Name: semi-automated biopanning of bacterial display libraries for peptide affinity reagent discovery and analysis of resulting isolates
Uploaded: 2017-12-06T12:30:00
Duration: 13 min 49 s
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Los autores desean reconocer el apoyo del programa de becas Postdoctoral laboratorio de investigación de los E.E.U.U. ejército (ARL), administrado por Oak Ridge Associated universidades a través de un contrato con ARL, a través de la designación del Dr. Justin P. Jahnke. Restante de financiación fue proporcionada por la dirección de dispositivos de electrónica en ARL y sensores. Los autores también desean agradecer el laboratorio Daugherty en el UCSB para compartir la pantalla bacteriana biblioteca e información para clonar el reactivo YPet Mona, Dr. Bryn Adams para apoyo en la clonación el reactivo YPet Mona a ARL, Dr. Joshua Kogot por su trabajo inicial en y formación en biopanning de exhibición bacteriana bibliotecas, Alena calma del producto químico de Edgewood y centro biológico para el intercambio de plásmidos utilizados para expresar y purificar abrax y proteínas rivax, Brandi Dorsey para la asistencia técnica para el aislamiento de péptidos de enlace PA, Guo Qin para soporte técnico de experimentos preliminares para el aislamiento de péptidos de enlace abrax y Dr. Jessica Terrell para discusiones útiles con respecto a este manuscrito.

