Name: semi-automated biopanning of bacterial display libraries for peptide affinity reagent discovery and analysis of resulting isolates
Uploaded: 2017-12-06T12:30:00
Duration: 13 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates at JoVE.com

Авторы хотели бы отметить поддержку лаборатории исследований армии США (СВМ) программа Докторантура стипендий, ведении дуб Ридж ассоциированных университетов через контракт с АВМ, путем назначения д-ра Джастин P. Янке. Оставшиеся средства были предоставлены датчиков и электронных устройств дирекции на ARL. Авторы также хотел бы поблагодарить лаборатории Догерти на UCSB для обмена бактериальной отображения библиотеки и информацию для клонирования YPet Mona реагент, доктор Брин Адамс для поддержки клонирования YPet Mona реагента в АРЛЬ, д-р Джошуа Kogot для его первоначальной работы по и обучение в biopanning бактериальной отображения библиотек, Алена спокойствие Edgewood химических и биологических центр для обмена плазмид, используется для выражения и очистить abrax и rivax белки, Brandi Dorsey технической поддержки для изоляции ПА привязки пептидов, Цинь Guo для технической поддержки предварительных экспериментов для изоляции abrax привязки пептидов, и доктор Джессика Terrell для полезной дискуссии относительно этой рукописи.

Авторы не имеют ничего сообщать

Biopanning является Проверенная техника для сходства реагент обнаружения, с бактериальной отображения библиотек удобный источник для пептида сродство реагенты 1,2,3,4,5, 6,,78,9,10,11,12,13,14, 15,16,,1718,19,20,21,,2223, 24. Аналогично к ФАГ отображения 25,26 и дрожжи отображения 27,28, пептиды подвергаются на поверхности клеток и доступны для привязки к биотическим и абиотическим цели, с этими взаимодействиями движимый пептида позвоночника и уникальные свойства боковой цепи аминокислоты 29. В отличие от фага дисплей бактерии сами самовоспроизводящихся и содержат все генетического материала, необходимые для отображения без элюции связанных ФАГ и повторного заражения клеток. В отличие от дрожжей дисплей бактериальных дисплей быстрее из-за быстрого (примерно 20 минут 30) время Escherichia coliудвоения. Полученный пептид сродство реагенты могут быть произведены вне ячейки для использования в различных зондирования платформ 16,17,26 и имеют потенциал для использования как живые материалы при отображении ячейки 2 , 31 , 32. по сравнению с моноклональных антител для признания конкретных целей, пептиды, гораздо меньше и более гибкой, и пептида дисплея библиотек можно легко манипулировать на уровне ДНК, чтобы избежать определенных аминокислот, например хвоща 33 . Пептиды все чаще используются для терапии 34,,3536 и других применений, где антитела обычно будет использоваться из-за их легкости открытия, воспроизводимые синтетические (с клеток ) производства и превосходное обслуживание работы в экстремальных условиях, обеспечивая функциональные реагент даже после воздействия высокой температуры или длительного хранения без охлаждения 37,38. Способность преодолевать холодовой цепи для хранения реагентов представляет особый интерес для министерства обороны, к примеру, который должен функционировать в экстремальных условиях. Термостабильность был поэтому желательно особенность сродство реагентов, признавая выбранной цели, в качестве примеров в этой рукописи.
Недавно biopanning бактериальной отображения библиотеки стал еще более простым и надежным с использованием полуавтоматического магнитные активации клеток, сортировка (MACS или MCS) методы 9,14,39. Эти методы были продемонстрированы для биологических объектов, используя несколько аналогичных сортировки платформ с различными преимуществами, включая коммерчески доступных автоматизированных магнитные активации клеток, сортировка (autoMACS или autoMCS) инструмент (см. таблицу материалы) 1,,1415 и более специализированных устройств, которые заключают образца в одноразовые патрон 7,9 или чип 39, ценный спецификации для использования с организмов или токсины, которые являются 2-го уровня биобезопасности (BSL-2) или выше7. Эти полуавтоматические методов может быть продлен для сортировки для пептиды способны связывать абиотические материалы, если материалы, магнитного или имеют возможность быть покрыты на магнитный шарик и для использования в различных организмов (например, анаэробных бактерий), если сортировка и меняются условия роста. Помимо сортировки бактериальных отображения библиотек, коммерческих autoMCS инструмент, используемый здесь также был использован в части для первоначальных шагов обнаружения фрагментов человеческих антител сингл цепи, отображается на поверхности дрожжей, после чего дальнейшей изоляции использование флуоресцентных активирован ячейку Сортировка (FACS) 40. Основные преимущества для полу автоматизации уменьшаются сортировки времени и усилий и более надежных и воспроизводимых ликвидации свободных клеток от магнитной бусины во время стирки шаги, ведущие к сокращению ложных срабатываний, меньшее количество необходимых раундов сортировки и менее сложный анализ вниз по течению 9,14. В случае коммерческих autoMCS инструмент, существует несколько предварительно загруженных программ, которые может быть оптимальным для различных приложений, таких как негативные предварительной сортировки (истощение), приоритетности чистоту, свести к минимуму объем окончательного образца и увеличение или уменьшение чувствительности для изоляции редких клетки 41.
