Name: live imaging of primary cerebral cortex cells using a 2d culture system
Uploaded: 2017-08-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System at JoVE.com

この作業は、研究集会 (Conselho ナシオナル ・ デ ・ Desenvolvimento Científico e Tecnológico)、岬 (中・ デ ・ Aperfeiçoamento ・ デ ・ Pessoal ・ デ ・ Nível スーペリアー) によって支えられたおよび FAPERN (カルースト ・ デ ・ アンパロ Pesquisa はリオ ・ グランデは、ノルテを行う)。

All experiments involving live animals described in this protocol are conducted according to the National and International laws and were approved by the local University Animal Care and Use Committee (CEUA/UFRN), under the license 009/2014. The following protocol is performed in a sterile environment. Familiarity with basic cell culture is expected.
1. Dorsolateral Telencephalon Microdissection
<ol>
	<li>Prepare the dissection medium (100 mL): 98.5 mL Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS...

主要な大脳皮質細胞のリアルタイム観察では、細胞増殖の解析、細胞分裂、細胞周期、細胞分化、細胞生存3,14,15,37のモードをことができます。もっと重大に、それは NSCs からニューロン3への進行の間に制定された中間相の同定につながる単一細胞系統の研究を許可します。最?...

神経幹細胞 (NSC) は、大脳皮質の開発中にニューロンと macroglial 細胞を生成します。初期-内因、NSCs 対称の細胞分裂のいくつかのラウンドを受けるし、前駆プールを展開します。その後、NSCs は中間1を介して直接または間接的にニューロンを生成する非対称的に分割します。だけで半ば-に後半-内因、前駆細胞のアストロ サイト、オリゴデンドロ サイトの2,3、4を生成するスイッチします。しかし、ユニークな種類のニューロンや macroglial 細胞の世代に運命制限前駆細胞の寄与と同様、細胞の増殖と分化を制御する完全なメカニズムは、激しい議論4,5,6の問題を続けます。神経細胞、アストロ サイト、オリゴデンドロ サイトを生成する個々 の皮質 NSCs の可能性は広範囲に研究生体外および生体内で無数の技術を使用して、されている: 単一細胞培養7,8,9,10、11,12,13; イメージング ライブライブ イメージングの高密度文化文化3,14,15;ライブ イメージング スライス文化16,17,18;ウイルス媒介性遺伝的ラベリング処理による高密度培養14,15,19,20,21; のクローン解析クローン解析体内レトロ ウイルス22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; を使用してそして体内のクローン解析トランスジェニック動物の34を使用しています。
これらのテクニックは、長所と短所がそれぞれ。たとえば、トレースする血統体内一括と分割エラー3、個々 の大脳皮質前駆細胞の潜在性について矛盾する結論に至る。また、両方in vitroとin vivoの研究が早い時点で前駆細胞の分類に基づいて、35系統進行中に細胞死の検出されない発生による細胞系譜の事後分析を受けます。したがって、単一 NSCs の可能性の分析に適したシステムは生成されると、すべての細胞の同定だけでなく、系統内での細胞運命の適切な特性を考慮しなければなりません。一次電池文化とライブ イメージングの組み合わせでは、この設定を提供します。単一細胞培養とタイムラプス ビデオ顕微鏡を用いた、寺らは gliogenesis11神経新生から個々 の大脳皮質前駆細胞の血統のスイッチを示しています。後で、彼らはニューロンの異なったタイプが12の単一の大脳皮質前駆細胞から生成されることを示す同じシステムを使用しました。しかし、このシステムには重要な注意事項: 初期内因で分離された大脳皮質前駆細胞の 1% は 4 つ以上の子孫9のクローンを生成するだけです。FGF2 の付加の後で 4 つ以上のセルを生成する細胞の頻度は 8-109に増加します。それにもかかわらず、この数はこの段階で、ほとんどすべての大脳皮質前駆細胞が増殖を考慮した小さすぎます。また、36運命仕様に FGF2 の潜在的な影響は否定できません。(Pax6 を発現) 心室の両方の増殖をサポートする高密度細胞培養を用いてこれらの制限を回避するために、脳室下帯 (Tbr2 表現) 大脳皮質前駆細胞15。また、これらの文化のリアルタイム観察は NSC 系統進行のいくつかの機能、3、15細胞分裂、細胞周期の延長、ニューロンとグリアなどを生成する単一細胞の潜在性のモードなど、これらの条件下で再現を示しています。最近では、我々 も CREB シグナルがマウス37で未熟な大脳皮質ニューロンの細胞の生存に影響を与えることをこのシステムを使用しています。したがって、プライマリ マウス大脳皮質のタイムラプス ビデオ顕微鏡を考えて高密度成長のセルは細胞周期の進行のメカニズムを解明、細胞分裂、細胞生存率、細胞運命の指定のモードを研究する強力かつアクセス可能なツール。後者ができますリアルタイム38,39,40の特定細胞運命の識別またはポスト各種3,38,41,42をイメージングの使用許可、トランスジェニック動物を使用しています。
ここでは、NSCs の増殖とニューロンと macroglial 細胞の次の世代を支える主要な大脳皮質細胞培養を準備する手順を追ってプロトコルを提供します。識別およびコマ撮りビデオ顕微鏡を用いた単一細胞レベルで追跡することができます個々 の細胞の遺伝子を操作する遺伝子をレトロ ウイルス媒介の使用についても述べる。齧歯類、内因の端に最初から主要な大脳皮質細胞の研究にこのプロトコルを使用することができますが、ステージ14によるといくつかの調整が必要があります。二次元文化のタイムラプス ビデオ顕微鏡を用いた、NSCs 他のソースから分離を検討ことができますが、適切な培養システムは細胞挙動の in vitroとin vivo38,43を比較することによって決定する必要があります。