Los autores no tienen nada que revelar

Biopanning exhibición bacteriana bibliotecas ha sido un método exitoso para el aislamiento de los reactivos de afinidad, y péptidos ofrecen una alternativa útil a los anticuerpos para el reconocimiento cuando criterios específicos, como la estabilidad en ambientes extremos. Biopanning de estas bibliotecas ha racionalizado mediante los métodos de autoMCS descritos aquí, y una plataforma de autoMCS disponibles en el mercado extiende esta tecnología a un público mucho más amplio. En comparación con la tradicional alternancia MCS/FACS métodos de clasificación de bacterias Mostrar bibliotecas, autoMCS métodos son menos costosos, ya que no requieren inversión en un instrumento más caro de FACS capaz de clasificar y aislar las células consolidadas, en lugar del tipo de citómetro de flujo que se utiliza aquí, que sólo es capaz de análisis 14. Los pasos críticos para éxito biopanning por autoMCS incluyen selección del programa de separación, clasificación contra potenciales Cruz-reactivos para reducir falsos positivos, control de enriquecimiento de la biblioteca utilizando FACS para determinar cuándo parar biopanning, negativo y análisis inteligente de la piscina del candidato para evitar la engorrosa investigación de centenares de candidatos.
Los ejemplos descritos demuestran biopanning acertado de la biblioteca de exhibición bacteriana solicitadas para dos objetivos separados, PA y abrax, aunque con estrategias de análisis ligeramente diferentes debido a diferencias en las secuencias de péptidos para cada agrupación de candidatos después de cuatro rondas de biopanning. PA fue el caso más sencillo, con análisis de la secuencia que demuestran tendencias claras de las secuencias de péptidos que repite al menos una vez en 144 colonias. Esto solo era suficiente para determinar una secuencia consenso para el objetivo de PA y las colonias que contenía el consenso o una secuencia similar eran los mejores candidatos en cuanto a la proporción de unión a PA frente Unión para el control negativo de estreptavidina. Sin embargo, esto no siempre será el caso. Para el objetivo de abrax, 100 colonias secuencia llevaron a cinco secuencias de repetición pero la tendencia en estas secuencias fue menos clara, que no sea una tendencia a contener residuos de aminoácido aromático y ácido aspártico o asparragina. Predijo el "consenso" de la repetición de secuencias sólo podría han sido producido y probados de afinidad a abrax, pero puesto que ninguna secuencia padres contiene la secuencia consenso exacto, regresamos a la lista de colonias secuenciadas y observa que otros candidatos que tenían más tendencias en común con cada otro. De hecho, dos colonias contienen una secuencia similar al "consenso" de las repeticiones de solas, (FWDTWF en vez de FWAWF), que tenía la misma tendencia de residuos de triptófano, fenilalanina y ácido aspártico, pero con diferente espaciado. Uno de estos péptidos es una secuencia de repetición, no. Estas dos secuencias, junto con una tercera secuencia, que contiene una variante similar, estaban entre los cuadernos top 5 probados en términos de afinidad por abrax. La carpeta superior general, AX-A05, también muestran tendencias similares. Los resultados de abrax demuestran que un enfoque que alterna varias veces entre el análisis de la secuencia y el análisis de afinidad y especificidad a veces será necesario, según el destino elegido. Los resultados para el objetivo de abrax también demuestran el nivel de especificidad que se logra sobre una proteína muy similar (rivax 1,15).
Los programas autoMCS seleccionados para nuestros estudios fueron Posselds y Posseld, ambos de la selección positiva de células blanco etiquetado con baja frecuencia, menos del 5% de la población inicial. En ambos casos, las células pasan por dos columnas magnéticos. En el caso del programa de Posselds, sin embargo, las células pasan más lentamente a través de la primera columna para aumentar el tiempo de exposición 41. Además de las descripciones del programa dadas por el fabricante del dispositivo de autoMCS comercial (ver la Tabla de materiales) 41, estos programas fueron escogidos después de una comparación inicial de varios programas potenciales. Capacidad de cada programa para evitar sacar falsos positivos de una cultura homogénea de las células del control negativo y para aislar con éxito una carpeta conocida para un objetivo de interés de una cultura mixta que contiene células de control negativo enriquecidas con una disminución porcentaje de la carpeta conocida, fueron comparados. Si se desvía significativamente de los fines descritos aquí, una comparación similar podría ser útil en la selección del programa de la nueva aplicación. Sin embargo, previamente publicado resultados comparando estos dos programas (Posseld y Posselds) para el aislamiento de péptido reactivos de afinidad para la PA demostrado que usando cualquiera de estos programas para las cuatro rondas de biopanning condujo al aislamiento de péptidos con similares afinidad y especificidad para PA y determinación del consenso de WXCFTC. Las principales diferencias eran Posseld, con su flujo más rápido, ordenado más rápidamente y atar afinidad para el objetivo por lo tanto fue mayor después de sólo dos rondas de biopanning, mientras que usando Posselds condujo a más secuencias únicas después de cuatro rondas de biopanning 14. aprendiendo de esto, la estrategia cambió ligeramente cuando biopanning para péptidos de enlace abrax incorporar ambos beneficios: Posselds fue utilizado para 1ª ronda para permitir más tiempo de exposición durante esta etapa crítica donde la diversidad es más alta, pero luego la programa fue cambiado a Posseld para el aislamiento rápido de las carpetas de afinidad más alta durante las rondas 2-4 1,15. Esto parece ideal para abrax, especialmente desde que el INR y Unión fueron más altas para abrax clasificación ronda 4 en comparación con PA ronda 4 con cualquiera de los programas de clasificación (figura 2 figura 3 y Sarkes et al 2015 14), pero una comparación directa con una estrategia frente a la otra con el mismo objetivo sería necesaria para una comparación más concluyente. Que programa es mejor para una aplicación particular pueden depender el destino individual, la biblioteca clasificación utilizado y el nivel de expresión de péptidos que se logra con cualquier cambio en las condiciones descritas aquí.
