Name: semi-automated biopanning of bacterial display libraries for peptide affinity reagent discovery and analysis of resulting isolates
Uploaded: 2017-12-06T12:30:00
Duration: 13 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates at JoVE.com

Författarna vill erkänna stöd av US Army Research Laboratory (ARL) postdoc Fellowship-programmet, administreras av Oak Ridge associerade universiteten genom ett kontrakt med ARL, genom utnämningen av Dr Justin P. Jahnke. Resterande finansiering tillhandahölls av sensorer och Electron enheter direktoratet på ARL. Författarna vill även tacka Daugherty labbet på UCSB för att dela den bakteriella display bibliotek och information för kloning YPet Mona reagens, Dr Bryn Adams för stöd i kloning YPet Mona reagens på ARL, Dr Joshua Kogot för hans inledande arbete på och utbildning i biopanning av bakteriell display bibliotek, Alena, lugna Edgewood kemiska och biologiska Center för att dela plasmider som används för att uttrycka och rena abrax och rivax proteiner, Brandi Dorsey för teknisk support för isolering av PA bindande peptider, Qin Guo för teknisk support av preliminära experiment för isolering av abrax bindande peptider och Dr Jessica Terrell för bra diskussioner kring detta manuskript.

Författarna har ingenting att avslöja

Biopanning bakteriell display bibliotek har varit en framgångsrik strategi för isolering av affinitet reagenser och peptider erbjuder ett användbart alternativ till antikroppar för erkännande när specifika kriterier krävs, såsom stabilitet i extrema miljöer. Biopanning av dessa bibliotek har effektiviserats med hjälp av autoMCS metoder som beskrivs här, och en kommersiellt tillgängliga autoMCS plattform sträcker sig denna teknik till en mycket bredare publik. I jämförelse med traditionella alternerande MCS/FACS sorteringsmetoder för bakteriella Visa bibliotek, autoMCS metoder är billigare eftersom de inte kräver investeringar i ett dyrare FACS instrument klarar av sortering och isolera de bundna cellerna, snarare än typ av flödescytometer som används här, som endast kan hantera analys 14. De kritiska steg för lyckad biopanning av autoMCS inkluderar separation programval, negativa sortering mot potentiella cross-reaktanterna att minska falsklarm, övervakning bibliotek berikning med FACS för att avgöra när du ska sluta biopanning, och Smart analys av kandidat poolen för att undvika besvärliga screening av hundratals kandidater.
De exempel som beskrivs häri visar framgångsrika biopanning av den valda bakteriell display biblioteken för två separata mål, PA och abrax, men med något annorlunda analys strategier på grund av skillnader i peptid sekvenser för varje pool av kandidater efter fyra rundor av biopanning. PA var enklare fallet med sekvensanalys visar tydliga trender från peptid sekvenser som upprepas minst en gång i 144 kolonier. Detta var ensam nog att bestämma en konsensus sekvens för PA mål, och dessa kolonier som innehöll samförståndet eller en liknande sekvens var de bästa kandidaterna när det gäller förhållandet mellan bindning till PA kontra bindning till den negativa kontrollen streptividin. Dock kan detta inte alltid fallet. För abrax mål, sekvensering 100 kolonier ledde till fem upprepande sekvenser men trenden i dessa sekvenser var mindre klart, än en tendens att innehålla aromatisk aminosyra rester och asparaginsyra eller asparagin. Förutspådd ”konsensus” från den upprepande sekvenser endast kunde har tillverkats och testats för affinitet till abrax, men eftersom ingen förälder sekvenser innehöll den exakta samförstånd sekvensen, Vi återvände till listan över sekvenserade kolonier och observerade att andra kandidater som hade mer trender gemensamt med varandra. I själva verket innehöll två kolonierna en liknande sekvens till ”konsensus” från de upprepar enbart (FWDTWF istället för FWAWF), som hade samma trend av tryptofan, fenylalanin och asparaginsyra rester men med olika avstånd. En av dessa peptider var en upprepande sekvens, en var inte. Dessa två sekvenser, tillsammans med en tredje sekvens som innehåller en liknande variant, var bland de topp 5 pärmar testade när det gäller affinitet för abrax. Den översta bindaren övergripande, AX-A05, visas också liknande trender. Resultaten för abrax visar att en strategi som växlar flera gånger mellan sekvensanalys och affinitet och specificitet ibland kommer att krävas, beroende på det valda målet. Resultaten för abrax mål visar också nivån på specificitet som kan uppnås över ett mycket liknande protein (rivax 1,15).
AutoMCS program som valts för våra studier var Posselds och Posseld, som båda för positiva urval av märkt målceller med låg frekvens, mindre än 5% av den ursprungliga befolkningen. I båda fallen passera cellerna genom två magnetiska kolumner. När det gäller Posselds programmet, dock passera celler långsammare den första kolumnen att öka exponeringen tid 41. Utöver de programbeskrivningar som ges av tillverkaren av kommersiella autoMCS enheten (se Material tabell) 41, dessa program valdes efter en första jämförelse av flera potentiella program. Respektive programs förmåga att undvika att dra ut falska positiva från en homogen kultur av negativ kontroll celler, och att framgångsrikt isolera en känd binder till ett mål av intresse från en blandad kultur som innehåller negativa kontrollen celler spetsade med en minskande procentandel av kända bindemedlet, jämfördes. Om avsevärt avviker från de program som beskrivs här, kunde en liknande jämförelse vara bra i programval för det nya programmet. Dock tidigare publicerade resultat jämföra dessa två program (Posseld och Posselds) för isolering av peptid affinitet reagenser för PA visade att använda någon av dessa program för alla fyra rundor av biopanning ledde till isolering av peptider med liknande affinitet och specificitet för PA och bestämning av WXCFTC konsensus. Den största skillnaden var att Posseld, med dess snabbare flöde, sorterade snabbare och bindande affinitet för målet var därför högre efter bara två