Name: semi-automated biopanning of bacterial display libraries for peptide affinity reagent discovery and analysis of resulting isolates
Uploaded: 2017-12-06T12:30:00
Duration: 13 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates at JoVE.com

Yazarlar ABD Ordu Araştırma Laboratuvarı (ARL) doktora sonrası burs programı, Dr. Justin P. Jahnke randevu ARL ile kontrat ile Oak Ridge Associated üniversiteler tarafından yönetilen destek kabul etmek istiyorum. Finansman kalan sensörler ve elektron cihazları Müdürlüğü ARL, tarafından sağlanan. Yazarlar ayrıca Daugherty'yi laboratuvar UCSB bakteriyel görüntü kitaplığı ve YPet Mona reaktif, Dr Bryn Adams YPet Mona reaktif ARL, Dr. Joshua Kogot ilk çalışmaları için klonlama destek için klonlama için bilgi paylaşımı için teşekkür etmek istiyorum ve biopanning bakteriyel eğitimde görüntü kitaplıkları, Alena sakin Edgewood kimyasal ve biyolojik plazmid hızlı ve abrax arındırmak için kullanılan paylaşım için merkezi ve rivax proteinler, Brandi Dorsey PA bağlama peptidler, Qin Guo yalıtım için teknik destek için abrax bağlama peptidler yalıtım için ön deneyler ve Dr Jessica Terrell bu el yazması ile ilgili yararlı tartışmalar için teknik destek için.

