Name: live imaging of primary cerebral cortex cells using a 2d culture system
Uploaded: 2017-08-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System at JoVE.com

هذا العمل كان يدعمها المجلس (المجلس الوطني للتنمية Científico ه تكنولوجيا البحار)، الرؤوس (وكالة دي Coordenação دي فترة دي المستوى الأعلى) وفابيرن (Fundação de Amparo تفعل البحوث ريو غراندي دو نورتي).

All experiments involving live animals described in this protocol are conducted according to the National and International laws and were approved by the local University Animal Care and Use Committee (CEUA/UFRN), under the license 009/2014. The following protocol is performed in a sterile environment. Familiarity with basic cell culture is expected.
1. Dorsolateral Telencephalon Microdissection
<ol>
	<li>Prepare the dissection medium (100 mL): 98.5 mL Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS...

مراقبة الوقت الحقيقي من خلايا قشرة الدماغ الأولية يسمح تحليل انتشار الخلايا، ووضع تقسيم الخلية وطول دورة الخلية، وتمايز خلية وخلية بقاء3،،من1415،37. الأهم من ذلك، أنها تسمح دراسة الأنساب خلية واحدة، مما يؤدي إلى تحديد ال...

توليد الخلايا الجذعية العصبية (مجلس الأمن القومي) من الخلايا العصبية والخلايا ماكروجليال أثناء تنمية قشرة الدماغ. في وقت مبكر-كورتيكوجينيسيس، الود الخضوع لعدة جولات من انقسام الخلايا المتماثلة، وتوسيع قاعدة السلف. ثم، تقسم الود دون تناسق لتوليد الخلايا العصبية مباشرة أو غير مباشرة من خلال وسيطة1. فقط في منتصف-للتأخر-كورتيكوجينيسيس، المتكفل التبديل إلى توليد astrocytes و oligodendrocytes2،،من34. ومع ذلك، تظل آليات كاملة التي تتحكم في تكاثر الخلايا والتمايز، فضلا عن مساهمة مقيدة بمصير المتكفل بتوليد أنواع فريدة من الخلايا العصبية أو خلايا ماكروجليال مثار نقاش مكثف4،،من56. إمكانات فردية الود القشرية لتوليد الخلايا العصبية وأستروسيتيس وأوليجوديندروسيتيس وقد درس على نطاق واسع في المختبر و في فيفو باستخدام مجموعة متنوعة تقنيات مثل: يعيش التصوير في الثقافات خلية واحدة7،8،9،10،11،،من1213؛ يعيش التصوير في ثقافات عالية الكثافة الثقافات3،،من1415؛ يعيش التصوير في شريحة الثقافات16،،من1718؛ تحليل الاستنساخ باستخدام الفيروسية بوساطة ناقلات الأمراض الوراثية وسم في ثقافات عالية الكثافة14،15،19،،من2021؛ تحليل الاستنساخ في فيفو استخدام لفي22،23،24،25،26،27،،من2829،30،31،،من3233؛ وتحليل الاستنساخ في فيفو استخدام الحيوانات المحورة وراثيا34.
ويقدم كل من هذه التقنيات الإيجابيات والسلبيات. على سبيل المثال، في فيفو تتبع النسب عرضه لفاعلين وتقسيم الأخطاء3، مما يؤدي إلى استنتاجات متضاربة حول إمكانية المتكفل القشرية الفردية. علاوة على ذلك، سواء الدراسات في المختبر و في فيفو تستند إلى العلامات من خلايا السلف في وقت مبكر-النقاط والتحليل اللاحق للأنساب الخلية قد تتأثر بحدوث موت الخلية أثناء تطور النسب35التي لم يتم كشفها. ولذلك، يجب أن تسمح نظام مناسب لتحليل إمكانات الود واحد تحديد كافة الخلايا التي تم إنشاؤها، وكذلك وصف مصائر خلية داخل النسب المناسبة. مزيج من الثقافة الخلية الأولية وتصوير مباشر يوفر هذا الإعداد. استخدام الثقافة وحيدة الخلية ومجهرية الفيديو الوقت الفاصل، أظهرت معبد et al. التبديل في نسب موروث الفردية قشرة الدماغ من الخلايا جليوجينيسيس11. في وقت لاحق، أنها تستخدم نفس النظام لإظهار أن يتم إنشاء أنواع مختلفة من الخلايا العصبية من السلف القشرية واحد12. ومع ذلك، يعرض هذا النظام تحذير هام: فقط 1% فروعه القشرية معزولة في وقت مبكر كورتيكوجينيسيس تولد الحيوانات المستنسخة من ذرية 4 أو أكثر9. بعد إضافة FGF2، زيادة تواتر خلايا توليد خلايا 4 أو أكثر إلى 8-10%9. ومع ذلك فإن هذا الرقم صغير جداً