Name: live imaging of primary cerebral cortex cells using a 2d culture system
Uploaded: 2017-08-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e autonoom), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de interactieve Superior) en FAPERN (Fundação de Amparo een Pesquisa Rio Grande do Norte).

All experiments involving live animals described in this protocol are conducted according to the National and International laws and were approved by the local University Animal Care and Use Committee (CEUA/UFRN), under the license 009/2014. The following protocol is performed in a sterile environment. Familiarity with basic cell culture is expected.
1. Dorsolateral Telencephalon Microdissection
<ol>
	<li>Prepare the dissection medium (100 mL): 98.5 mL Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS...

Real-time observatie van primaire hersenschors cellen kan de analyse van celproliferatie, modus voor celdeling, celdifferentiatie en lengte van de celcyclus cel survival3,14,15,37. Wat nog belangrijker is, maakt het de studie van eencellige lineages, wat leidt tot de identificatie van de tussenliggende fasen vastgesteld tijdens de overgang van NSCs naar neuronen3. Ten sl...

Neurale stamcellen (NSC) genereren van neuronen en macroglial cellen tijdens de ontwikkeling van de hersenschors. Bij vroege-corticogenesis, NSCs ondergaan verschillende rondes van symmetrische celdeling en vouw het voorlopercellen zwembad. Vervolgens NSCs kloof asymmetrisch voor het genereren van neuronen, direct of indirect via intermediairen1. Alleen op schakelen midden - tot laat-corticogenesis, progenitoren voor het genereren van astrocyten en oligodendrocyten2,3,4 De volledige mechanismen waarmee de celproliferatie en differentiatie, alsmede de bijdrage van de progenitoren lot-beperkt tot de generatie van unieke soorten neuronen of macroglial cellen blijven echter een kwestie van intens debat4,5,6. Het potentieel van individuele corticale NSCs voor het genereren van neuronen, astrocyten en oligodendrocyten geweest uitgebreid bestudeerde in vitro en in vivo met behulp van een groot aantal technieken, zoals: live beeldvorming in eencellige culturen7,8,9,10,11,12,13; Live imaging in high-density culturen culturen3,14,15; Live imaging in segment culturen16,17,18; klonen analyse met behulp van virale vector-gemedieerde genetische labeling van high-density culturen14,15,19,20,21; klonen analyse in vivo met behulp van retrovirus22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; en het klonen analyse in vivo gebruik van transgene dieren34.
Elk van deze technieken presenteert voors en tegens. Bijvoorbeeld, is in vivo lineage tracering gevoelig voor het samenvoegen en splitsen fouten3, leiden tot tegenstrijdige conclusies over de mogelijkheden van individuele corticale voorlopercellen. Bovendien, zowel in vitro en in vivo studies gebaseerd zijn op de etikettering van voorlopercellen op vroege tijd-punten en posterieure analyse van cel lineages kan worden beïnvloed door het onopgemerkt vóórkomen van celdood tijdens lineage-progressie35. Een geschikt systeem voor het analyseren van de mogelijkheden van één NSCs moet dan ook toe dat de identificatie van alle cellen gegenereerd, alsmede de passende karakterisatie van het lot van de cel binnen de bloedlijn. Combinatie van primaire celculturen en levende imaging biedt deze instelling. Met behulp van eencellige cultuur en tijd-tijdspanne videomicroscopie, tempel et al. is gebleken de schakelaar in de bloedlijn van individuele hersenschors voorlopercellen van neurogenese naar gliogenesis11. Later gebruikte ze hetzelfde systeem om te laten zien dat er verschillende soorten neuronen worden gegenereerd uit een enkele corticale voorlopercellen12. Dit systeem kampt echter met een belangrijk voorbehoud: slechts 1% van de corticale progenitoren geïsoleerd op vroege corticogenesis klonen van 4 of meer nakomelingen9 genereren. Na de toevoeging van FGF2, de frequentie van cellen genereren van 4 of meer cellen loopt tot en met 8-10%9. Dit aantal is echter te klein gezien het feit dat vrijwel alle corticale progenitoren proliferatieve in dit stadium. Worden bovendien, de mogelijke effecten van FGF2 op lot-specificatie kunnen niet uitgesloten36. Om te omzeilen deze beperkingen, gebruikten we high-density celculturen die ondersteuning bieden voor de verspreiding van beide ventriculaire (Pax6-uitdrukken) en subventriculaire (Tbr2-uitdrukken) corticale progenitoren15. Het real-time opvolgen van deze culturen heeft bovendien aangetoond dat verschillende functies van NSC lineage progressie worden gereproduceerd in deze omstandigheden, zoals de wijze van celdeling, verlenging van de celcyclus, potentieel van afzonderlijke cellen voor het genereren van neuronen en glia, o.a.3,15. Meer recentelijk hebben we dit systeem ook gebruikt om te tonen dat CREB signalering gevolgen heeft voor de overleving van de cel van onrijpe hersenschors neuronen in muizen37. Dus, wij zijn van mening dat time-lapse video-microscopie van primaire lymfkliertest hersenschors cellen gekweekt in hoge dichtheid is een krachtige en toegankelijke hulpmiddel om te studeren van cellulaire en moleculaire mechanismen van de celcyclus, de wijze van de celdeling, de overleving van de cel en de cel lot specificatie. De laatste kan worden bereikt met behulp van transgene dieren, zodat de identificatie van specifieke cel lot op real-time38,39,40 of het gebruik van post imaging immunocytochemie3,38,41,42.
Hier bieden we een stapsgewijze protocol ter voorbereiding van de primaire hersenschors celkweek ter ondersteuning van de verspreiding van NSCs en de latere generaties van neuronen en macroglial cellen. Ook bespreken we het gebruik van retrovirale-gemedieerde Transfectie te manipuleren van de genexpressie van afzonderlijke cellen, die kunnen worden geïdentificeerd en getraceerd op het niveau van de eencellige met behulp van de tijd-tijdspanne videomicroscopie. Dit protocol kan worden gebruikt voor het bestuderen van primaire hersenschors cellen geïsoleerd van het begin tot het einde van de corticogenesis in knaagdieren, maar een paar aanpassingen kunnen worden verlangd overeenkomstig de etappe14. NSCs geïsoleerd uit andere bronnen kunnen ook worden bestudeerd met behulp van de tijd-tijdspanne videomicroscopie van 2D culturen, maar de juiste kweken systeem moet worden bepaald door het vergelijken van cel gedrag in vitro en in vivo38,43.