Yazarlar ifşa yoktur

Biopanning bakteriyel görüntü kitaplıkları benzeşme Kimyasalları yalıtım için başarılı bir yaklaşım olmuştur ve belirli ölçütlere en uçtaki çevre istikrardır gibi gerekli olduğunda peptidler antikorlar tanıma için yararlı bir alternatif sunmaktadır. Bu kütüphanelerin Biopanning kullanarak autoMCS yöntem tanımlamak burada aerodinamik ve piyasada bulunan autoMCS platformu bu teknoloji için daha geniş bir kitleye uzanır. Geleneksel alternatif MCS/FACS ile karşılaştırıldığında bakteriyel için sıralama yöntemi kitaplıkları görüntülemek, yatırım daha pahalı bir FACS alet sıralama ve ilişkili hücreleri izole verebilir gerektirmediğinden autoMCS yöntemleri daha ucuz olduğu, Burada kullanılan Akış Sitometresi türü yerine, hangi sadece analiz 14yeteneğine sahiptir. AutoMCS kritik adımlarla başarılı biopanning için ayırma programı seçimi, potansiyel çapraz-yanlış pozitif, biopanning, durdurmak ne zaman belirlemek için FACS kullanarak kütüphane zenginleştirme izleme azaltmak için Reaktanları karşı sıralama negatif içerir ve Yüzlerce aday hantal tarama önlemek için aday havuzu akıllı analizi.
Her havuz için peptid serileri farklılıkları nedeniyle biraz farklı analiz stratejileri her ne kadar başarılı biopanning PA ve abrax, iki ayrı hedefler için seçilen bakteriyel ekran Kütüphanesi burada açıklanan örnekler göstermektedir adaylar biopanning dört tur sonra. PA daha doğru sözlü, 144 koloniler halinde en az bir kez tekrarlanan peptid dizilerinden açık eğilimleri gösteren dizi analizi ile böyleydi. Bu fikir birliği bulunan PA hedef için bir fikir birliği sırasını belirlemek yeterli ve bu koloniler yalnızdı veya benzer bir sıra streptavidin negatif kontrol bağlamaya karşı PA bağlama oranı açısından en iyi adaylar vardı. Ancak, bu her zaman durumda olmayacaktır. Abrax hedef için sıralama 100 kolonileri beş yinelenen serileri açtı ancak aromatik amino asitlerin ve aspartik asit veya asparagine içeren eğilimi dışında bu dizilere eğilim daha az açıktı. Yinelenen dizilerinden öngörülen "uzlaşma" sadece edilmiş üretilen ve benzeşme abrax için test ama o tam bir fikir birliği dizi hiçbir üst sıralaması bulunan sıralı kolonileri listesine geri döndü ve gözlenen diğer adaylar ile ortak birbirimizi daha fazla eğilimleri vardı. Aslında, iki kolonileri benzer bir sıra "uzlaşma" triptofan, fenilalanin ve aspartik asit kalıntılarının ama farklı aralığı ile aynı eğilim vardı tekrarlar yalnız, yerine FWAWF (FWDTWF), gelen yer. Bu peptidler bir yinelenen sırası, öyle değildir. Benzer bir değişken içeren bir üçüncü sıra ile birlikte bu iki DNA dizileri abrax benzeşim açısından test ilk 5 bağlayıcı arasında yer aldı. En iyi cilt genel, AX-A05, de benzer eğilimler görünür. Sonuçlar abrax için alternatifler bir yaklaşım birkaç kez dizi analizi ve benzeşme ve özgüllük çözümleme arasında bazen seçtiğiniz hedefe bağlı olarak gerekli olacaktır göstermektedir. Abrax hedef için sonuçları da çok benzer bir protein (rivax 1,15) elde edilebilir özgüllük düzeyi göstermektedir.
Çalışmalarımız için seçili autoMCS programlar Posselds ve Posseld, düşük frekans, ilk nüfusunun % 5 daha az içeren etiketli hedef hücrelerin pozitif seçim için her ikisi de vardı. Her iki durumda da, hücreleri iki manyetik sütunlar boyunca geçmek. Posselds programını durumunda ancak, hücreleri daha yavaş pozlama süresi 41artırmak için ilk sütun geçen. Ek olarak ticari autoMCS aygıt üreticisi tarafından verilen program açıklamaları (bkz: Malzemeler tablo) 41, bu programların birkaç potansiyel programlar ilk bir karşılaştırma sonra seçildi. Her bir programın yeteneği yanlış pozitif negatif kontrol hücreleri homojen bir kültür çekerek önlemek ve başarılı bir şekilde bilinen cilt ortadan kaldırmak faiz bir hedef için bir azaltılarak çivili negatif kontrol hücreleri içeren karışık bir kültür için bilinen cilt yüzdesi karşılaştırıldığında. Burada açıklanan uygulamalardan önemli ölçüde sapma, benzer bir karşılaştırma programı seçimi yeni uygulama için yararlı olabilir. Ancak, daha önce peptid benzeşme Kimyasalları yalıtım biopanning tüm dört tur için bu programlardan birini kullanarak peptidler benzer ile yalıtım için yol gösterdi PA için için bu iki program (Posseld ve Posselds) karşılaştırma sonuçları Yayınlandı benzeşme ve PA için özgüllük ve WXCFTC uzlaşma tespiti. Bu Posseld göre daha hızlı, daha hızlı akış hızı ile ana farklılıklar vardı ve Posselds kullanarak daha fazla benzersiz sıraların yol biopanning dört tur sonra ise hedef için ilgi bağlama bu nedenle biopanning, sadece iki tur sonra daha yüksek 14. bu öğrenme, strateji biraz değiştirildi ne zaman biopanning abrax bağlama peptidler iki yararları dahil etmek için: Posselds çeşitlilik nerede en yüksek, ama sonra daha fazla pozlama süresi bu kritik adımı sırasında izin vermek için yuvarlak 1 kullanılır programı Posseld için için en yüksek afinite bağlayıcı daha hızlı yalıtım Tur 2-4 1,15sırasında geçildi. Bu özellikle nMFI ve yüzde bağlama ile karşılaştırıldığında her iki programda ile yuvarlak 4 sıralama PA round 4 sıralama abrax için daha yüksek hem de yaşından beri abrax için ideal olduğu ortaya çıktı (Şekil 2 ve şekil 3 ve Sarkes ve ark. 2015 14), ama diğer karşı bir strateji ile aynı hedef kullanarak doğrudan bir karşılaştırma daha kesin bir karşılaştırma için gerekli olacaktır. Hangi programın belirli bir uygulama için en iyi bireysel hedef, kullandığı sıralama kitaplığı ve burada açıklanan şartları herhangi bir değişiklik ile elde peptid ifade düzeyine bağlı olabilir.
