Name: live imaging of primary cerebral cortex cells using a 2d culture system
Uploaded: 2017-08-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento e Científico Tecnológico), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) e FAPERN (Fundação de Amparo un Pesquisa do Rio Grande do Norte).

All experiments involving live animals described in this protocol are conducted according to the National and International laws and were approved by the local University Animal Care and Use Committee (CEUA/UFRN), under the license 009/2014. The following protocol is performed in a sterile environment. Familiarity with basic cell culture is expected.
1. Dorsolateral Telencephalon Microdissection
<ol>
	<li>Prepare the dissection medium (100 mL): 98.5 mL Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS...

Osservazione in tempo reale delle cellule della corteccia cerebrale primaria permette l'analisi di proliferazione delle cellule, la modalità di divisione cellulare, durata del ciclo cellulare, differenziazione cellulare e cella sopravvivenza3,14,15,37. Ancora più importante, consente lo studio dei lignaggi unicellulare, consentendo l'identificazione delle fasi intermedie promulgata durante la...

Cellule staminali neurali (NSC) generare neuroni e cellule macroglial durante lo sviluppo della corteccia cerebrale. Al primi-corticogenesis, NSC sottoporsi a diversi cicli di divisione cellulare simmetrica ed espandere il pool di cellule progenitrici. Quindi, NSC dividono asimmetricamente per generare neuroni direttamente o indirettamente attraverso mediatori1. Solo a metà - alla fine-corticogenesis, progenitori passare per generare gli astrociti e oligodendrociti2,3,4. Tuttavia, i completare i meccanismi che controllano la proliferazione delle cellule e differenziazione, come pure il contributo dei progenitori destino-limitato alla generazione di tipi unici di neuroni o cellule macroglial rimangono una questione di intenso dibattito4,5,6. Il potenziale delle singole CSN corticale per generare neuroni, astrociti e oligodendrociti è stato estesamente studiato in vitro e in vivo utilizzando una miriade di tecniche come: live imaging in cella singola culture7,8,9,10,11,12,13; live imaging ad alta densità culture culture3,14,15; live imaging fetta culture16,17,18; analisi clonale utilizzando virale mediata da vettore genetico etichettatura ad alta densità culture14,15,19,20,21; analisi clonale in vivo utilizzando retrovirus22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; e analisi clonale in vivo usando animali transgenici34.
Ognuna di queste tecniche presenta vantaggi e svantaggi. Per esempio, in vivo lignaggio traccia è suscettibile al lumping e scissione errori3, che porti a conclusioni contrastanti circa il potenziale dei singoli progenitori corticali. Inoltre, sia gli studi in vitro ed in vivo basano sull'etichettatura delle cellule progenitrici a intervalli di tempo iniziale e posteriore analisi delle stirpi delle cellule possono essere influenzata dall'avvenimento inosservato di morte delle cellule durante il lignaggio-progressione35. Di conseguenza, un sistema adatto per analizzare le potenzialità del singolo NSCs dovrà consentire l'identificazione di tutte le cellule generate, così come la caratterizzazione appropriata dei destini di cella all'interno della stirpe. Combinazione di colture cellulari primarie e live imaging fornisce questa impostazione. Utilizzando cella singola cultura e time-lapse video microscopia, Tempio et al hanno dimostrato l'interruttore del lignaggio della corteccia cerebrale individuale progenitori da neurogenesi al gliogenesis11. Più tardi, hanno usato lo stesso sistema per mostrare che i diversi tipi di neuroni sono generati da un unico progenitore corticale12. Tuttavia, questo sistema presenta un importante avvertimento: solo 1% dei progenitori corticali isolati alle prime corticogenesis generare cloni di 4 o più progenie9. Dopo l'aggiunta di FGF2, la frequenza delle cellule generando 4 o più celle aumenta a 8-10%9. Tuttavia, questo numero è troppo piccolo considerando che praticamente tutti i progenitori corticali sono proliferativi in questa fase. Inoltre, i potenziali effetti di FGF2 il destino-specifica non possono essere esclusa36. Per ovviare a queste limitazioni, abbiamo usato colture ad alta densità cellulari che supportano la proliferazione di entrambi ventricolare (Pax6-esprimendo) e subventricolare (Tbr2-esprimendo) corticale progenitori15. L'osservazione in tempo reale di queste culture ha inoltre dimostrato che diverse caratteristiche della progressione del lignaggio di NSC sono riprodotte in queste condizioni, come la modalità di divisione cellulare, allungamento del ciclo cellulare, il potenziale delle singole cellule per generare neuroni e cellule gliali, tra gli altri3,15. Più recentemente, abbiamo utilizzato questo sistema anche a dimostrare che CREB-segnalazione colpisce la sopravvivenza delle cellule dei neuroni immaturi corteccia cerebrale in topi37. Così, crediamo che Time-lapse video-microscopia della corteccia cerebrale murino primario le cellule coltivate in ad alta densità è uno strumento potente e accessibile per studiare i meccanismi cellulari e molecolari della progressione del ciclo cellulare, la modalità di divisione cellulare, la sopravvivenza delle cellule e cellula destino specifica. Quest'ultima può essere eseguita utilizzando animali transgenici, permettendo l'identificazione di destini cellulari specifiche tempo reale38,39,40 o l'uso di post-imaging immunocytochemistry3,38,41,42.
Qui, forniamo un protocollo passo dopo passo per preparare la corteccia cerebrale primaria coltura cellulare supporto proliferazione delle CSN e la successiva generazione dei neuroni e delle cellule macroglial. Inoltre discutiamo l'uso di transfezione mediata retrovirale per manipolare l'espressione genica delle cellule individuali, che possono essere identificati e monitorata a livello di singola cellula usando la microscopia video time-lapse. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare la corteccia cerebrale primario cellule isolate dall'inizio alla fine del corticogenesis nei roditori, ma qualche aggiustamento può essere richiesto secondo la fase14. NSC isolate da altre fonti può essere studiata anche usando la microscopia video time-lapse di culture 2D, ma il sistema di coltura appropriato dovrebbe essere determinato comparando i comportamenti delle cellule in vitro e in vivo38,43.