<table width="953">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td style="width:344px;">14175129</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>12400-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:344px;">16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Goat serum</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">69023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">VWR International Ltd.</td>
			<td style="width:344px;">306324N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>792632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-MAP2, mouse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-GFP chicken</td>
			<td>Aves</td>
			<td>0511FP12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat anti-mouse alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat anti-chicken alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">ImageJ</td>
			<td style="width:123px;">NIH</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">tTt</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell observer microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pasteur pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">The Tracking Tool (tTt) software</td>
			<td></td>
			<td>https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html</td>
			<td>download link</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of primary cerebral cortex cells using a 2d culture system

Tijdens de ontwikkeling van de hersenschors ondergaan voorlopercellen verschillende rondes van symmetrische en asymmetrische celdelingen voor het genereren van nieuwe progenitoren of postmitotic neuronen. Later, overschakelen enkele progenitoren naar het lot van een gliogenic, toe te voegen aan de Astrocyt en Oligodendrocyt populaties. Met behulp van time-lapse video-microscopie van hersenschors primaire celculturen, is het mogelijk om te bestuderen van de cellulaire en moleculaire mechanismen beheersen de modus van de celdeling en celcyclus parameters van voorlopercellen. Het lot van postmitotic cellen kan ook worden onderzocht met behulp van fluorescerende verslaggever van de cel-specifieke eiwitten of post imaging immunocytochemie. Wat nog belangrijker is, kunnen al deze functies op het niveau van eencellige, zodat de identificatie van de progenitoren ertoe verbonden de generatie van specifieke celtypes worden geanalyseerd. Manipulatie van genexpressie kan ook worden uitgevoerd met behulp van virale-gemedieerde transfectie, waardoor de studie van cel-zelfstandige en niet-cel-autonome verschijnselen. Ten slotte, staat het gebruik van fusie fluorescerende eiwitten de studie van symmetrische en asymmetrische verdeling van geselecteerde eiwitten tijdens divisie en de correlatie met het lot van de dochtercellen. Hier beschrijven we de time-lapse video-microscopie methode beeld van primaire hersenschors lymfkliertest cellen voor maximaal enkele dagen en analyseren van de modus van de celdeling, lengte van de celcyclus en lot van nieuw gegenereerde cellen. Ook beschrijven we een eenvoudige methode om transfect van voorlopercellen, die kunnen worden toegepast op het manipuleren van genen van belang of gewoon label cellen met verslaggever eiwitten.

Primary cultures of cerebral cortex cells isolated from embryos E14 contain both progenitor and neuronal cells. During the period of imaging, progenitors undergo several rounds of cell division, increasing the number of cells (Figure 5 and Video Figure 1).
Retroviral-mediated transfection of a few progenitor cells facilitates the identification of cell clones (F...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System at JoVE.com

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Levende imaging is een krachtig hulpmiddel om te studeren van cellulaire gedrag in real-time. Hier beschrijven we een protocol voor time-lapse video-microscopie van primaire hersenschors cellen waarmee een gedetailleerd onderzoek van de fasen die onder de progressie van de bloedlijn van primaire neurale stamcellen gedifferentieerde neuronen en glia werden.

Live beeldvorming van primaire hersenschors cellen met behulp van een systeem van 2D cultuur

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

Magnetische Resonantie Spectroscopie van leven Drosophila melanogaster Met behulp van Magic Angle Spinning

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral ...

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Chronische Imaging van de muis visuele cortex met behulp van een verdunde-schedel Voorbereiding

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-beeldvorming van PKC Translocatie in Sf9 cellen en in Aplysia sensorische neuronen

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging van zintuig voorloper cellen in Intact Drosophila Poppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Detectie van Microregional Hypoxie in Mouse Cerebral Cortex door twee-foton Imaging van endogene NADH fluorescentie

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisatie en genetische manipulatie van dendrieten en stekels in de muis Cerebral cortex en de hippocampus met behulp van<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Gelijktijdig Elektro, Real-time meting van lactaatconcentratie en Optogenetic Manipulatie van neuronale activiteit in de Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Functionele Beeldvorming van de auditieve cortex in volwassen katten met behulp van High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Live-Imaging van mitose in het ontwikkelen van muis embryonale Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...