Tartışılan işte abiyotik malzeme ile biopanning üzerinden potansiyel sonuçları, ama biz de biopanning karşı toplu alüminyum 2için aynı bakteriyel görüntü kitaplığı kullandık. Bu çalışmada autoMCS kullanarak gerçekleştirilmedi ama benzer çalışmalar, malzeme, kullanılabilir veya üzerinde kaplı veya olabilir bir manyetik boncuk için Birleşik autoMCS kullanarak başarılı olabilir. Toplu alüminyum çalışmada, bireysel amino asit analizi ve ikincil yapı modelleme hiçbir fikir birliği sıra kararlı 2yaşından beri ne izole peptidler, bağlama benzeşme kullanıyordu anlamada yardımcı oldu. Bile biyolojik hedefler ile bu yüzden "eCPX_Sequencing" makrodan oluşturulan elektronik tablo tek tek kalıntı frekans analizi ile bir sekme içerir bağlama benzeşme bazı hedefler için neyin yönlendirdiğini anlamak için gerekli olabilir. Ancak, hiçbir yinelenen sıralaması bir fikir birliği olmaması ek olarak görülür ve kalıntı frekans yok desen programı varsa, analiz diğer türleri gerekli olabilir. Ayrıca, daha fazla tur sıralama istenen hedef için yeterli ilgi olanlar aşağı-seçim için aday çok sayıda eleme önlemek gerekli olabilir.
Sonraki nesil sıralama artan durumu ile yakınlık test etmeden önce en umut verici adaylar belirlemek ve zenginleştirme biopanning her turdan sonra kapsamını belirlemek için daha kapsamlı bir çalışma gerçekleştirilebilir. Ancak, onlar kolayca onlarca veya yüzlerce kolonileri rutin koloni sıralama ile izole etmek için yeterince yüksek sıklığı değilseniz bağlama analiz adıma geçmeden dizileri klonlama tarafından yeniden oluşturulması gerekebilir. Bu teknoloji gelişmeler, daha ucuz ve daha rutin haline ve koloni yalıtım için bir seçenek özellikle ile o büyük olasılıkla-ecek biopanning verileri çözümlemek için en iyi yolu duyacaksınız. Bu şekilde bireysel dizileri ve tüm kitaplığı aydınlatma için kurşun, gelişmeye. Ayrıca, sıralama Kitaplığı'ndaki bakteri hücreleri daha hızlı büyüme oranları veya genomik proteinler için bir malzeme bile görüntü ifade, iskele ve peptid olmadan bağlamak mümkün overexpress bakteri ile doğru sıralama önyargı zamanla mutasyona örnek. Gelecek vaat eden adaylar ortaya bir kez, bu nedenle, plazmid DNA izole, taze E. coli, retransforming ve peptid bağlama FACS üzerinden teyit değer. Eğer peptid boş hücre bir biçimde kullanmak planlama, benzeşme da için ücretsiz peptid değerlendirilmesi. Örneğin, hedef SEB için bakteriyel ekran aracılığıyla keşfetti peptid benzeşme reaktifler sentetik hücre içi ve enzim bağlı immunosorbant assay (ELISA) ve hücre (via FACS) Tarih ve hücre içi gibi daha geleneksel yöntemlerle analiz üretildi (via ELISA) ilgi karşılaştırıldığında her iki yöntem 7tarafından belirlenen Kds kullanarak.
Biotin streptavidin etkileşimi gücünü protein hedef ve ilişkili peptidler yakalanması için ideal bir strateji geçici olsa da, bu yordam diğer yakalama stratejileri için değiştirilebilir. Protein için manyetik boncuklar, epoksi ve karboksilik asit boncuklar, gibi doğrudan bağlantı başarılı olmuştur ve bir bağlama adım kaldırır. Ancak, doğrudan eki eki strateji bağlı olarak, belirli veya belirsiz bir şekilde potansiyel bağlayıcı siteleri engelleyebilir. Daha az istikrarlı protein hedefleri taze biotinylated 30 dk içinde olabilir veya depolanan streptavidin boncuk kullanarak ek bir avantaj olduğunu, süre boncuk kendilerini cross-linking için protein ile uzun kuluçka gerektiren eğilimindedir ve gerekirse, dondurulmuş genellikle 2-8 ° C'de depolanan Önerilen başlangıç konsantrasyonu biotinylated protein hedef burada, 600 nM, çoklu hedefleri için başarılı olmuştur, ama bu konsantrasyonu azalır Eğer peptid yakalama reaktifler artan ilgi ile izole etmek mümkün olabilir. Ayrıca, bu yöntem için genişletilmiş ve diğer bakteriyel görüntü kitaplıkları ve diğer organizmalar için değiştirilebilir. Örneğin, aşağıdaki adımları anaerop kullanılmak üzere oksijen yokluğu veya diğer ortamlarda Ekstremofiller peptidler benzersiz özellikleri ile yalıtmak için kullanılmak üzere gerçekleştirilebilir. Gibi geçinmek malzeme veya sentetik üretilen kapalı hücreli peptidler ve/veya fikir birliği için potansiyel olarak ilgi belirli bir hedef olabilir belirlenen hücre içi kullanılır. Sentetik üretilen peptidler daha da daha yüksek benzeşme ve daha sağlam Protein katalize yakalama (PCC) ajanlar algılayıcılar kullanımda veya nerede antikorlar genellikle kullanılacak bağlama için diğer uygulamalar için geliştirilmesi için olgunlaşmış veya tanıma 38,55. Moleküler modelleme ile hedefine, peptid konumunu son zamanlarda abrax bağlama peptidler ve fikir birliği için gerçekleştirilen gibi bağlama şekil 5C 1' de listelenen belirlemenize yardımcı olması için kullanabilirsiniz. Genel olarak, biopanning bakteriyel görüntü kitaplığı peptid benzeşme reaktifler için yanlış tanıma antikor üretimini ve protein hedef tespiti ve bu yarı otomatik biopanning hızlı, basit ve güçlü bir alternatif yaklaşım kadar ulaşan uygulamaları ile güvenilir sonuçlar üretmiştir.