No discutido aquí son resultados potenciales de biopanning con materiales abióticos, pero también hemos usado la misma biblioteca de exhibición bacteriana para biopanning contra bulto de aluminio 2. Este estudio no se realizó con autoMCS, pero estudios similares podrían lograrse usando autoMCS si el material está disponible en, o podría recubierto o conjugado con una tira magnética. En el estudio de aluminio a granel, cada aminoácido análisis y modelado de la estructura secundaria fue útil para entender lo que conducía a la afinidad de unión de los péptidos aislados, puesto que ninguna secuencia consenso era determinado 2. Incluso con objetivos biológicos, esto puede ser necesario entender lo que está impulsando la afinidad de algunos objetivos, razón por la cual la hoja de cálculo generado por la macro "eCPX_Sequencing" incluye una pestaña con análisis de frecuencia de cada residuo. Si no repiten secuencias se ven además de la falta de un consenso, y frecuencia de residuos no muestra patrón, sin embargo, otros tipos de análisis pueden ser necesarios. Además, puede ser necesario para evitar un mayor número de candidatos para abajo-selección de las personas con afinidad suficiente para el objetivo deseado de detección más rondas de clasificación.
Con la creciente disponibilidad de secuencia de la generación siguiente, podría realizarse un estudio más exhaustivo para determinar a los candidatos más prometedores antes de la prueba de afinidad y para determinar el grado de enriquecimiento después de cada ronda de biopanning. Sin embargo, secuencias de pasar a la etapa de análisis de enlace necesite volver a crear mediante la clonación, si no son de frecuencia lo suficientemente alta para aislar fácilmente con la secuencia habitual Colonia de decenas o cientos de colonias. Esta tecnología avanza, cada vez menos costoso y más habitual, y sobre todo con una opción para el aislamiento de la Colonia, será probablemente sea la mejor forma de analizar datos biopanning. Puede conducir al esclarecimiento de las secuencias de manera individuales y la biblioteca entera, evolucionar. Además, las bacterias en la biblioteca clasificación pueden mutar con el tiempo, lo que podría sesgar la clasificación hacia las células con mayor tasas de crecimiento o bacterias que sobreexpresan proteínas genomic podemos de obligar a un material aún sin mostrar expresión de andamio y péptido, para instancia de. Por esa razón, una vez emergen de candidatos prometedores, cabe aislar el ADN del plásmido, retransforming frescos e. coli y confirmar enlace péptido por FACS. Si va a utilizar el péptido en un formato libre, afinidad también debe ser evaluada para el péptido libre. Por ejemplo, reactivos de afinidad péptido descubiertos a través de exhibición bacteriana para la meta SEB sintéticamente fueron producidos fuera de la célula y analizados por los métodos tradicionales de análisis enzimático ligado a enzimas (ELISA) y en el celular (vía FACS) y fuera de la célula (vía ELISA) afinidad fueron comparadas usando el Kds determinado por ambos métodos 7.
Aunque la fuerza de la interacción biotina-estreptavidina es una estrategia ideal para captura de objetivo de proteína y péptidos consolidados, este procedimiento puede modificarse para otras estrategias de captura. Acoplamiento directo de la proteína de granos magnéticos, tales como epoxi y granos de ácido carboxílico, ha tenido éxito y elimina un paso obligatorio. Sin embargo, conexión directa puede dificultar posibles sitios de unión de una manera específica o no específica, dependiendo de la estrategia de fijación. Una ventaja adicional al uso de granos de estreptavidina es que menos proteína estable objetivos pueden ser recién biotinilado en 30 min o almacenan congelado, si es necesario, mientras que los granos se suelen requerir una incubación más larga con la proteína para cross-linking y son generalmente se almacena a 2-8° C. La concentración inicial sugerida de proteína biotinilada apuntar aquí, 600 nM, ha sido acertado para múltiples objetivos, pero es posible aislar captura reactivos péptido mayor afinidad si esta concentración se reduce. Además, este método puede ser extendido a y modificado para otras bibliotecas de exhibición bacteriana y otros organismos. Por ejemplo, estos pasos pueden realizarse en ausencia de oxígeno para el uso con anaerobios, o en otros ambientes para su uso con extremófilos para aislar péptidos con propiedades únicas. Los péptidos o consenso determinado para un objetivo particular de interés puede ser potencialmente utilizado en la célula como una vida material o producida sintéticamente de la célula. Péptidos producidos sintéticamente pueden ser madurados aún más para el desarrollo de más afinidad y más robustos agentes de proteínas catalizada de captura (PCC) para su uso en sensores, o para otras aplicaciones donde anticuerpos normalmente se utilizaría para el enlace o reconocimiento 38,55. Modelado molecular puede utilizarse también para ayudar a determinar vinculantes, ubicación del péptido con su objetivo, ya que fue realizada recientemente para el abrax péptidos de Unión y consenso aparecen en la figura 5 1. General, biopanning exhibición bacteriana bibliotecas para reactivos de afinidad péptido es una alternativa rápida, sencilla y potente para la producción de anticuerpos para el reconocimiento y la detección de dianas de la proteína y esta semi-automatizado biopanning enfoque ha producido resultados fiables con aplicaciones de gran alcance.

