Name: live imaging of primary cerebral cortex cells using a 2d culture system
Uploaded: 2017-08-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System at JoVE.com

इस कार्य द्वारा CNPq (Conselho Nacional डे Desenvolvimento Científico e Tecnológico), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível सुपीरियर) समर्थित किया गया था और FAPERN (Fundação de Amparo एक Pesquisa Rio Grande do Norte करते हैं)।

All experiments involving live animals described in this protocol are conducted according to the National and International laws and were approved by the local University Animal Care and Use Committee (CEUA/UFRN), under the license 009/2014. The following protocol is performed in a sterile environment. Familiarity with basic cell culture is expected.
1. Dorsolateral Telencephalon Microdissection
<ol>
	<li>Prepare the dissection medium (100 mL): 98.5 mL Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS...

प्राथमिक मस्तिष्क प्रांतस्था की कोशिकाओं के वास्तविक समय निरीक्षण कक्ष के प्रसार का विश्लेषण, कोशिका विभाजन, कोशिका चक्र की लंबाई, कोशिका अवकलन और सेल अस्तित्व3,14,15<s...

तंत्रिका स्टेम सेल (NSC) न्यूरॉन्स और macroglial कोशिकाओं प्रमस्तिष्क प्रांतस्था विकास के दौरान उत्पन्न करते हैं। जल्दी-corticogenesis, एनएससी सममित कोशिका विभाजन के कई दौर से गुजरना, और जनक पूल का विस्तार करें। उसके बाद, एनएससी य़ही न्यूरॉन्स मध्यवर्तियों1के माध्यम से सीधे या परोक्ष रूप से उत्पन्न करने के लिए विभाजित करें। पर केवल मध्य - करने के लिए देर से-corticogenesis, progenitors astrocytes oligodendrocytes2,3,और4जनरेट करने के लिए स्विच। हालांकि, तीव्र बहस4,5,6की बात पूरा तंत्र है कि सेल के प्रसार और भेदभाव, के रूप में अच्छी तरह से अद्वितीय प्रकार की macroglial कोशिकाओं या न्यूरॉन्स के उत्पादन के लिए भाग्य-प्रतिबंधित progenitors का योगदान नियंत्रण के रूप में रहते हैं। न्यूरॉन्स, astrocytes और oligodendrocytes उत्पन्न करने की क्षमता अलग-अलग cortical एनएससी की बड़े पैमाने पर अध्ययन किया इन विट्रो में और vivo में तकनीक के असंख्य रूप में इस तरह का प्रयोग किया गया है: एकल-कक्ष संस्कृतियों7,8,9,10,11,12,13; इमेजिंग लाइव उच्च घनत्व संस्कृतियों संस्कृतियों3,14,15में इमेजिंग रहते हैं; टुकड़ा संस्कृतियों16,17,18में इमेजिंग रहते हैं; क्लोनल वायरल वेक्टर-मध्यस्थता आनुवंशिक उच्च घनत्व संस्कृतियों14,15,19,20,21में लेबल का उपयोग कर विश्लेषण; क्लोनल विश्लेषण में vivo retrovirus22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33का उपयोग; और ट्रांसजेनिक जानवर34क्लोनल विश्लेषण में vivo का उपयोग।
प्रत्येक इन तकनीकों के पेशेवरों और विचार प्रस्तुत करता है। उदाहरण के लिए, इन विवो वंश अनुरेखण व्यक्तिगत cortical progenitors क्षमता के बारे में परस्पर विरोधी निष्कर्ष करने के लिए अग्रणी लादू बंटवारे त्रुटियों और3, के लिए संवेदनशील है। इसके अलावा, दोनों इन विट्रो में और vivo में अध्ययन के जनक कोशिकाओं प्रारंभिक समय-बिंदुओं पर लेबलिंग पर आधारित और सेल प्रजातियों के पीछे विश्लेषण नहीं चल पाता की घटना वंश-प्रगति35दौरान कोशिका मृत्यु के द्वारा प्रभावित किया जा सकता। इसलिए, एकल एनएससी की क्षमता का विश्लेषण करने के लिए एक उपयुक्त प्रणाली उत्पन्न सभी कोशिकाओं की पहचान, और साथ ही