødvendig. I tillegg kan videre sortering runder være nødvendig å unngå screening et mye større antall kandidater for ned-utvalg av de med tilstrekkelig affinitet til ønsket mål.
Med den økende tilgjengeligheten av neste generasjons sekvensering, kunne en grundigere studie utføres til å bestemme den mest lovende kandidat før testing affinitet og bestemme omfanget av berikelse etter hver runde i biopanning. Men må sekvenser flytte til bindende analyse trinn opprettes på nytt ved kloning, hvis de ikke er av høy nok frekvens lett isolere med rutinemessig kolonien sekvensering av titalls eller hundrevis av kolonier. Som denne teknologiutviklingen, blir rimeligere og mer rutinemessig, og spesielt med mulighet for kolonien isolasjon, vil det trolig være den beste måten å analysere biopanning data. Det kan føre til utviklingen av den måten enkelte sekvenser, og hele biblioteket, utvikle seg. I tillegg kan bakterier i sortering biblioteket mutere over tid, som kunne lede sortering mot celler med raskere vekst eller bakterier som overexpress genomisk proteiner kunne binde et materiale selv uten skjerm stillaset og peptid uttrykk for forekomst. Derfor når lovende kandidater dukker opp, er det verdt å isolere plasmider DNA, retransforming fersk E. coli, og bekrefter peptid binding via FACS. Hvis du skal bruke peptid i celle-fri format, bør affinitet også vurderes for den gratis peptid. For eksempel ble peptid affinitet reagenser oppdaget gjennom bakteriell skjerm for målet SEB syntetisk produsert av cellen og analysert av mer tradisjonelle metoder som enzym knyttet immunosorbant analysen (ELISA), og på-cellen (via FACS) og av-celle (via ELISA) affinitet ble sammenlignet med Kds bestemmes av begge metoder 7.
Selv om styrken av biotin-streptavidin interaksjon gjør det en perfekt strategi for fange av protein mål og bundet peptider, kan denne prosedyren endres for andre fange strategier. Direkte kobling protein magnetiske perler, som epoxy og karboksylsyre perler, har vært vellykket og fjerner en bindende trinn. Direkte vedlegg kan imidlertid hindre potensielle bindende områder i en bestemt eller ikke-spesifikk måte, avhengig av vedlegg strategi. En ekstra fordel å bruke streptavidin perler er at mindre stabil protein mål kan være fersk biotinylated på 30 min eller lagret frosset, hvis nødvendig, mens perlene seg gjerne krever lengre inkubasjon med protein for cross-linking og vanligvis lagret på 2-8° C. Den foreslåtte starte konsentrasjonen av biotinylated protein mål her, 600 nM, har vært vellykket for flere mål, men det kan være mulig å isolere peptid fange reagenser med økt affinitet Hvis denne konsentrasjonen er redusert. I tillegg kan denne metoden være utvidet til og endret til andre bakterielle skjerm og andre organismer. Denne fremgangsmåten kan for eksempel utføres i fravær av oksygen for bruk med anaerobes eller i andre miljøer for bruk med extremophiles å isolere peptider med unike egenskaper. Peptider og/eller konsensus bestemt for et bestemt mål av interesse kan være potensielt brukt på celler som en levende materiale eller produsert syntetisk av celler. Syntetisk peptider kan være mer modnet for utvikling av enda høyere affinitet og mer robust Protein katalysert fange (PCC) agenter for bruk i sensorer eller andre programmer der ville antistoffer som vanligvis brukes for binding eller anerkjennelse 38,55. Molekylær modellering kan også brukes til å avgjøre binding av peptid med målet, som nylig ble utført for abrax innbindingen peptider og konsensus oppført i figur 5C 1. Samlet biopanning bakteriell skjerm biblioteker for peptid affinitet reagenser er en rask, enkel og kraftig alternativ til produksjon av antistoffer for anerkjennelse og påvisning av protein mål, og denne semi-automatisert biopanning tilnærming har produsert pålitelige resultater med vidtrekkende applikasjoner.