Biopanning benzeşme reaktif keşif için kanıtlanmış bir tekniktir, bakteriyel ile kütüphaneler peptid benzeşme reaktifler 1,2,3,4,5için uygun bir kaynak görüntü, 6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24. Benzer şekilde fajının için 25,26 görüntülemek ve Maya görüntülemek 27,28, peptidler hücre yüzeyinde sunulur ve biyotik ve abiyotik hedefleri, bu etkileşimler ile bağlamak kullanılabilir peptid omurga ve benzersiz özellikler amino asit yan-Ketten 29tarafından tahrik. Feyc ekran, aksine bakteri kendilerini kendi kendini kopyalayan ve ilişkili fajının elüsyon ve hücre bulaşmalara olmadan görüntülemek için gerekli tüm genetik materyal içeren. Maya display aksine, bakteriyel görüntü hızlı (yaklaşık 20 dk 30) iki katına zaman Escherichiacoli nedeniyle daha hızlı olur. Elde edilen peptid benzeşme reaktifler üretilen hücre platformları 16,17,26 algılama çeşitli kullanım için kapalı ve görüntülendiğinde yaşam malzemeleri üzerinde- 2 hücre olarak kullanmak için potansiyel var , 31 , 32. belirli hedefleri tanınması için monoklonal antikorlar ile karşılaştırıldığında çok daha küçük ve daha esnek peptidler ve peptid görüntü kitaplıkları kolayca sistein 33 gibi belirli amino asitleri önlemek için DNA düzeyinde manipüle . Peptidler giderek tedavi 34,35,36 ve nerede antikorlar genellikle bulma, tekrarlanabilir sentetik (kapalı hücreli kolaylığı nedeniyle kullanılan diğer uygulamalar için istismar değildir ) üretim ve yüksek sıcaklık ya da uzun süreli depolama soğutma 37,38olmadan maruz kaldıktan sonra bile işlevsel bir reaktif sağlayarak aşırı ortamlarda performansı üstün bakım. Soğuk zincir reaktifler depolamak için üstesinden gelmek için Savunma Bakanlığı'nın, örneğin, hangi içinde en uçtaki çevre işletmek gerekir özel ilgi yeteneğidir. Termal kararlılık nedenle seçilen hedefleri bu el yazması örnek olarak verilen tanıma benzeşme reaktifler için arzu edilen bir özellik oldu.
Son zamanlarda, biopanning bakteriyel görüntü kitaplıkları haline gelmiştir bile daha basit ve güvenilir yöntemler 9,14,39(Mac veya MCS) sıralama yarı otomatik manyetik aktif hücre kullanımı ile. Platformları dahil ticari olarak mevcut farklı avantajları ile sıralama otomatik manyetik aktif hücre (autoMACS veya autoMCS) enstrüman sıralama bu yöntemler için biyolojik hedefler birkaç benzer kullanarak gösterilmiştir (tablo bkz: malzemeler) 1,14,15 ve örnek bir tek kullanımlık kartuş 7,9 veya çip 39, değerli bir belirtimi için içine almanız daha özel cihazlar kullanın organizmalar veya seviye 2 (BSL-2) veya daha yüksek7toksinler. Bu yarı otomatik yöntemler peptidler materyalleri manyetik veya manyetik bir boncuk üzerine ve (gibi anaerobik bakteriler) farklı organizmalar ile kullanmak için izin verirseniz kaplı olması yeteneği varsa abiyotik malzeme bağlamak mümkün sıralamak için uzun olabilir sıralama ve büyüme koşullar değişmiş. Bakteriyel görüntü kitaplıkları sıralamanın yanı sıra, burada kullanılan ticari autoMCS enstrüman da kısmen insan tek-zinciri antikor parçaları tarafından daha fazla yalıtım takip Maya, yüzeyi görüntülenen keşfi ilk adımlar için kullanılmıştır Floresan aktif hücre sıralama (FACS) 40kullanarak. Zaman ve çaba ve daha sağlam ve tekrarlanabilir ortadan kaldırılması manyetik boncuklar ilişkisiz hücrelerden yıkama adımları, azaltılmış yanlış pozitif durumlar için önde gelen, daha az gerekli sıralama turu sırasında ve daha az sıralama yarı otomasyon için birincil avantajı azaldı karmaşık aşağı akış çözümlemesi 9,14. Ticari autoMCS enstrüman söz konusu olduğunda orada saflık öncelik, son numune hacmi en aza indirilmesi ve artan negatif (tükenmesi), önceden sıralama gibi farklı uygulamalar için en uygun olabilir birden çok önceden yüklenmiş programları veya duyarlı bir yalıtım nadir hücreleri 41azalan.
Bu eser metodoloji biopanning için piyasada bulunan autoMCS enstrüman kullanarak bir bakteriyel görüntü kitaplığı göstermek ve analiz etme ve elde edilen havuzun içinde adayların en aza indirerek uygulanan düşünce süreci açıklamak için odaklanmıştır sipariş uzantısı diğer uygulamalara kolaylaştırmak için. Burada kullanılan görüntü kitaplığı (malzemelerin tabloya bakın) 12,13 içeren yaklaşık 109- 1011 benzersiz 15-mer peptidler bakteriyel dış membran protein OmpX değiştirilmiş bir versiyonu ile görüntülenen içinde bir Kısıtlamasız doğa sentetik üretilen çözüm ücretsiz peptid temsilcisi olması bekleniyor hücre yüzeyi. Bu protein iskele Ayrıca pozitif kontrol P2X peptid ifade üzerinden bağlayıcı YPet Mona için izleme için C-terminus adlı içerir. Ancak, bazı küçük değişiklikler gerekli olabilir ama uygun çeşitlilik ve istenen belirli uygulama için gerekli diğer özellikleri satın alınan veya yeni bir kitaplıkla aynı şekilde bu biopanning yordamı ile çalışmalıdır. Bu biopanning Protokolü'nün bir şematik Resim 1' de gösterilmiştir. Ayrıca, protokol adapte olabilir diğer manyetik sıralama platformları ve sıralama diğer stratejileri otomatik. El ile manyetik bir benchtop mıknatıs ile sıralama başarıyla, daha karmaşık ve zaman alıcı aşağı akım analizi nedeniyle gerekli yanlış pozitif 14artmış da olsa kanıtlanmıştır ve yine de bir alternatif seçenek sağlar autoMCS adımları otomatik manyetik hücre aygıt sıralama yok Eğer mevcuttur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-545</td>
			<td>Automated cell separator for use with magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Broth, Miller (LB)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP904-100</td>
			<td>Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2641-500</td>
			<td>Thickening/geling agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library</td>
			<td>Cytomx Therapeutics</td>
			<td>N/A; http://cytomx.com/contact/</td>
			<td>On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arabinose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3256-500G</td>
			<td>Sugar, for induction of protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0780-10L</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI21327</td>
			<td>Adds biotin molecule to primary amines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Biotin Quantitation Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI28005</td>
			<td>Ensures biotin molecule is covalently bound to protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65601</td>
			<td>Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td>Protein, used as blocking agent for non-specific binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td>Sugar, for growth and impeding inducible protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ypet Mona</td>
			<td>UCSB and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488 NHS Ester</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>46403</td>
			<td>For conjugating protein target to fluorophore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S866</td>
			<td>Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSFlow</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>342003</td>
			<td>Buffer for running FACS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-021-101</td>
			<td>For MACS Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Running Buffer &#8211; MACS Separation Buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Washing Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-092-987</td>
			<td>For autoMACS instrument maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E505-4L</td>
			<td>Decontamination of autoMACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6279-1L</td>
			<td>For bacterial freezer stocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chill 15 rack</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-952</td>
			<td>For MACS Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview</td>
			<td>For assessment of peptide binding to target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software</td>
			<td>Becton, Dickinson, and Company</td>
			<td>659523</td>
			<td>For assessment of peptide binding to target</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A13346</td>
			<td>Bench top cell separator for use with magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony Sequencing</td>
			<td>Genewiz</td>
			<td>N/A; https://www.genewiz.com/</td>
			<td>DNA and Colony Sequencing Services</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400</td>
			<td>For use with sequence analysis macro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anthrax Protective Antigen (PA)</td>
			<td>List Biological Laboratories, Inc.</td>
			<td>171</td>
			<td>Target protein used as example for representative results.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrax</td>
			<td>ECBC and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rivax</td>
			<td>ECBC and ARL</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated biopanning of bacterial display libraries for peptide affinity reagent discovery and analysis of resulting isolates