<table width="953">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td style="width:344px;">14175129</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>12400-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:344px;">16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Goat serum</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">69023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">VWR International Ltd.</td>
			<td style="width:344px;">306324N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>792632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-MAP2, mouse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-GFP chicken</td>
			<td>Aves</td>
			<td>0511FP12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat anti-mouse alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat anti-chicken alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">ImageJ</td>
			<td style="width:123px;">NIH</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">tTt</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell observer microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pasteur pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">The Tracking Tool (tTt) software</td>
			<td></td>
			<td>https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html</td>
			<td>download link</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of primary cerebral cortex cells using a 2d culture system

大脳皮質の開発中には、前駆細胞は新しい前駆細胞または後の神経細胞を生成する対称および非対称細胞分裂のいくつかのラウンドを受けます。その後、いくつかの前駆細胞は、アストロ サイト、オリゴデンドロ サイトの人口への追加幹運命に切り替えます。主要な大脳皮質細胞培養のタイムラプス ビデオ顕微鏡を使用すると、細胞分裂のモードと前駆細胞の細胞周期のパラメーターを制御する細胞・分子メカニズムを研究することが可能です。同様に、セル固有蛍光レポーター蛋白質を使用してまたは後免疫細胞化学をイメージング、後細胞の運命は調べることができます。もっと重要なは、これらすべての機能は、特定のセル型を生成することを約束の前駆細胞の同定を許可する単一細胞レベルで分析できます。また細胞自律的・細胞自律的現象の研究を許可するウイルスを介する遺伝子導入を用いた遺伝子発現の操作を実行できます。最後に、蛍光の融合蛋白質を使用区分と娘細胞運命との対比の中に選択した蛋白質の対称および非対称分布に関する研究。ここでは、数日に及ぶ主要な大脳皮質マウス細胞を画像、細胞分裂、細胞周期の長さと新しく生成された細胞の運命のモードを分析してタイムラプス ビデオ顕微鏡法について述べる.興味のある遺伝子を操作する、または単にレポーター蛋白質と細胞をラベルに適用できる前駆細胞を使って簡単な方法について述べる。

Primary cultures of cerebral cortex cells isolated from embryos E14 contain both progenitor and neuronal cells. During the period of imaging, progenitors undergo several rounds of cell division, increasing the number of cells (Figure 5 and Video Figure 1).
Retroviral-mediated transfection of a few progenitor cells facilitates the identification of cell clones (F...

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Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

ライブ画像は、リアルタイムで携帯電話の行動を研究するための強力なツールです。ここでは、タイムラプス ビデオ-顕微鏡検査のため主要な大脳皮質細胞の主な神経幹細胞から分化したニューロンとグリア系統進行中に成立段階の詳細な検査を可能にするプロトコルについて述べる。

2次元培養系を用いた主な大脳皮質細胞のイメージングをライブします。

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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