Name: live imaging of primary cerebral cortex cells using a 2d culture system
Uploaded: 2017-08-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), KAPPER (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) og FAPERN (Fundação de Amparo en Pesquisa Rio Grande do Norte).

All experiments involving live animals described in this protocol are conducted according to the National and International laws and were approved by the local University Animal Care and Use Committee (CEUA/UFRN), under the license 009/2014. The following protocol is performed in a sterile environment. Familiarity with basic cell culture is expected.
1. Dorsolateral Telencephalon Microdissection
<ol>
	<li>Prepare the dissection medium (100 mL): 98.5 mL Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS...

Realtid observation af primære hjernebarken celler giver mulighed for analyse af celleproliferation, celledeling, celle cyklus længde, Celledifferentiering og celle overlevelse3,14,15,37. Endnu vigtigere, giver det studiet af encellede lineages, føre til identifikation af de mellemliggende faser vedtaget under progression fra NSCs til neuroner3. Endelig, kombinationen...

Neurale stamceller (NSC) generere neuroner og macroglial celler under hjernebarken udvikling. På tidlige-corticogenesis, NSCs gennemgå flere runder af symmetrisk celledeling, og udvide stamfader pool. Derefter, NSCs kløft asymmetrisk til at generere neuroner direkte eller indirekte gennem mellemprodukter1. Kun ved skifte midt - til slutningen-corticogenesis, stamfaderen for at generere astrocytes og oligodendrocytes2,3,4. Dog stadig de komplette mekanismer, der styrer celle spredning og differentiering samt bidrag af skæbne-begrænset stamfaderen til generation af unikke typer for neuroner eller macroglial celler af intens debat4,5,6. Enkelte kortikale NSCs potentiale til at generere neuroner, astrocytes og oligodendrocytes er blevet grundigt undersøgt in vitro- og vivo ved hjælp af et utal af teknikker såsom: live imaging i single-cellekulturer7,8,9,10,11,12,13; Live billedbehandling i high-density kulturer kulturer3,14,15. Live billedbehandling i Skive kulturer16,17,18; klonede analyse ved hjælp af viral vektor-medieret genetiske mærkning i high-density kulturer14,15,19,20,21; klonede analyse i vivo ved hjælp af retrovirus22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; og klonede analyse i vivo ved hjælp af transgene dyr34.
Hver af disse teknikker præsenterer fordele og ulemper. For eksempel, er i vivo afstamning sporingen modtagelige til overbegreb og opsplitning fejl3, fører til modstridende konklusioner om potentielle af individuelle kortikale stamfaderen. Desuden både in vitro og i vivo undersøgelser baseret på mærkning af stamceller i tidlig tid-punkter og posterior analyse af celle lineages kan være påvirket af uopdaget forekomsten af celledød i løbet af afstamning-progression35. Derfor skal et passende system til at analysere potentialet i enkelt NSCs giver mulighed for identifikation af alle celler genereret, samt passende karakterisering af celle skæbner i slægt. Kombinationen af primære cellekultur- og levende billedbehandling giver denne indstilling. Ved hjælp af enkelt celle kultur og time-lapse video mikroskopi, har tempel et al. vist parameteren i lineage af individuelle hjernebarken ophav fra neurogenese gliogenesis11. Senere, brugte de det samme system til at vise, at forskellige typer for neuroner er genereret fra en enkelt kortikale stamfader12. Men dette system præsenterer en vigtig advarsel: kun 1% af kortikale stamfaderen isoleret på tidlig corticogenesis generere kloner af 4 eller flere afkom9. Efter tilsætning af FGF2, hyppigheden af celler skabe 4 eller flere celler øger til 8-10%9. Dette tal er dog alt for lille, i betragtning af at stort set alle kortikale ophav er proliferativ på dette stadium. Desuden, de potentielle virkninger af FGF2 på skæbne-specifikation kan ikke udelukkes,36. For at omgå disse begrænsninger, vi brugte high-density cellekulturer, der understøtter spredning af både ventrikulære (Pax6-udtryk) og subventricular (Tbr2-udtrykker) kortikale stamfaderen15. Desuden har real-time observation af disse kulturer vist, at flere funktioner i NSC lineage progression er gengivet under disse betingelser, såsom tilstand af celledeling, forlængelse af cellecyklus, potentiale af enkelt celler til at generere neuroner og glia, blandt andet3,15. For nylig, har vi også brugt dette system til at vise, at CREB-signalering påvirker celle overlevelse af umodne hjernebarken neuroner i mus37. Vi mener således, at time-lapse video-mikroskopi af primære murine hjernebarken celler dyrkes i høj tæthed er en kraftfuld og tilgængeligt værktøj til at studere cellulære og molekylære mekanismer af cellecyklus progression, celledeling, celle overlevelse og celle skæbne specifikation. Sidstnævnte kan opnås ved hjælp af transgene dyr, muliggør identificering af specifikke celle skæbner på realtid38,39,40 eller brugen af post imaging immuncytokemi3,38,41,42.
Her, leverer vi en trinvis protokol for at forberede primære hjernebarken cellekultur støtte udbredelsen af NSCs og den efterfølgende generation af neuroner og macroglial celler. Vi diskuterer også brugen af retrovirale-medieret Transfektion at manipulere genekspression af individuelle celler, som kan identificeres og spores på én celle niveau ved hjælp af time-lapse video mikroskopi. Denne protokol kan bruges til at studere primære hjernebarken celler isoleret fra begyndelsen til slutningen af corticogenesis i gnavere, men et par justeringer kan kraeves efter fase14. NSCs isoleret fra andre kilder kan også studeres ved hjælp af time-lapse video mikroskopi af 2D kulturer, men den passende dyrkningsbaserede system bør bestemmes ved at sammenligne celle adfærd i in vitro og i vivo38,43.