Biopanning er en velprøvd teknikk for affinitet reagens oppdagelsen, med bakteriell vise biblioteker en praktisk kilde for peptid affinitet reagenser 1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24. Tilsvarende vil phage vise 25,26 og gjær vise 27,28, peptidene er utsatt på cellens overflate og er tilgjengelig til å binde til både biotiske og abiotiske mål, med disse interaksjoner drevet av både peptid ryggraden og de unike egenskapene til de aminosyre side-kjeder 29. I motsetning til phage skjerm, bakterier seg selvreplikerende og inneholder alle genetisk materiale som kreves for visning uten elueringsrør av bundne phage og infeksjon av celler. I motsetning til gjær display er bakteriell skjerm raskere på grunn av den raske (ca 20 min 30) dobling tid av Escherichia coli. Resulterende peptid affinitet reagensene kan produseres av cellen for bruk i en rekke sensing plattformer 16,17,26 og har potensial for bruk som levende materiale når vises celle 2 , 31 , 32. sammenlignet med monoklonale antistoffer for anerkjennelse av konkrete mål, peptider er mye mindre og mer fleksible, og peptid skjerm biblioteker kan lett manipuleres på DNA-nivå for å unngå bestemte aminosyrer, som cystein 33 . Peptider er stadig utnyttes for therapeutics 34,35,36 og andre programmer der antistoffer ville vanligvis benyttes på grunn av deres brukervennlighet oppdagelsen, reproduserbare syntetisk (av-celle ) produksjon og overlegen vedlikehold av ytelse i ekstreme miljøer, gir en funksjonell reagens selv etter eksponering for høy temperatur eller langtidslagring uten kjøling 37,38. Muligheten til å overvinne den kalde kjeden for lagring av reagenser er av spesiell interesse for det amerikanske forsvarsdepartementet, for eksempel som må fungere i ekstreme miljøer. Termisk stabilitet var derfor for affinitet reagenser erkjenner de valgte målene gitt som eksempler i dette manuskriptet.
Biopanning bakteriell skjerm biblioteker har nylig blitt enda mer enkle og pålitelige med bruk av semi-automatisert magnetisk-aktivert celle sortering (Mac eller MCS) metoder 9,14,39. Disse metodene har vist for biologiske mål ved hjelp av flere lignende sortering plattformer med ulike fordeler, inkludert en kommersielt tilgjengelig automatisert magnetisk-aktivert celle sortering (autoMACS eller autoMCS) instrument (se tabell over materialer) 1,14,15 og mer spesialiserte enheter som omslutter prøven i en engangs patron 7,9 eller chip 39, en verdifull spesifikasjon for bruk med organismer eller giftstoffer som grad 2 (BSL-2) eller høyere7. Metodene halvautomatisk kan utvides for å sortere for peptider kunne binde til abiotiske materialer hvis materialet er magnetisk eller har muligheten til å være belagt på en magnetisk perle, og for bruk med ulike organismer (for eksempel anaerob bakterier) hvis sortering og vekst betingelser er endret. I tillegg til sortering bakteriell skjerm biblioteker, har kommersielle autoMCS apparatet brukes her også blitt brukt delvis for første trinn av oppdagelse av menneskelig single-kjeden antistoff fragmenter vises på overflaten av gjær, etterfulgt av ytterligere isolasjon bruke lysstoffrør aktivert celle sortering (FACS) 40. Den primære fordeler til semi automatisering er redusert sortering tid og krefter og mer robust og reproduserbar eliminering av ubundet celler fra de magnetiske perlene under vask fremgangsmåten, fører til redusert falske positiver, færre nødvendig sortering runder, og mindre komplisert ned-stream analyse 9,14. Ved kommersiell autoMCS instrumentet, finnes det flere forhåndsinstallerte programmer som kan være optimal for forskjellige programmer, for eksempel negative pre-sortering (tømming), prioritere renhet, minimere siste eksempel volum og øker eller redusere følsomheten for isolering av sjeldne celler 41.
Fokus for dette arbeidet er å demonstrere metodikken for biopanning en bakteriell vise biblioteket ved hjelp av kommersielt tilgjengelig autoMCS apparatet, og for å forklare tankeprosessen brukt analysere og minimere den resulterende pool av kandidater i for å lette utvidelsen for andre programmer. Vis biblioteket her (se tabell av materialer) 12,13 inneholder ca 109- 1011 unike 15-mer peptider vises via en modifisert versjon av bakteriell ytre membran protein OmpX i en ubegrenset natur på celleoverflaten, som forventes å være representativt for den gratis peptid i løsning hvis produsert syntetisk. Denne protein stillaset inneholder i tillegg en positiv kontroll P2X peptid på C-terminus for overvåking uttrykk via binding til YPet Mona. Imidlertid skal kjøpt eller romanen bibliotek med egnet mangfold og andre egenskaper som er nødvendige for det bestemte programmet ønsket fungere på samme måte med denne biopanning fremgangsmåten om noen mindre endringer kan være nødvendig. En skjematisk av denne biopanning protokollen er illustrert i figur 1. I tillegg protokollen kan tilpasses til annet automatisert magnetiske sortering plattformer og andre sortering strategier. Manuell magnetiske sortering med en Borstemmaskin magnet har blitt vellykket demonstrert, men med mer komplisert og tidkrevende nedstrøms analyse kreves skyldes økt falske positiver 14og likevel gir et alternativ til den autoMCS trinnene hvis ingen automatisert magnetiske celle sortering enhet er tilgjengelig.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-545</td>
			<td>Automated cell separator for use with magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth, Miller (LB)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-500</td>
			<td>Thickening/geling agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library</td>
			<td>Cytomx Therapeutics</td>
			<td>N/A; http://cytomx.com/contact/</td>
			<td>On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arabinose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3256-500G</td>
			<td>Sugar, for induction of protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0780-10L</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI21327</td>
			<td>Adds biotin molecule to primary amines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Biotin Quantitation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI28005</td>
			<td>Ensures biotin molecule is covalently bound to protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65601</td>
			<td>Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td>Protein, used as blocking agent for non-specific binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Sugar, for growth and impeding inducible protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ypet Mona</td>
			<td>UCSB and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488 NHS Ester</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46403</td>
			<td>For conjugating protein target to fluorophore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S866</td>
			<td>Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSFlow</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>342003</td>
			<td>Buffer for running FACS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-021-101</td>
			<td>For MACS Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Running Buffer &#8211; MACS Separation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Washing Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-092-987</td>
			<td>For autoMACS instrument maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E505-4L</td>
			<td>Decontamination of autoMACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6279-1L</td>
			<td>For bacterial freezer stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill 15 rack</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-952</td>
			<td>For MACS Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview</td>
			<td>For assessment of peptide binding to target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>659523</td>
			<td>For assessment of peptide binding to target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A13346</td>
			<td>Bench top cell separator for use with magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Sequencing</td>
			<td>Genewiz</td>
			<td>N/A; https://www.genewiz.com/</td>
			<td>DNA and Colony Sequencing Services</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400</td>
			<td>For use with sequence analysis macro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrax Protective Antigen (PA)</td>
			<td>List Biological Laboratories, Inc.</td>
			<td>171</td>
			<td>Target protein used as example for representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrax</td>
			<td>ECBC and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rivax</td>
			<td>ECBC and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated biopanning of bacterial display libraries for peptide affinity reagent discovery and analysis of resulting isolates