उपयुक्त लक्षण वर्णन सेल भाग्य वंश के भीतर की अनुमति देनी होगी। प्राथमिक सेल संस्कृति और लाइव इमेजिंग के संयोजन इस सेटिंग प्रदान करता है। का उपयोग कर एकल-कक्ष संस्कृति और समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी, मंदिर एट अल. दिखाया है स्विच gliogenesis11करने के लिए अलग-अलग मस्तिष्क प्रांतस्था progenitors न्यूरोजेनेसिस से की वंशावली में। बाद में, वे एक ही सिस्टम कि न्यूरॉन्स के विभिन्न प्रकार एक एकल cortical जनक12से उत्पन्न कर रहे हैं दिखाने के लिए इस्तेमाल किया। हालांकि, इस प्रणाली प्रस्तुत करता है एक महत्वपूर्ण चेतावनी: केवल 4 या अधिक संतान9के क्लोन cortical progenitors जल्दी corticogenesis में अलग से 1% उत्पन्न। के अलावा FGF2 के बाद, करने के लिए 8-10%9जनरेट कर रहा है 4 या अधिक कोशिकाओं की कोशिकाओं की आवृत्ति बढ़ जाती है। फिर भी, इस संख्या पर विचार कर कि इस स्तर पर लगभग सभी cortical progenitors proliferative हैं बहुत छोटा है। इसके अलावा, FGF2 के संभावित प्रभाव भाग्य-विनिर्देशन पर36से इंकार नहीं किया सकता। इन सीमाओं को दरकिनार करने के लिए, हम उच्च घनत्व सेल संस्कृतियों के प्रसार के दोनों निलय (Pax6-व्यक्त) का समर्थन करते थे और subventricular (Tbr2-व्यक्त) cortical progenitors15। इसके अलावा, इन संस्कृतियों के वास्तविक समय निरीक्षण NSC वंश प्रगति की कई विशेषताएं इन शर्तों, जैसे कोशिका विभाजन, कोशिका चक्र की लंबी, न्यूरॉन्स, और glia, दूसरों के बीच उत्पन्न करने के लिए एकल कोशिकाओं की क्षमता के मोड के तहत3,15reproduced हैं कि दिखाया गया है। हाल ही में, हम भी CREB-संकेतन चूहों37में अपरिपक्व मस्तिष्क प्रांतस्था न्यूरॉन्स की सेल के अस्तित्व को प्रभावित करता है कि को दिखाने के लिए इस प्रणाली इस्तेमाल किया है। इस प्रकार, हमें विश्वास है कि उस समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी प्राथमिक murine प्रमस्तिष्क प्रांतस्था की कोशिकाओं में उच्च घनत्व वृद्धि हुई कोशिका चक्र प्रगति के सेलुलर और आणविक तंत्र, कोशिका विभाजन, अस्तित्व के कक्ष और कक्ष भाग्य विनिर्देशन के मोड का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली और सुलभ उपकरण है। बाद ट्रांसजेनिक जानवरों, वास्तविक समय38,39,40 पर विशिष्ट कक्ष भाग्य की पहचान या immunocytochemistry3,38,41,42बाद इमेजिंग का उपयोग की अनुमति का उपयोग कर पूरा किया जा सकता।
यहाँ, हम एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल का समर्थन एनएससी के प्रसार और बाद की पीढ़ी न्यूरॉन्स और macroglial कोशिकाओं के प्राथमिक मस्तिष्क प्रांतस्था सेल संस्कृति तैयार करने के लिए प्रदान करते हैं। हम भी अलग-अलग कोशिकाओं है, जो की पहचान की जा सकता है और समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर एकल-कक्ष स्तर पर ट्रैक की जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए अभिकर्मक retroviral मध्यस्थता के उपयोग पर चर्चा की। इस प्रोटोकॉल कृन्तकों में corticogenesis के अंत तक शुरू से पृथक प्राथमिक मस्तिष्क प्रांतस्था की कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन कुछ समायोजन के अनुसार चरण14आवश्यक हो सकता है। एनएससी अन्य स्रोतों से पृथक भी समय चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी 2D संस्कृतियों के उपयोग का अध्ययन किया जा कर सकते हैं, लेकिन उचित culturing व्यवस्था सेल व्यवहार इन विट्रो में और vivo में38,43की तुलना द्वारा निर्धारित की जानी चाहिए।