Biopanning bakteriyel görüntü kitaplıkları peptid benzeşme reaktif bulma biyotik ve abiyotik hedefleri tanınması için kanıtlanmış bir tekniktir. Peptid benzeşme reaktifler antikorlar, algılama ve tedavi, dahil olmak üzere için benzer uygulamalar için kullanılabilir ancak daha sağlam ve daha fazla aşırı ortamlarda gerçekleştirmek edebiliyoruz. Protein hedefine ilgi peptid yakalama ajanların belirli zenginleştirme bağlama geliştirmek ve adımları yıkayın ve bu nedenle yanlış pozitif bağlayıcı oluşumunu azaltmak yarı otomatik sıralama yöntemi kullanılarak geliştirilmiştir. Yarı otomatik bir sıralama yöntemi, burada kullanım için aygıt kısıtlamasız bir bakteriyel ekran rasgele 15-mer peptidler ifade Kütüphane sıralama sıralama bir ticari otomatik manyetik aktif hücre ile tanımlanır. Hafif değişiklikler ile bu yöntemler için diğer Genişletilebilir otomatik cihazlar, sıralama diğer kütüphaneler ve diğer organizmalar. Bu eser birincil amacı kapsamlı bir metodoloji sağlamak ve analiz etme ve elde edilen aday havuzu minimize uygulanan düşünce süreci açıklamak olduğunu. Bu teknikler benzeşme ve özgüllük bireysel adaylar, karşılaştırma ve sıralama sırasında değerlendirmek için Floresans aktif hücre (FACS), sıralama kullanarak hücre içi bağlama analizini içerir ve peptid analiz dizileri eğilimlerini tespit etmek ve fikir birliği sıralarını anlama ve potansiyel olarak benzeşimi ve özgüllük faiz hedefi için arttırmak için.