rundor av biopanning, medan använder Posselds ledde till mer unika sekvenser efter fyra rundor av biopanning 14. lära av detta, strategin har ändrats något när biopanning för abrax bindande peptider att införliva både fördelar: Posselds användes för rond 1 för att ge mer exponeringstid under detta kritiska steg där mångfalden är som störst, men sedan den programmet var bytte till Posseld för snabbare isolering av de högsta affinitet bindemedel under omgångar 2-4 1,15. Detta tycktes vara idealisk för abrax, särskilt sedan den nMFI och procent bindande var både högre för abrax sortering rond 4 jämfört med PA sortering rond 4 med antingen program (figur 2 och figur 3 och Sarkes et al. 2015 ( 14), men en direkt jämförelse med en strategi jämfört med andra med samma mål skulle krävas för en mer övertygande jämförelse. Vilket program är bäst för ett visst program kan bero på den individuella mål, sortering biblioteket som används och nivån på peptid uttryck som uppnås med ändringar i de villkor som beskrivs här.
Inte diskuteras här är potentiella resultat från biopanning med abiotiska material, men vi har också använt samma bakterie display bibliotek för biopanning mot bulk aluminium 2. Denna studie utfördes inte använder autoMCS, men liknande studier kunde åstadkommas med autoMCS om materialet finns på, eller kunde vara belagd på eller konjugerat till, en magnetisk pärla. I den bulk aluminium studien var enskilda aminosyra analys och sekundärt strukturera modellering till hjälp för att förstå vad körde affinitet av de isolerade peptiderna, eftersom ingen konsensus sekvens var beslutsamma 2. Även med biologiska mål, kan det krävas att förstå vad som driver det affinitet för vissa mål, varför på kalkylbladet som genereras från ”eCPX_Sequencing” makro finns en flik med individuella frekvensanalys. Om ingen upprepande sekvenser ses förutom avsaknaden av samförstånd, och rester frekvens visar inget mönster, men kan andra typer av analys krävas. Dessutom kan det vara nödvändigt att undvika screening ett mycket större antal kandidater för down-urval av dem med tillräcklig affinitet till det önskade målet ytterligare sortering rundor.
Med den ökande tillgången till nästa generations sekvensering, kunde en mer grundlig undersökning utföras att bestämma de mest lovande kandidaterna innan testning affinitet och att fastställa omfattningen av anrikning efter varje omgång av biopanning. Dock kan sekvenser som går vidare till bindande analys steg behöva återskapas genom kloning, om de inte är av tillräckligt hög frekvens för att enkelt isolera med rutinmässiga kolonin sekvensering av tiotals eller hundratals kolonier. Som denna teknik framsteg, blir billigare och mer rutin, och särskilt med en option för kolonin isolering, kommer det sannolikt vara det bästa sättet att analysera biopanning data. Det kan leda till förtydligandet av vägen enskilda sekvenser och hela biblioteket, utvecklas. Dessutom kan kan bakterierna i sortering biblioteket mutera över tiden, vilket kunde bias sortering mot celler med snabbare tillväxt eller bakterier som överuttrycka genomisk proteiner kan binda ett material även utan display byggnadsställning och peptid uttryck, för instans. Därför, när lovande kandidater dyker upp, är det värt att isolera plasmiden DNA, retransforming färsk E. coli, och bekräftar peptid bindande via FACS. Om du planerar att använda peptiden i en cell-fria format, bedömas också affinitet för fri peptiden. Till exempel producerades peptid affinitet reagenser upptäckte genom bakteriell display för målet SEB syntetiskt off-cell och analyseras av mer traditionella metoder såsom enzymkopplad immunosorbant assay (ELISA), och på-cell (via FACS) och off-cell (via ELISA) affinitet jämfördes med hjälp av Kds bestäms av både metoder 7.
Även om styrkan av biotin-streptividin samverkan gör det en perfekt strategi för avskiljning av protein mål och bundna peptider, kan proceduren ändras för andra fånga strategier. Direkt koppling av protein till magnetiska pärlor, till exempel epoxi och karboxylsyra pärlor, har varit framgångsrik och tar bort ett bindande steg. Direkt fastsättning kan dock hindra potentiella bindningsställen på en specifik eller icke-specifik sätt, beroende på bifogad fil strategi. En ytterligare fördel med streptividin pärlor är att mindre stabil protein mål kan vara färska biotinylerade i 30 min eller lagras frysta, om det behövs, medan pärlorna själva tenderar att kräva längre inkubation med proteinet för cross-linking och är allmänhet lagras vid 2-8° C. Den föreslagna starta koncentrationen av biotinylerade protein rikta här, 600 nM, har varit framgångsrika för flera mål, men det kan vara möjligt att isolera peptid fånga reagenser med ökad affinitet om denna koncentration minskar. Dessutom kan denna metod utvidgas till och ändras för andra bakteriella display bibliotek och andra organismer. Dessa åtgärder kan exempelvis utföras i frånvaro av syre för användning med anaerober eller i andra miljöer för användning med extremophiles att isolera peptider med unika egenskaper. Peptider och/eller konsensus fastställs för ett visst mål sevärdheter kan potentiellt användas på-cell som en levande material eller syntetiskt producerade off-cellen. Syntetiskt producerade peptider kan vara ytterligare mognat för utveckling av ännu högre affinitet och mer robust Protein katalyseras fånga (PCC) ombud för användning i sensorer eller för andra applikationer där antikroppar vanligtvis skulle användas för bindning eller erkännande 38,55. Molekylär modellering kan också användas för att fastställa bindande läge av peptiden med sitt mål, som utfördes nyligen för abrax bindande peptider och samförstånd som anges i figur 5 c 1. Sammantaget biopanning bakteriell display bibliotek för peptid affinitet reagenser är ett snabbt, enkelt och kraftfullt alternativ till produktionen av antikroppar för erkännande och detektion av protein mål, och detta halvautomatisk biopanning strategi har producerat pålitliga resultat med långtgående program.