بالنظر إلى أن تقريبا جميع فروعه القشرية التكاثري في هذه المرحلة. وعلاوة على ذلك، لا يمكن استبعاد الآثار المحتملة ل FGF2 على مواصفات مصير36. للالتفاف على هذه القيود، استخدمنا الثقافات الخلية عالية الكثافة التي تدعم انتشار كل البطين (التعبير عن Pax6) وسوبفينتريكولار (التعبير عن Tbr2) المتكفل القشرية15. وعلاوة على ذلك، أظهرت المراقبة في الوقت الحقيقي من هذه الثقافات أن ترد العديد من الميزات لمجلس الأمن القومي نسب التقدم في ظل هذه الظروف، مثل وضع انقسام الخلية، وإطالة دورة الخلية، وإمكانات الخلايا المفردة لتوليد الخلايا العصبية وإطلاق، بين أمور أخرى3،15. في الآونة الأخيرة، استخدمنا أيضا هذا النظام لإظهار أن إشارات كريب يؤثر على بقاء الخلية من الخلايا العصبية في قشرة الدماغ غير ناضجة في الفئران37. وهكذا، ونحن نعتقد أن الوقت الفاصل بين الفيديو-الفحص المجهري لقشرة الدماغ موريني الابتدائي الخلايا التي تزرع بكثافة عالية أداة قوية ويمكن الوصول إليها لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية لتقدم دورة الخلية، ووضع شعبة الخلية وبقاء الخلية وتحديد مصير الخلية. هذا الأخير يمكن إنجاز باستخدام الحيوانات المحورة وراثيا، مما يتيح تحديد مصائر خلية معينة في الوقت الحقيقي38،،من3940 أو استخدام ما بعد التصوير إيمونوسيتوتشيميستري3،38،،من4142.
هنا، نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لإعداد ثقافة الخلية قشرة الدماغ الأساسي دعم انتشار الود والجيل اللاحق من الخلايا العصبية والخلايا ماكروجليال. نناقش أيضا استخدام تعداء للفيروس بوساطة للتلاعب بالجينات للخلايا الفردية، التي يمكن تحديدها وتعقب على مستوى خلية واحدة باستخدام مجهر الفيديو الوقت الفاصل بين. يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة خلايا قشرة الدماغ الأولية المعزولة من البداية إلى نهاية كورتيكوجينيسيس في القوارض، ولكن قد يلزم إدخال تعديلات قليلة وفقا للمرحلة14. الود المعزولة من مصادر أخرى يمكن أن تدرس أيضا استخدام الفحص المجهري الفيديو الوقت الفاصل بين الثقافات في 2D، ولكن ينبغي أن يحدده النظام تثقيف مناسب مقارنة الخلية السلوكيات في المختبر و في فيفو38،43.

<table width="953">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td style="width:344px;">14175129</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>12400-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:344px;">16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Goat serum</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">69023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">VWR International Ltd.</td>
			<td style="width:344px;">306324N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>792632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-MAP2, mouse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-GFP chicken</td>
			<td>Aves</td>
			<td>0511FP12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat anti-mouse alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat anti-chicken alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">ImageJ</td>
			<td style="width:123px;">NIH</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">tTt</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell observer microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pasteur pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">The Tracking Tool (tTt) software</td>
			<td></td>
			<td>https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html</td>
			<td>download link</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of primary cerebral cortex cells using a 2d culture system