Watch this Scientific Journal Video about Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates at JoVE.com

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning bakteriyel görüntü kitaplıkları peptid benzeşme reaktifler, antikorlar için güçlü bir alternatif keşfi için kanıtlanmış bir tekniktir. Yarı Otomatik sıralama yöntemini burada yanlış pozitif oluşumunu azaltmak için biopanning aerodinamik. Burada düşünce süreci ve adayların değerlendirilmesi ve aşağı akım analizi en aza indirerek uygulanan teknikler gösterilmektedir.

Peptid benzeşme reaktif keşif ve elde edilen yalıtır analizi için bakteriyel ekran kütüphanelerin yarı otomatik Biopanning

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Yöntem HCN1 ve TRIP8b arasında protein-protein etkileşimi küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Antikor parçalarının bir kütüphanenin taranması için bakteriyel iç zar görüntü

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Dört Biyosensör Platformları kullanma Yüksek yakınlık Antikor-antijen Cilt Kinetiklerinin Belirlenmesi

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Protein bazlı Hydrogels mimarilerde kolayca idare hücre kültür uygulamaları için

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Histon Antikor Özgüllüğünün Peptit Mikroarraylerle Analizi

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

Hücre dışı Protein Mikroarray teknoloji yüksek işlem hacmi düşük benzeşme reseptör-Ligand etkileşimleri algılanması için

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Primer ınsan hava yolu epitel hücrelerinin hava yolu yüzeyi sıvı pH 'Sı gerçek zamanlı, yarı otomatik floresan ölçümü

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Membran Protein-Protein Etkileşim Analizi için Yerli Hücreli Membran Nanopartiküller Sistemi

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases

E3 Ligases için Ubiquitin Varyant Modülatörleri Geliştirmek için Faj Ekran Kullanma

Ubiquitin is a small 8.6 kDa protein that is a core component of the ubiquitin-proteasome system. Consequently, it can bind to a diverse array of proteins ...