Biopanning är en beprövad teknik för affinitet reagens upptäckt, med bakteriell visar biblioteken en bekväm källa för peptid affinitet reagens 1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24. Likaså att phage Visa 25,26 och jäst Visa 27,28, Peptiderna är utsatta på cellens yta och finns att binda till både biotiska och abiotiska mål, med dessa interaktioner driven av både peptid ryggraden och de unika egenskaperna hos den aminosyra sidokedjor 29. I motsats till phage display, bakterierna själva är självreproducerande och innehålla alla genetiska material krävs för visning utan eluering av bundna phage och återinfektion av celler. I motsats till jäst display är bakteriell display snabbare på grund av den snabba (cirka 20 min 30) fördubbling tid av Escherichia coli. De resulterande peptid affinitet Reagenserna kan produceras av celler för användning i en mängd avkänning plattformar 16,17,26 och har potential för användning som levande material när visas på-cell 2 , 31 , 32. jämfört med monoklonala antikroppar för erkännande av specifika mål, peptider är mycket mindre och mer flexibla, och peptid display bibliotek kan lätt manipuleras på DNA-nivå att undvika specifika aminosyror, såsom cystein 33 . Peptider utnyttjas alltmer för therapeutics 34,35,36 och andra tillämpningar där antikroppar vanligtvis skulle utnyttjas på grund av sin användarvänlighet upptäckten, reproducerbara syntetiska (off-cell ) produktionen och överlägsna underhåll av prestanda i extrema miljöer, som ger en funktionell reagens även efter exponering för hög temperatur eller långtidsförvaring utan kyl 37,38. Förmågan att övervinna kylkedjan för lagring av reagenser är av särskilt intresse för försvarsdepartementet, exempelvis som måste fungera i extrema miljöer. Termisk stabilitet var därför ett önskvärt inslag för affinitet reagenserna erkänner de valda målen ges som exempel i detta manuskript.
Nyligen, biopanning bakteriell display bibliotek har blivit ännu mer helt okomplicerade och driftssäkra med användning av halvautomatisk magnetiska-aktiverad cell sortering (Mac eller MCS) metoder 9,14,39. Dessa metoder har påvisats för biologiska mål med hjälp av flera liknande sortering plattformar med olika fördelar, inklusive en kommersiellt tillgängliga automatiserade magnetiska-aktiverad cell sortering (autoMACS eller autoMCS) instrument (se tabell över material) 1,14,15 och mer specialiserade enheter som inneslutar provet i en disponibel patronen 7,9 eller chip 39, en värdefull specifikation för användning med organismer eller toxiner som biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) eller högre7. Dessa semi automatiserade metoder skulle kunna utvidgas för att sortera för peptider kan binda till abiotiska material om material som är magnetiska eller har förmågan att vara belagd på en magnetisk pärla, och för användning med olika organismer (såsom anaeroba bakterier) om sortering och tillväxt villkorar är förändrad. Utöver sortering bakteriell display bibliotek, har kommersiella autoMCS instrumentet används här också använts delvis för de första stegen av upptäckten av mänskliga singel-kedjan antikroppsfragment visas på ytan av jäst, följt av ytterligare isolering använda fluorescerande aktiverad Cell sortering (FACS) 40. De främsta fördelarna till semi automation är minskade sortering tid och ansträngning och mer robust och reproducerbara eliminering av obundna celler från de magnetiska pärlorna under tvätta trappan, som leder till minskad falska positiva, färre krävs sortering rundor, och mindre komplicerade nedströms analys 9,14. När det gäller kommersiella autoMCS instrumentet, finns flera förinstallerade program som kan vara optimal för olika applikationer, såsom negativa försortering (utarmning), prioritera renhet, minimera slutliga provvolymen och öka eller minskar känsligheten för isolering av sällsynta celler 41.
Fokus för detta arbete är att demonstrera metoden för biopanning en bakteriell display bibliotek med hjälp av kommersiellt tillgängliga autoMCS instrumentet, och att förklara den tankeprocess som tillämpas i analysera och minimera den resulterande poolen av kandidater i för att underlätta förlängning till andra program. Visa biblioteket används här (se tabell material) 12,13 innehåller cirka 109- 1011 unika 15-mer peptider visas via en modifierad version av den bakteriella yttre membranprotein OmpX i en unconstrained naturen på cellytan, vilket förväntas vara representativa för den fria peptiden i lösning om framställts syntetiskt. Detta protein byggnadsställning innehåller dessutom en positiv kontroll P2X peptid på C-terminus för övervakning uttryck via bindning till YPet Mona. Dock bör ett köpta eller romanen bibliotek med lämplig mångfald och andra egenskaper som är nödvändiga för ansökan önskas fungerar på samma sätt med detta biopanning förfarande, även om vissa mindre ändringar kan krävas. En schematisk bild av detta biopanning protokoll illustreras i figur 1. Dessutom protokollet kunde anpassas till andra automatiserade magnetiska sortering plattformar och andra strategier för sortering. Manuell magnetiska sortering med bänkmonterade magnet har visats framgångsrikt, om än med mer komplicerade och tidskrävande nedströms analys som krävs beror på ökade falska positiva 14, och ändå ger ett alternativ till den autoMCS steg om inga automatiska magnetiska cell sortering enhet är tillgänglig.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-545</td>
			<td>Automated cell separator for use with magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth, Miller (LB)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-500</td>
			<td>Thickening/geling agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library</td>
			<td>Cytomx Therapeutics</td>
			<td>N/A; http://cytomx.com/contact/</td>
			<td>On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arabinose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3256-500G</td>
			<td>Sugar, for induction of protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0780-10L</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI21327</td>
			<td>Adds biotin molecule to primary amines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Biotin Quantitation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI28005</td>
			<td>Ensures biotin molecule is covalently bound to protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65601</td>
			<td>Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td>Protein, used as blocking agent for non-specific binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Sugar, for growth and impeding inducible protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ypet Mona</td>
			<td>UCSB and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488 NHS Ester</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46403</td>
			<td>For conjugating protein target to fluorophore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S866</td>
			<td>Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSFlow</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>342003</td>
			<td>Buffer for running FACS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-021-101</td>
			<td>For MACS Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Running Buffer &#8211; MACS Separation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Washing Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-092-987</td>
			<td>For autoMACS instrument maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E505-4L</td>
			<td>Decontamination of autoMACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6279-1L</td>
			<td>For bacterial freezer stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill 15 rack</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-952</td>
			<td>For MACS Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview</td>
			<td>For assessment of peptide binding to target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>659523</td>
			<td>For assessment of peptide binding to target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A13346</td>
			<td>Bench top cell separator for use with magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Sequencing</td>
			<td>Genewiz</td>
			<td>N/A; https://www.genewiz.com/</td>
			<td>DNA and Colony Sequencing Services</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400</td>
			<td>For use with sequence analysis macro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrax Protective Antigen (PA)</td>
			<td>List Biological Laboratories, Inc.</td>
			<td>171</td>
			<td>Target protein used as example for representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrax</td>
			<td>ECBC and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rivax</td>
			<td>ECBC and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated biopanning of bacterial display libraries for peptide affinity reagent discovery and analysis of resulting isolates