В центре внимания этой работы является продемонстрировать методологии biopanning бактериальной отображения библиотеки с помощью инструмента коммерчески доступных autoMCS и излагать мысли процесс применяется в анализе и минимизации результирующего числа кандидатов в чтобы облегчить расширение в другие приложения. Здесь используется библиотека отображения (см. таблицу материалов) 12,13 содержит около 109- 1011 уникальный 15-mer пептиды отображается через модифицированную версию бактериальной внешней мембраны белка OmpX в непринужденный характер на поверхности клеток, который, как ожидается, будет представитель свободного пептида в растворе, если производится синтетически. Этот белок эшафот дополнительно содержит положительный контроль P2X пептид в C-terminus для наблюдения за выражение через привязку YPet Мона. Однако купленных или Роман библиотека с подходящим разнообразия и другие характеристики, необходимые для конкретного приложения желаемого следует аналогичным образом работать с этой процедурой biopanning, хотя некоторые незначительные изменения могут потребоваться. Схема этого протокола biopanning показано на рисунке 1. Кроме того, протокол могут быть адаптированы для других автоматизированных магнитные сортировки платформ и другие стратегии сортировки. Ручная сортировка магнитные с магнитом benchtop было успешно продемонстрировано, хотя и с более сложным и трудоемким течению анализа требуется из-за ложных срабатываний 14увеличилось и тем не менее обеспечивает альтернативный вариант для autoMCS шаги, если не автоматизированных магнитные ячейку Сортировка устройств доступен.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-545</td>
			<td>Automated cell separator for use with magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth, Miller (LB)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-500</td>
			<td>Thickening/geling agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library</td>
			<td>Cytomx Therapeutics</td>
			<td>N/A; http://cytomx.com/contact/</td>
			<td>On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arabinose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3256-500G</td>
			<td>Sugar, for induction of protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0780-10L</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI21327</td>
			<td>Adds biotin molecule to primary amines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Biotin Quantitation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI28005</td>
			<td>Ensures biotin molecule is covalently bound to protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65601</td>
			<td>Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td>Protein, used as blocking agent for non-specific binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Sugar, for growth and impeding inducible protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ypet Mona</td>
			<td>UCSB and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488 NHS Ester</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46403</td>
			<td>For conjugating protein target to fluorophore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S866</td>
			<td>Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSFlow</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>342003</td>
			<td>Buffer for running FACS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-021-101</td>
			<td>For MACS Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Running Buffer &#8211; MACS Separation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Washing Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-092-987</td>
			<td>For autoMACS instrument maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E505-4L</td>
			<td>Decontamination of autoMACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6279-1L</td>
			<td>For bacterial freezer stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill 15 rack</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-952</td>
			<td>For MACS Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview</td>
			<td>For assessment of peptide binding to target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>659523</td>
			<td>For assessment of peptide binding to target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A13346</td>
			<td>Bench top cell separator for use with magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Sequencing</td>
			<td>Genewiz</td>
			<td>N/A; https://www.genewiz.com/</td>
			<td>DNA and Colony Sequencing Services</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400</td>
			<td>For use with sequence analysis macro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrax Protective Antigen (PA)</td>
			<td>List Biological Laboratories, Inc.</td>
			<td>171</td>
			<td>Target protein used as example for representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrax</td>
			<td>ECBC and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rivax</td>
			<td>ECBC and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated biopanning of bacterial display libraries for peptide affinity reagent discovery and analysis of resulting isolates

