Name: live imaging of primary cerebral cortex cells using a 2d culture system
Uploaded: 2017-08-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי CNPq (Conselho נאסיונאל דה Desenvolvimento אזור e Tecnológico), שכמיות (Coordenação דה Aperfeiçoamento דה Pessoal דה Nível מעולה), FAPERN (Fundação de אמפרו עושה Pesquisa ריו גרנדה דו נורטה).

All experiments involving live animals described in this protocol are conducted according to the National and International laws and were approved by the local University Animal Care and Use Committee (CEUA/UFRN), under the license 009/2014. The following protocol is performed in a sterile environment. Familiarity with basic cell culture is expected.
1. Dorsolateral Telencephalon Microdissection
<ol>
	<li>Prepare the dissection medium (100 mL): 98.5 mL Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS...

תצפית בזמן אמת של קליפת המוח ראשי תאים מאפשרת הניתוח של התפשטות תאים, מצב של חלוקת התא, אורך מחזור התא, תאית התמיינות תאים הישרדות3,14,15,37. חשוב מכך, הוא מאפשר חקר שושלות מתא בודד, שמוביל הזיהוי של שלבי ביניים שחוקקו במהלך ה...

תאי גזע עצביים (המל ל) ליצור נוירונים ותאי macroglial במהלך התפתחות קליפת המוח. בשעה מוקדמת-corticogenesis, NSCs עוברים כמה סבבים של חלוקת התא סימטרי, להרחיב את המאגר קדמון. לאחר מכן, NSCs לחלק בצורה א-סימטרית כדי ליצור נוירונים במישרין או בעקיפין דרך ביניים1. רק באמצע - עד מאוחר-corticogenesis, אבות מעבר להפקת האסטרוציטים ו אוליגודנדרוציטים2,3,4. עם זאת, המנגנון מלאה לשלוט התפשטות תאים, בידול, כמו גם את התרומה של אבות מוגבלת גורל לדור של סוגים ייחודיים של נוירונים או תאים macroglial נשארים עניין של ויכוח אינטנסיבי-4,-5,-6. הפוטנציאל של הפרט NSCs בקליפת המוח לייצר נוירונים, האסטרוציטים ו אוליגודנדרוציטים כבר למדה בהרחבה במבחנה וב ויוו באמצעות מספר עצום של טכניקות כגון: לחיות הדמיה תא בודד תרבויות7,8,9,10,11,12,13; חיים הדמיה תרבויות בצפיפות גבוהה תרבויות3,14,15; חיים הדמיה פרוסה תרבויות16,17,18; ניתוח המשובטים באמצעות ויראלי בתיווך וקטור גנטי תיוג תרבויות בצפיפות גבוהה14,15,19,20,21; ניתוח המשובטים ויוו באמצעות הרטרווירוס22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; ניתוח המשובטים ויוו באמצעות בעלי חיים הטרנסגניים34.
כל אחת מהטכניקות הללו מציג יתרונות וחסרונות. למשל, אין ויוו שושלת היוחסין עקיבה חשופה מכלילה, פיצול שגיאות3, המוביל למסקנות סותרות לגבי הפוטנציאל של אבות קורטיקלית בודדים. יתר על כן, שני חוץ גופית בתוך ויוו מחקרים בהתבסס על תיוג של ובתאים בנקודות זמן מוקדמת, ניתוח האחורי של תא שושלות עלול להיות מושפע המופע להתגלות של מוות של תאים במהלך שושלת היוחסין-התקדמות35. לכן, מערכת מתאימה כדי לנתח את הפוטנציאל של NSCs יחיד לאפשר הזיהוי של כל התאים שנוצר, כמו גם אפיון תא הגורלות בתוך שושלת היוחסין המתאים. שילוב של תרבות התא העיקרי הדמיה חיה מספק הגדרה זו. באמצעות מיקרוסקופ וידאו זמן לשגות והתרבות של תא בודד, מקדש. et al. הראו את המתג בשושלת של קליפת המוח בודדים אבות מ נוירוג'נסיס gliogenesis11. מאוחר יותר, הם השתמשו באותה המערכת כדי להראות כי סוגים שונים של נוירונים נוצרות יחיד קדמון קורטיקלית12. עם זאת, מערכת זו מציג של הקונה חשוב: רק 1% של אבות בקליפת המוח מבודדים-corticogenesis מוקדם ליצור שיבוטים של רומא של 4 או יותר-9. לאחר התוספת של FGF2, מגדילה את התדירות של תאים ליצירת תאים 4 או יותר ל- 8-10%9. למרות זאת, מספר זה הוא קטן מדי בהתחשב כי כמעט כל אבות קורטיקלית proliferative בשלב זה. יתר על כן, השפעת פוטנציאל FGF2 על גורל-מפרט שלא ניתן לשלול36. כדי לעקוף את המגבלות האלה, השתמשנו תרביות תאים בצפיפות גבוהה התומכים ההתפשטות של שניהם חדרית (לבטא Pax6) ו subventricular (ביטוי Tbr2) אבות קורטיקלית15. יתר על כן, התצפית בזמן אמת של תרבויות אלה הראו כי מספר תכונות של המועצה לבטחון לאומי שושלת היוחסין התקדמות משוחזרות בתנאים אלה, כגון מצב של חלוקת התא, הארכה של מחזור התא, הפוטנציאל של תאים בודדים ליצירת נוירונים, עכשיו, דונלד, בין היתר3,15. לאחרונה, גם השתמשנו מערכת זו כדי להראות כי איתות CREB משפיע על ההישרדות תא של קליפת המוח ילדותי נוירונים בעכברים37. כך, אנו מאמינים כי מיקרוסקופיה-וידאו בצילום מואץ של קליפת מאתר ראשי תאים גדל בצפיפות גבוהה הוא כלי רב עוצמה ונגיש לחקור מנגנונים תאית ומולקולרית של מחזור התא התקדמות, מצב של חלוקת התא, התא הישרדות מפרט הגורל התא. האחרון יכול להתבצע באמצעות בעלי חיים מהונדס, המאפשר זיהוי תאים מסוים הגורלות בזמן אמת-38,-39,-40 או השימוש של פוסט-הדמיה immunocytochemistry3,38,41,42.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד להכנת ראשי קליפת תרבית תאים תומכים התפשטות NSCs הדור הבא של נוירונים ותאי macroglial. נדון גם את השימוש של retroviral בתיווך תרביות תאים לתמרן ביטוי גנים של תאים בודדים, אשר ניתן לזהות מעקב ברמה תא בודד באמצעות מיקרוסקופ וידאו זמן לשגות. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד קליפת המוח ראשי תאים מבודדים מההתחלה לסוף corticogenesis של מכרסמים, אך כמה התאמות העשויים להידרש, בהתאם שלב14. NSCs מבודד ממקורות אחרים שניתן גם ללמוד באמצעות מיקרוסקופ וידאו בצילום מואץ של תרבויות 2D, אבל במערכת culturing המתאימה צריך להיקבע על-ידי השוואת תא התנהגויות במבחנה , ויוו38,43.