أثناء تطوير قشرة الدماغ، تخضع الخلايا السلف عدة جولات من انقسامات الخلية المتماثلة وغير المتماثلة لتوليد جديدة موروث أو الخلايا العصبية بوستميتوتيك. في وقت لاحق، تبديل بعض فروعه لمصير جليوجينيك، إضافة إلى السكان أستروسيتي وأوليجوديندروسيتي. باستخدام الفيديو الفحص المجهري الوقت الفاصل بين الثقافات الخلية الأولية قشرة الدماغ، من الممكن لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية السيطرة على طريقة تقسيم الخلية ومعلمات دورة الخلية من الخلايا السلف. وبالمثل، يمكن دراسة مصير الخلايا بوستميتوتيك استخدام البروتينات مراسل الفلورسنت الخاصة بخلية أو ما بعد التصوير إيمونوسيتوتشيميستري. الأهم من ذلك، يمكن أن تحلل كل هذه الميزات على مستوى خلية واحدة، يسمح بتحديد المتكفل ملتزمة بتوليد أنواع معينة من الخلايا. يمكن أيضا إجراء التلاعب بالجينات باستخدام تعداء الفيروسية بوساطة، السماح بدراسة الظواهر خلية مستقلة وذاتية الحكم في الخلية. وأخيراً، يسمح استخدام البروتينات الفلورية الانصهار دراسة توزيع المتماثلة وغير المتماثلة للبروتينات المحددة خلال شعبة والترابط مع مصير الخلايا الوليدة. وهنا يصف لنا طريقة الفيديو-الفحص المجهري الوقت الفاصل بين الصورة موريني خلايا قشرة الدماغ الأولية لما يصل إلى عدة أيام وتحليل طريقة انقسام الخلية، وطول دورة الخلية ومصير الخلايا التي تم إنشاؤها حديثا. ونحن أيضا وصف أسلوب بسيط ترانسفيكت الخلايا السلف، والتي يمكن تطبيقها على التلاعب بالجينات للفائدة أو ببساطة قم بتسمية الخلايا التي تحتوي على بروتينات مراسل.

Primary cultures of cerebral cortex cells isolated from embryos E14 contain both progenitor and neuronal cells. During the period of imaging, progenitors undergo several rounds of cell division, increasing the number of cells (Figure 5 and Video Figure 1).
Retroviral-mediated transfection of a few progenitor cells facilitates the identification of cell clones (F...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System at JoVE.com

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

تصوير الحية أداة قوية لدراسة السلوكيات الخلوية في الوقت الحقيقي. هنا، نحن وصف بروتوكول للوقت الفاصل بين الفيديو-مجهرية من خلايا قشرة الدماغ الأولية التي تتيح دراسة تفصيلية لمراحل سنت خلال تطور النسب من الخلايا الجذعية العصبية الأولية للخلايا العصبية متمايزة وإطلاق.

يعيش تصوير خلايا قشرة الدماغ الأولية باستخدام نظام ثقافة 2D

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

الرنين المغناطيسي الطيفي للعيش ذبابة الفاكهة السوداء البطن غزل باستخدام زاوية ماجيك

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral ...

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

مزمنة التصوير ماوس القشرة البصرية باستخدام إعداد ضعفت - الجمجمة

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

تصوير الحية إزفاء PKC في Sf9 خلايا في الخلايا العصبية والحسية Aplysia

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

تعيش خلية التصوير الحسي للخلايا السليمة في الجهاز السلائف ذبابة الفاكهة شرانق

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

كشف عن نقص الأكسجة Microregional في اللحاء المخي الفأر بواسطة التصوير ثنائي الفوتون من الإسفار NADH الذاتية

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

التصور والتلاعب الجيني من التشعبات والاعمده الفقريه في قشرة الدماغ والحصين ماوس باستخدام<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

في وقت واحد رسم المخ، في الوقت الحقيقي قياس تركيز اللاكتات والتلاعب Optogenetic من نشاط الخلايا العصبية في القشرة الدماغية القوارض

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

التصوير الوظيفي للسمعي اللحاء في القطط الكبار باستخدام الحقل عالي الرنين المغناطيسي الوظيفي

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

التصوير حية من الانقسام في تطوير الجنينية الماوس اللحاء

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

التصوير المباشر ل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...