Biopanning es una técnica probada para el descubrimiento del reactivo de afinidad, con bacterias bibliotecas una fuente conveniente de péptido afinidad reactivos 1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24. Semejantemente a fago exhibición 25,26 y 27,28de exhibición de levadura, los péptidos son expuestos en la superficie celular y están disponibles para enlazar a objetivos tanto bióticos como abióticos, con estas interacciones impulsado por el esqueleto peptídico y las propiedades únicas de las cadenas laterales del aminoácido del 29. En contraste con visualización de fagos, las bacterias ellos mismos son uno mismo-repliegue y contienen todo el material genético necesario para pantalla sin elución de fagos enlazados y la reinfección de las células. En contraste con la exhibición de la levadura, es más rápido debido a la rápida (aproximadamente 20 min 30) tiempo de Escherichia colide duplicación bacteriana pantalla. Los reactivos de afinidad péptido resultante pueden ser producidos fuera de célula para el uso en una variedad de plataformas 16,17,26 de detección y tienen potencial de uso como materiales de la vida cuando aparece en celular 2 , 31 , 32. en comparación con los anticuerpos monoclonales para el reconocimiento de objetivos específicos, los péptidos son mucho más pequeños y más flexibles, y pantalla bibliotecas de péptidos pueden ser fácilmente manipuladas a nivel de ADN para evitar determinados aminoácidos, como cisteína 33 . Péptidos son cada vez más explotados para la terapéutica 34,35,36 y otras aplicaciones donde los anticuerpos normalmente se utilizarían debido a su facilidad de descubrimiento, reproducible sintético (fuera de la célula ) producción y mantenimiento superior de rendimiento en ambientes extremos, proporcionando un reactivo funcional incluso después de la exposición a altas temperaturas o almacenamiento a largo plazo sin refrigeración 37,38. La capacidad de superar la cadena de frío para el almacenamiento de los reactivos es de particular interés para el Departamento de defensa, por ejemplo, que deben operar en ambientes extremos. Estabilidad térmica por lo tanto era una característica deseable para los reactivos de afinidad reconociendo las metas solicitadas dadas como ejemplos de este manuscrito.
Recientemente, ha adquirido biopanning exhibición bacteriana bibliotecas aún más directa y confiable con el uso de celular activada por el magnético semiautomático (MACS o MCS) métodos 9,14,39de la clasificación. Estos métodos se han demostrado para objetivos biológicos utilizando varios similares plataformas con diferentes ventajas, entre ellas un comercialmente disponibles de clasificación automatizada celular activada por el magnético clasificación instrumento (autoMACS o autoMCS) (ver tabla de materiales) 1,14,15 y dispositivos más especializados que incluyen la muestra en un cartucho desechable 7,9 o chip 39, una especificación de valor para el uso con organismos o toxinas que son nivel de bioseguridad 2 (BSL-2) o más7. Estos métodos semiautomatizados podrían extenderse para ordenar para péptidos capaces de unirse a materiales abióticos, si los materiales son magnéticos o tienen la capacidad de cubrir a una tira magnética y para uso con diversos organismos (como bacterias anaerobias) si la clasificación y se alteran las condiciones de crecimiento. Además de clasificación bacteriana pantalla bibliotecas, el instrumento de autoMCS comercial utilizado aquí ha sido también utilizado en parte para los primeros pasos del descubrimiento de fragmentos de anticuerpos de cadena simple humanos aparecen en la superficie de la levadura, seguida por el aislamiento más utilizar fluorescentes activa célula clasificación (FACS) 40. Las principales ventajas de semi-automatización se disminuyen clasificación de tiempo y esfuerzo y más robusta y reproducible eliminación de células independientes de las bolas magnéticas durante pasos de lavado, que conduce a menor de falsos positivos, rondas de clasificación requiere menos y menos complicada análisis de down-stream 9,14. En el caso del instrumento de autoMCS comercial, hay varios programas precargados que pueden ser óptimos para diversos usos, tales como negativa pre-sorting (agotamiento), priorizando la pureza, reduciendo al mínimo el volumen de la muestra final y aumentar o disminución de sensibilidad para el aislamiento de las células raras 41.
El objetivo de este trabajo es demostrar la metodología de biopanning una biblioteca de exhibición bacteriana utilizando el instrumento de autoMCS disponibles en el mercado y a exponer el proceso de pensamiento aplicado en el análisis y reducir al mínimo el número resultante de candidatos en orden a facilitar la extensión a otras aplicaciones. La biblioteca de visualización utilizada aquí (véase tabla de materiales) 12,13 contiene aproximadamente 109- 1011 15-mer único péptidos visualizar a través de una versión modificada de la proteína de la membrana externa bacteriana OmpX en un naturaleza sin restricciones en la superficie celular, que se espera que sea representante del péptido libre en solución si se produce sintéticamente. Este andamio de proteínas además contiene un péptido control positivo P2X en la terminal C para el control de la expresión vía Unión a YPet Mona. Sin embargo, una biblioteca comprada o novela con adecuada diversidad y otras características necesarias para la aplicación específica que se desea debe trabajar igualmente con este procedimiento biopanning, aunque pueden requeridos algunos cambios de menor importancia. Un esquema de este protocolo biopanning se ilustra en la figura 1. Además, el protocolo podría ser adaptado a otro automatizado plataformas clasificación magnéticas y otras estrategias de ordenación. Manual de clasificación magnética con un imán de sobremesa se ha demostrado con éxito, aunque con análisis posterior más complicado y desperdiciador de tiempo requerido debido a aumentado falsos positivos 14y, sin embargo, proporciona una opción alternativa a la autoMCS pasos si ninguna celda magnética automatizada clasificación de dispositivo está disponible.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-545</td>
			<td>Automated cell separator for use with magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth, Miller (LB)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-500</td>
			<td>Thickening/geling agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library</td>
			<td>Cytomx Therapeutics</td>
			<td>N/A; http://cytomx.com/contact/</td>
			<td>On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arabinose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3256-500G</td>
			<td>Sugar, for induction of protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0780-10L</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI21327</td>
			<td>Adds biotin molecule to primary amines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Biotin Quantitation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI28005</td>
			<td>Ensures biotin molecule is covalently bound to protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65601</td>
			<td>Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td>Protein, used as blocking agent for non-specific binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Sugar, for growth and impeding inducible protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ypet Mona</td>
			<td>UCSB and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488 NHS Ester</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46403</td>
			<td>For conjugating protein target to fluorophore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S866</td>
			<td>Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSFlow</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>342003</td>
			<td>Buffer for running FACS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-021-101</td>
			<td>For MACS Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Running Buffer &#8211; MACS Separation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Washing Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-092-987</td>
			<td>For autoMACS instrument maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E505-4L</td>
			<td>Decontamination of autoMACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6279-1L</td>
			<td>For bacterial freezer stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill 15 rack</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-952</td>
			<td>For MACS Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview</td>
			<td>For assessment of peptide binding to target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>659523</td>
			<td>For assessment of peptide binding to target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A13346</td>
			<td>Bench top cell separator for use with magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Sequencing</td>
			<td>Genewiz</td>
			<td>N/A; https://www.genewiz.com/</td>
			<td>DNA and Colony Sequencing Services</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400</td>
			<td>For use with sequence analysis macro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrax Protective Antigen (PA)</td>
			<td>List Biological Laboratories, Inc.</td>
			<td>171</td>
			<td>Target protein used as example for representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrax</td>
			<td>ECBC and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rivax</td>
			<td>ECBC and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated biopanning of bacterial display libraries for peptide affinity reagent discovery and analysis of resulting isolates