<table width="953">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td style="width:344px;">14175129</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>12400-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:344px;">16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Goat serum</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">69023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">VWR International Ltd.</td>
			<td style="width:344px;">306324N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>792632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-MAP2, mouse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-GFP chicken</td>
			<td>Aves</td>
			<td>0511FP12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat anti-mouse alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat anti-chicken alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">ImageJ</td>
			<td style="width:123px;">NIH</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">tTt</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell observer microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pasteur pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">The Tracking Tool (tTt) software</td>
			<td></td>
			<td>https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html</td>
			<td>download link</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of primary cerebral cortex cells using a 2d culture system

Durante lo sviluppo della corteccia cerebrale, cellule progenitrici sottoporsi a diversi cicli di divisioni cellulari simmetriche e asimmetriche per generare nuovi progenitori o neuroni postmitotic. Più tardi, alcuni progenitori passare ad un destino di gliogenic, aggiungendo alle popolazioni astrociti e oligodendrociti. Utilizzo di time-lapse video-microscopia di colture di cellule della corteccia cerebrale primario, è possibile studiare i meccanismi cellulari e molecolari che controllano la modalità di divisione cellulare e i parametri del ciclo cellulare delle cellule progenitrici. Allo stesso modo, il destino delle cellule postmitotic può essere esaminato utilizzando proteine reporter fluorescenti cellula-specifico o post-imaging immunocitochimica. Ancora più importante, tutte queste caratteristiche possono essere analizzate a livello di singola cellula, permettendo l'identificazione di progenitori impegnati per la generazione di tipi cellulari specifici. Manipolazione dell'espressione genica può essere eseguita anche mediante transfezione mediata virale, permettendo lo studio dei fenomeni di cella-autonomi e non autonomi delle cellule. Infine, l'utilizzo di proteine fluorescenti di fusione permette lo studio della distribuzione simmetrica e asimmetrica delle proteine selezionate durante la divisione e la correlazione con il destino di cellule figlie. Qui, descriviamo il metodo time-lapse video-microscopia per immagine cellule murine di corteccia cerebrale primaria per diversi giorni e analizzare la modalità di divisione cellulare, durata del ciclo cellulare e destino delle cellule appena generate. Inoltre descriviamo un metodo semplice per transfect cellule progenitrici, che possono essere applicate a manipolare i geni di interesse o semplicemente marcare le cellule con proteine reporter.

Primary cultures of cerebral cortex cells isolated from embryos E14 contain both progenitor and neuronal cells. During the period of imaging, progenitors undergo several rounds of cell division, increasing the number of cells (Figure 5 and Video Figure 1).
Retroviral-mediated transfection of a few progenitor cells facilitates the identification of cell clones (F...

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Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

La formazione immagine dal vivo è un potente strumento per studiare i comportamenti cellulari in tempo reale. Qui, descriviamo un protocollo per time-lapse video-microscopia delle cellule della corteccia cerebrale primario che consente un esame dettagliato delle fasi promulgata durante la progressione di lignaggio da cellule staminali neurali primarie a differenziato neuroni e cellule gliali.

Immagini di corteccia cerebrale primario celle utilizzando un sistema 2D cultura dal vivo

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

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