Biopanning bakteriell display bibliotek är en beprövad teknik för peptid affinitet reagens upptäckt för erkännande av både biotiska och abiotiska mål. Peptid affinitet reagenser kan användas för liknande applikationer till antikroppar, inklusive avkänning och therapeutics, men är mer robust och kunna utföra i mer extrema miljöer. Viss anrikning av peptid fånga ombud till ett protein mål sevärdheter förstärks med halvautomatisk sorteringsmetoder som förbättra bindande och tvätta steg och därför minska förekomsten av falska positiva bindemedel. En halvautomatisk sorteringsmetod beskrivs häri för användning med en kommersiell automatiserade magnetiska-aktiverad cell sortering enhet med en oinskränkt bakteriell display sortering bibliotek uttrycker slumpmässiga 15-mer peptider. Med smärre ändringar, dessa metoder är utdragbar till andra automatiserade enheter, andra sortering bibliotek och andra organismer. Ett primärt mål i detta arbete är att ge en heltäckande metod och förklara den tankeprocess som tillämpas i analysera och minimera den resulterande poolen av kandidater. Dessa tekniker inkluderar analys av den-cell bindande med fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS), för att bedöma affinitet och specificitet under sortering och jämföra enskilda kandidater, och analysen av peptid sekvenser för att identifiera trender och konsensus-sekvenser för att förstå och potentiellt förbättra affinitet och specificitet för målet för intresse.

Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates at JoVE.com

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning bakteriell display bibliotek är en beprövad teknik för upptäckt av peptid affinitet reagenser, en robust alternativ till antikroppar. Halvautomatisk sorteringsmetod häri har effektiviserat biopanning för att minska förekomsten av falska positiva. Här visar vi tankeprocess och metoder som tillämpas i utvärdera kandidater och minimera nedströms analys.

Halvautomatisk Biopanning bakteriell Display bibliotek för peptid affinitet reagens identifiering och analys av resulterande isolat

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metod för att identifiera små molekylhämmare av protein-proteininteraktion Mellan HCN1 och TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Bakteriell Inner-membran Display för screening av ett bibliotek av antikroppsfragment

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Fastställande av hög affinitet antikropp-antigenbindning Kinetics med fyra Biosensor Platforms

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Enkelt att använda arkitekturer i Protein-baserade hydrogeler för Cell kultur applikationer

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Analys av histonantikroppspecificitet med peptidmikroarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 i 1: enstegs affinitet rening för parallell analys av Protein-Protein och Protein-metaboliten komplex

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Extracellulära Protein Mikroarrayteknik för hög genomströmning upptäckt av låg affinitet Receptor-Ligand interaktioner

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-Time, semi-automatiserad fluorescerande mätning av luftvägarna yta flytande pH i primära humana luftvägs epitelceller

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Inbyggt cellmembrannanopartiklar system för membranprotein-protein interaktionsanalys

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases

Använda Phage Display för att utveckla Ubiquitin Variant Modulators för E3 Ligases

Ubiquitin is a small 8.6 kDa protein that is a core component of the ubiquitin-proteasome system. Consequently, it can bind to a diverse array of proteins ...