Biopanning бактериальной отображения библиотек является Проверенная техника для пептида сродство реагент обнаружения для распознавания биотических и абиотических целей. Пептид сродство реагенты могут быть использованы для аналогичных приложений для антител, в том числе зондирования и терапии, но более надежные и способны выполнять в более экстремальных условиях. Конкретные обогащения агентов захвата пептида протеина цели интерес усиливается с использованием полуавтоматического сортировки методов, которые улучшают привязки и мыть шаги и таким образом уменьшить появление ложных положительных связующих. Полуавтоматический метод сортировки описан здесь для использования с коммерческих автоматизированных магнитные активированный ячейку Сортировка устройств с неограниченной бактериальных дисплеем, сортировка Библиотека, выражая случайные 15-mer пептиды. С незначительными изменениями, эти методы являются расширяемой для других автоматизированных устройств, другие сортировки библиотеки и других организмов. Основная цель этой работы заключается в предоставления всеобъемлющей методологии и излагать мысли процесс применяется в анализе и минимизации результирующего числа кандидатов. Эти методы включают анализ по ячейку привязки с помощью активированного флуоресценции клеток, сортируя (FACS), оценить сходства и специфичность в ходе сортировки и сравнения отдельных кандидатов, и анализ пептид последовательностей для выявления тенденций и консенсуса последовательности для понимания и повышение потенциально сродством к и специфичности для целевого объекта интереса.

Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates at JoVE.com

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning бактериальной отображения библиотек является Проверенная техника для обнаружения пептид сродство реагентов, надежной альтернативой антител. Полуавтоматический метод сортировки здесь усовершенствовал biopanning для уменьшения количества ложных срабатываний. Здесь мы показываем, мыслительный процесс и методы, применяемые в оценке кандидатов и минимизации течению анализа.

Полуавтоматическая Biopanning бактериальной отображения библиотек пептид сродство реагент обнаружения и анализа результате изолятов

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Способ идентификации низкомолекулярных соединений ингибиторов белок-белкового взаимодействия между HCN1 и TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Бактериальный Внутренняя мембрана-дисплей для скрининга библиотеки фрагментов антител

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Определение высокого сродства антитело-антиген-связывающий Kinetics с использованием четырех биосенсор платформы

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Простое управление архитектуры в гидрогели на основе белков для приложений культуры клеток

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Анализ специфичности гистонового антитела с пептидными микрочипами

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 в 1: один шаг очищение сродства для параллельного анализа протеин протеина и белка метаболит комплексов

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Внеклеточный протеин технология Microarray для высокой пропускной способности обнаружения низкого сродства рецептор лиганд взаимодействий

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

В режиме реального времени, полуавтоматические флуоресцентные измерения воздуха поверхности жидкости рН первичных человеческих дыхательных путей эпителиальных клеток

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Родная клеточная мембрана наночастицы системы membrane белка-белкового взаимодействия анализа

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases

Использование фагового дисплея для разработки модуляторов вариантов убиквитина для лигазов E3

Ubiquitin is a small 8.6 kDa protein that is a core component of the ubiquitin-proteasome system. Consequently, it can bind to a diverse array of proteins ...