<table width="953">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td style="width:344px;">14175129</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>12400-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:344px;">16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Goat serum</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">69023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">VWR International Ltd.</td>
			<td style="width:344px;">306324N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>792632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-MAP2, mouse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-GFP chicken</td>
			<td>Aves</td>
			<td>0511FP12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat anti-mouse alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat anti-chicken alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">ImageJ</td>
			<td style="width:123px;">NIH</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">tTt</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell observer microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pasteur pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">The Tracking Tool (tTt) software</td>
			<td></td>
			<td>https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html</td>
			<td>download link</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of primary cerebral cortex cells using a 2d culture system

במהלך התפתחות קליפת המוח, ובתאים עוברים כמה סבבים של חלוקות תאים סימטרי, אסימטרית כדי ליצור אבות חדש או נוירונים postmitotic. מאוחר יותר, כמה אבות לעבור גורל gliogenic, הוספת אסטרוציט ו אוליגודנדרוציטים האוכלוסיות. באמצעות זמן לשגות וידאו-מיקרוסקופיה של תרביות תאים קליפת המוח הראשי, זה אפשרי ללמוד את המנגנונים תאית ומולקולרית שליטה המצב של חלוקת התא ועל מחזור התא בפרמטרים של ובתאים. באופן דומה, אפשר לבחון את גורלו של תאים postmitotic באמצעות חלבונים כתב פלואורסצנט תאים ספציפיים או פוסט-הדמיה immunocytochemistry. חשוב מכך, ניתן לנתח כל התכונות הללו ברמה תא בודד, המאפשר זיהוי אבות מחויבת הדור של סוגי תאים ספציפיים. ניתן לבצע מניפולציה של ביטוי גנים גם באמצעות תקנים ויראלי בתיווך, המאפשר חקר תופעות תא-אוטונומי, ללא-תא-אוטונומי. לבסוף, השימוש של חלבונים פלורסנט פיוז'ן מאפשר חקר סימטרי אסימטרי והפצה של חלבונים הנבחר במהלך החטיבה, המתאם עם גורל תאי הבת. כאן, אנו מתארים את שיטת מיקרוסקופיה-וידאו זמן לשגות תמונה תאים מאתר קליפת המוח הראשי עבור ועד מספר ימים ולנתח את המצב של חלוקת התא, אורך מחזור התא, גורלו של תאים החדש שנוצר. אנו גם מתארים שיטה פשוטה כדי transfect ובתאים, אשר יכול להיות מיושם כדי לתפעל את הגנים של עניין או פשוט לשים תווית תאים עם הכתב חלבונים.

Primary cultures of cerebral cortex cells isolated from embryos E14 contain both progenitor and neuronal cells. During the period of imaging, progenitors undergo several rounds of cell division, increasing the number of cells (Figure 5 and Video Figure 1).
Retroviral-mediated transfection of a few progenitor cells facilitates the identification of cell clones (F...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System at JoVE.com

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

הדמיה חיה הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור התנהגויות הסלולר בזמן אמת. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור זמן לשגות וידאו-מיקרוסקופיה של קליפת המוח ראשי תאים המאפשרת בדיקה מקיפה של השלבים שחוקקו במהלך ההתקדמות שושלת היוחסין מתאי גזע עצביים העיקרי נוירונים הבדיל, עכשיו, דונלד.

חיים הדמיה של קליפת המוח ראשי תאים באמצעות מערכת תרבות 2D

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית של חיים תסיסנית melanogaster באמצעות ספינינג זווית הקסם

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral ...

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

הדמיה כרונית של עכבר-Visual Cortex שימוש ההכנה סחוט הגולגולת

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-הדמיה של טרנסלוקציה של PKC Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

זיהוי של היפוקסיה Microregional בקליפת עכבר מוחין על ידי הדמיה של שני הפוטונים אנדוגני NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Electroencephalography סימולטני, מדידה בזמן אמת של הריכוז לקטט ומניפולצית Optogenetic של פעילות עצבית בקליפת המוח המכרסמת

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

הדמיה תפקודית של השמיעתי Cortex בחתולים בוגרים באמצעות גבוהה שדה fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...