Biopanning bakteriell skjerm biblioteker er en velprøvd teknikk for peptid affinitet reagens funn for anerkjennelse av både biotiske og abiotiske mål. Peptid affinitet reagenser kan brukes lignende programmer til antistoffer, inkludert sensing og therapeutics, men er mer robuste og kan utføre i mer ekstreme miljøer. Bestemt anriking av peptid fange agenter til et protein mål av interesse er forbedret med semi-automatisert Sorteringsmetodene forbedre bindende vaske trinnene og dermed redusere forekomsten av falske positive bindemidler. En semi-automatisert Sorteringsmåte er beskrevet her for bruk med en kommersiell automatisert magnetisk-aktivert celle sortering enhet med en ubegrenset bakteriell skjerm sortere biblioteket uttrykke tilfeldig 15-mer peptider. Med små modifikasjoner, disse metodene er utvidbart til andre automatiserte enheter, andre sortering biblioteker og andre organismer. Et hovedmål for dette arbeidet er å gi en omfattende metodikk og forklare tankeprosessen brukt analysere og minimere den resulterende pool av kandidater. Disse teknikkene omfatter analyse-celle bindingen med fluorescens-aktivert cellen sortering (FACS), for å vurdere tilhørighet og spesifisitet under sortering og sammenligning personlige kandidater, og analyse av peptid sekvenser for å identifisere trender og konsensus sekvenser for å forstå og potensielt forbedre affinitet til og spesifisitet for mål av interesse.

Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates at JoVE.com

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning bakteriell skjerm biblioteker er en velprøvd teknikk for oppdagelse av peptid affinitet reagenser, en robust alternativ til antistoffer. Halvautomatisk sorteringsmetoden her har strømlinjeformet biopanning for å redusere forekomsten av falske positiver. Her viser vi trodde prosessen og teknikker brukt i evaluere kandidater og minimere nedstrøms.

Semi-automatisert Biopanning av bakteriell vise bibliotekene for peptid affinitet reagens oppdagelsen og analyse av resulterende isolerer

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metode for å identifisere lavmolekylære inhibitorer av protein-protein samhandling mellom HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Bakteriell Inner-membran Display for Screening et bibliotek av antistoff-fragmenter

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Bestemmelse av høy-affinitets antistoff-antigen-bindingskinetikken ved hjelp av fire Biosensor plattformer

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Enkel manipulering av arkitekturer i Protein-basert Hydrogels for celle kultur programmer

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Analyse av histonantistof spesifisitet med peptidmikroarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: trinns affinitet rensing for parallell analyse av Protein-Protein og Protein-metabolitten komplekser

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Ekstracellulære Protein Microarray teknologi for høy gjennomstrømning påvisning av lav affinitet reseptor-Ligand interaksjoner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-time, semi-automatisert fluorescerende måling av luftveiene overflaten flytende pH av primær menneskelige Luftveisepitel celler

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Native Cell Membran Nanopartikler System for membran Protein-Protein Interaksjon Analyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases

Bruke Phage Display til å utvikle Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases

Ubiquitin is a small 8.6 kDa protein that is a core component of the ubiquitin-proteasome system. Consequently, it can bind to a diverse array of proteins ...