<table width="953">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td style="width:344px;">14175129</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>12400-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:344px;">16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Goat serum</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">69023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">VWR International Ltd.</td>
			<td style="width:344px;">306324N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>792632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-MAP2, mouse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-GFP chicken</td>
			<td>Aves</td>
			<td>0511FP12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat anti-mouse alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat anti-chicken alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">ImageJ</td>
			<td style="width:123px;">NIH</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">tTt</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell observer microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pasteur pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">The Tracking Tool (tTt) software</td>
			<td></td>
			<td>https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html</td>
			<td>download link</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of primary cerebral cortex cells using a 2d culture system

Under hjernebarken udvikling gennemgå stamceller flere runder af symmetriske og asymmetriske celledelinger til at generere nye ophav eller postmitotic neuroner. Senere, skifte nogle stamfaderen til en gliogenic skæbne, tilføje til astrocyte og oligodendrocyte befolkningerne. Bruge time-lapse video-mikroskopi af primære hjernebarken cellekulturer, er det muligt at undersøge de cellulære og molekylære mekanismer at kontrollere tilstanden af celledeling og cellecyklus parametre af stamceller. Ligeledes, skæbnen af postmitotic celler kan undersøges ved hjælp af celle-specifikke fluorescerende reporter proteiner eller post imaging immuncytokemi. Endnu vigtigere, kan alle disse funktioner analyseres på én celle-niveau, identifikation af stamfaderen forpligtet til generation af specifikke celletyper. Manipulation af genekspression kan også udføres ved hjælp af viral-medieret Transfektion, giver mulighed for undersøgelse af celle-selvstændig og ikke-celle-selvstændige fænomener. Endelig giver brugen af fusion fluorescerende proteiner studiet af symmetriske og asymmetriske fordeling af udvalgte proteiner under division og korrelation med datterceller skæbne. Her, beskrive vi metoden time-lapse video-mikroskopi billede primære hjernebarken murine celler for op til flere dage og analysere tilstanden af celledeling, celle cyklus længde og skæbne af nyligt genererede celler. Vi beskriver også en enkel metode til at transfect stamceller, der kan anvendes til at manipulere gener af interesse eller simpelthen mærke celler med reporter proteiner.

Primary cultures of cerebral cortex cells isolated from embryos E14 contain both progenitor and neuronal cells. During the period of imaging, progenitors undergo several rounds of cell division, increasing the number of cells (Figure 5 and Video Figure 1).
Retroviral-mediated transfection of a few progenitor cells facilitates the identification of cell clones (F...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System at JoVE.com

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Live imaging er et kraftfuldt værktøj til at studere cellulær adfærd i realtid. Her, beskriver vi en protokol for time-lapse video-mikroskopi af primære hjernebarken celler, der giver mulighed for en detaljeret gennemgang af de faser, der er vedtaget under lineage progression fra primære neurale stamceller til differentieret neuroner og glia.

Live Imaging af primære hjernebarken celler ved hjælp af en 2D kultur

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral ...

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Påvisning af Microregional Hypoxia i mus hjernebarken ved to-foton Imaging af endogent NADH Fluorescens

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisering og genetisk manipulering af dendritter og udløberne i mus cerebrale cortex og hippocampus under anvendelse<em&gt; I utero</em&gt; Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Samtidig Elektroencefalografi, Real-time måling af laktat Koncentration og Optogenetic Manipulation af neuronale aktivitet i Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Funktionel Imaging af Auditory Cortex i voksne katte ved hjælp af High-felt fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Live-Imaging mitosens i udviklingslandene mus embryonale Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live-Imaging af<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvetilstand neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...