Name: live imaging of primary cerebral cortex cells using a 2d culture system
Uploaded: 2017-08-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), KAPPER (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) og FAPERN (Fundação de Amparo en Pesquisa do Rio Grande do Norte).

All experiments involving live animals described in this protocol are conducted according to the National and International laws and were approved by the local University Animal Care and Use Committee (CEUA/UFRN), under the license 009/2014. The following protocol is performed in a sterile environment. Familiarity with basic cell culture is expected.
1. Dorsolateral Telencephalon Microdissection
<ol>
	<li>Prepare the dissection medium (100 mL): 98.5 mL Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS...

Sanntid observasjon av primære hjernebarken celler kan analyse av celle spredning, celledeling, celle syklus lengde, celledifferensiering og celle, overlevelse,3,,14,,15,,37. Enda viktigere, tillater det studiet av encellede linjene, fører til identifisering av de mellomliggende fasene vedtatt under progresjon fra NSCs til neurons3. Endelig, kombinasjonen av denne kult...

Nevrale stamceller (NSC) genererer neurons og macroglial celler under hjernebarken utvikling. Ved tidlig-corticogenesis, NSCs gjennomgå flere runder med symmetrisk celledeling og utvide stamfar bassenget. Deretter dele NSCs asymmetrisk for å generere neurons direkte eller indirekte gjennom mellomprodukter1. Bare på bytte midt - å sen-corticogenesis, progenitors for å generere astrocyttene og oligodendrocytes2,3,4. Komplett mekanismer som kontrollerer celle spredning og differensiering, i tillegg til bidrag av skjebnen-begrenset progenitors til generering av unike typer nerveceller eller macroglial celler beholdes imidlertid løpet av intens debatt4,5,6. Potensialet i individuelle kortikale NSCs å generere neurons, astrocyttene og oligodendrocytes har vært grundig studert i vitro og i vivo bruker en rekke teknikker som: live bildebehandling i én celle kulturer7,8,9,10,11,12,13; Live bildebehandling i høy tetthet kulturer kulturer3,14,15; Live bildebehandling skive kulturer16,17,18; klonal analyse ved hjelp av viral vektor-mediert genetisk merking i høy tetthet kulturer14,15,19,20,21; klonal analyse i vivo med retrovirus22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; og klonal analyse i vivo bruker transgene dyr34.
Hver av disse teknikkene presenterer fordeler og ulemper. For eksempel er i vivo avstamning sporing utsatt til lumping og splitting feil3, fører til motstridende konklusjoner om potensialet som individuelle kortikale progenitors. Dessuten, både i vitro og i vivo studier basert på merkingen av progenitor celler på tidlig tidspunkt og bakre analyse av cellen linjene kan påvirkes av uoppdaget forekomsten av celledød under avstamning-progresjon35. Derfor må et egnet system å analysere potensial til enkelt NSCs tillate identifikasjon av alle celler generert og riktig karakterisering av cellen skjebne i linjen. Kombinasjonen av primære cellekultur og live bildebehandling gir denne innstillingen. Bruke én celle kultur og time-lapse video mikroskopi, har Temple et al. vist bryteren i linjen av personlige hjernebarken progenitors fra neurogenesis gliogenesis11. Senere, brukte de samme system for å vise at ulike typer nerveceller er generert fra en enkelt kortikale stamfar12. Men dette systemet presenterer en viktig påminnelse: bare 1% av kortikale progenitors isolert på tidlig corticogenesis generere kloner av 4 eller flere avkom9. Etter at FGF2 øker frekvensen av celler genererer 4 eller flere celler til 8-10%9. Likevel, dette tallet er for liten tanke at nesten alle kortikale progenitors proliferativ på dette stadiet. Videre kan ikke potensielle effekten av FGF2 på skjebne-spesifikasjonen bli utelukkes36. For å omgå disse begrensningene, vi brukte høy tetthet cellekulturer som støtter spredning av begge ventrikkel (Pax6-uttrykke) og subventricular (Tbr2-uttrykke) kortikale progenitors15. Dessuten har sanntid observasjon av disse kulturene vist at flere funksjoner i NSC avstamning progresjon gjengis under disse forholdene, for eksempel modus for celledeling, lengthening av cellen syklus, potensialet i enkeltceller generere neurons og glia, blant annet3,15. Flere nylig, har vi også brukt dette systemet vise at CREB-signalisering påvirker celle overlevelse av umodne hjernebarken nerveceller i mus37. Derfor vi tror at time-lapse video-mikroskopi av primære murine hjernebarken celler dyrket i høy tetthet er et kraftig og lett tilgjengelig verktøy å studere cellulære og molekylære mekanismer av cellen syklus progresjon, celledeling, celle overlevelse og celle skjebne spesifikasjonen. Sistnevnte kan oppnås ved hjelp av transgene dyr, slik at identifikasjon av bestemt celle skjebne på sanntid38,39,40 eller bruk av stolpe-tenkelig immunocytochemistry3,38,41,42.
Her gir vi en trinnvis protokoll for å forberede primære hjernebarken cellekultur støtter spredning av NSCs og den etterfølgende generasjonen av nevroner og macroglial celler. Vi diskuterer også bruk av retroviral-mediert transfection å manipulere genuttrykk individuelle celler, som kan identifiseres og spores på encellede nivået med time-lapse video mikroskopi. Denne protokollen kan brukes til å studere primære hjernebarken celler isolert fra begynnelsen til slutten av corticogenesis i gnagere, men noen justeringer kan være nødvendig i henhold til det stadiet14. NSCs isolert fra andre kilder kan også studeres med time-lapse video mikroskopi 2D kulturer, men det aktuelle culturing systemet skal bestemmes ved å sammenligne celle atferd i vitro og vivo38,43.