<table width="953">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td style="width:344px;">14175129</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>12400-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:344px;">16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Goat serum</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">69023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">VWR International Ltd.</td>
			<td style="width:344px;">306324N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>792632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-MAP2, mouse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-GFP chicken</td>
			<td>Aves</td>
			<td>0511FP12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat anti-mouse alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat anti-chicken alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">ImageJ</td>
			<td style="width:123px;">NIH</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">tTt</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell observer microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pasteur pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">The Tracking Tool (tTt) software</td>
			<td></td>
			<td>https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html</td>
			<td>download link</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of primary cerebral cortex cells using a 2d culture system

प्रमस्तिष्क प्रांतस्था विकास के दौरान, कई दौर नया progenitors या postmitotic न्यूरॉन्स जनरेट करने के लिए सममित और असममित कोशिका विभाजन के जनक कोशिकाओं से गुजरना। बाद में, कुछ progenitors gliogenic भाग्य के लिए, स्विच करने के लिए astrocyte और oligodendrocyte आबादी को जोड़ने। समय चूक वीडियो-माइक्रोस्कोपी प्राथमिक मस्तिष्क प्रांतस्था सेल संस्कृतियों के प्रयोग, यह नियंत्रित कोशिका विभाजन के मोड और जनक कोशिकाओं के कोशिका चक्र पैरामीटर सेलुलर और आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए संभव है। इसी तरह, भाग्य postmitotic कक्षों का कक्ष-विशिष्ट फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन का उपयोग कर या immunocytochemistry बाद इमेजिंग examined कर सकते हैं। इससे भी महत्वपूर्ण बात, इन सभी सुविधाओं progenitors विशिष्ट कोशिका प्रकार की पीढ़ी के लिए प्रतिबद्ध की पहचान की अनुमति एकल-कक्ष स्तर पर विश्लेषण किया जा सकता। जीन अभिव्यक्ति का हेरफेर भी वायरल-मध्यस्थता अभिकर्मक, सेल-स्वायत्त और गैर-सेल-स्वायत्त घटना के अध्ययन की अनुमति का उपयोग किया जा सकता है। अंत में, संलयन फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग चयनित प्रोटीन के सममित और असममित वितरण के दौरान डिवीजन और बेटी कोशिकाओं के भाग्य के साथ संबंध के अध्ययन की अनुमति देता है। यहाँ, हम murine प्राथमिक मस्तिष्क प्रांतस्था की कोशिकाओं के लिए कई दिनों तक छवि और कोशिका विभाजन, कोशिका चक्र की लंबाई और नव सृजित कोशिकाओं के भाग्य की विधा का विश्लेषण करने के लिए समय चूक वीडियो-माइक्रोस्कोपी विधि का वर्णन। हम भी transfect जनक कोशिकाओं है, जो ब्याज के जीनों में हेरफेर या सिर्फ रिपोर्टर प्रोटीन वाले कक्ष लेबल के लिए लागू किया जा सकता करने के लिए एक आसान विधि का वर्णन।

Primary cultures of cerebral cortex cells isolated from embryos E14 contain both progenitor and neuronal cells. During the period of imaging, progenitors undergo several rounds of cell division, increasing the number of cells (Figure 5 and Video Figure 1).
Retroviral-mediated transfection of a few progenitor cells facilitates the identification of cell clones (F...

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Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

लाइव इमेजिंग वास्तविक समय में सेलुलर व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यहाँ, हम समय चूक वीडियो-प्राथमिक तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं से वंश प्रगति विभेदित न्यूरॉन्स, और glia दौरान अधिनियमित चरणों का एक विस्तृत परीक्षा की अनुमति देता है माइक्रोस्कोपी प्राथमिक मस्तिष्क प्रांतस्था की कोशिकाओं के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन।

इमेजिंग एक 2D संस्कृति प्रणाली का उपयोग कर प्राथमिक मस्तिष्क प्रांतस्था की कोशिकाओं के रहते

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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