Biopanning exhibición bacteriana bibliotecas es una técnica probada para el descubrimiento de reactivos péptido afinidad para el reconocimiento de objetivos tanto bióticos como abióticos. Reactivos de afinidad péptido pueden ser utilizados para aplicaciones similares a los anticuerpos, incluyendo detección y terapéutica, pero son más robustos y capaces de realizar en entornos más extremos. Enriquecimiento específico de agentes de captura de péptido a una blanco de la proteína de interés es mayor usando métodos de clasificación semiautomáticos que mejoran enlace y pasos de lavado y por lo tanto disminuyen la aparición de falsos positivos aglutinantes. Un método semiautomático de ordenación está descrito en este documento para su uso con una comercial automatizada magnético activado la célula clasificación de dispositivo con una pantalla bacteriana sin restricciones clasificación biblioteca expresar péptidos al azar 15-mer. Con ligeras modificaciones, estos métodos son extensibles a otros automatizados dispositivos, otra clasificación de las bibliotecas y otros organismos. Un objetivo primordial de este trabajo es proporcionar una metodología completa y exponer el proceso de pensamiento aplicado en el análisis y reducir al mínimo el número resultante de candidatos. Estas técnicas incluyen el análisis de enlace en el celular usando celular activado por fluorescencia (FACS), de clasificación para evaluar la afinidad y especificidad durante la clasificación y comparación de candidatos en lo individual, y el análisis de péptidos de las secuencias para identificar tendencias y Secuencias consenso para comprender y mejorar potencialmente la afinidad y especificidad para el destino de interés.

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Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Bibliotecas de exhibición bacteriana Biopanning es una técnica probada para el descubrimiento de los reactivos de la afinidad del péptido, una alternativa robusta a los anticuerpos. El método de ordenación semi automatizado en este documento ha aerodinamizado biopanning para disminuir la ocurrencia de falsos positivos. Aquí ilustramos el proceso de pensamiento y técnicas aplicadas en evaluar a los candidatos y la minimización de análisis aguas abajo.

Biopanning semi-automatizado de bibliotecas de exhibición bacteriana péptido afinidad reactivo descubrimiento y análisis de los aislamientos que

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Research

JoVE Journal

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