<table width="953">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td style="width:344px;">14175129</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>12400-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:344px;">16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Goat serum</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">69023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">VWR International Ltd.</td>
			<td style="width:344px;">306324N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>792632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-MAP2, mouse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-GFP chicken</td>
			<td>Aves</td>
			<td>0511FP12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat anti-mouse alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat anti-chicken alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">ImageJ</td>
			<td style="width:123px;">NIH</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">tTt</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell observer microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pasteur pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">The Tracking Tool (tTt) software</td>
			<td></td>
			<td>https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html</td>
			<td>download link</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of primary cerebral cortex cells using a 2d culture system

Under hjernebarken utvikling gjennomgå stamfar celler flere runder med symmetriske og asymmetriske celledelinger generere nye progenitors eller postmitotic neurons. Senere, bytte noen progenitors til en gliogenic skjebne, legge til astrocytter og oligodendrocyte bestander. Bruke time-lapse video-mikroskopi av primære hjernebarken cellekulturer, er det mulig å studere de cellulære og molekylære mekanismene som styrer modus celledeling og celle syklus parametere for stamfar celler. Tilsvarende kan skjebnen til postmitotic celler undersøkes med celle-spesifikke fluorescerende reporter proteiner eller stolpe-tenkelig immunocytochemistry. Enda viktigere, kan alle disse funksjonene analyseres på encellede nivå, slik at identifikasjon av progenitors forpliktet til generering av spesifikke celletyper. Manipulering av genuttrykk kan også utføres med viral-mediert transfection, slik at studiet av cellen autonome og ikke-celle-autonome fenomener. Endelig, bruk av fusion fluorescerende proteiner lar studiet av symmetriske og asymmetriske distribusjon av valgte proteiner under divisjon og sammenhengen med datter celler skjebne. Her beskriver vi time-lapse video-mikroskopi metoden å image primære hjernebarken murine celler for opp til flere dager og analysere celledeling, celle syklus lengde og skjebnen til nyopprettede celler. Vi har også beskriver en enkel metode for å transfect stamfar celler, som kan brukes å manipulere gener rundt eller bare merke celler med reporter proteiner.

Primary cultures of cerebral cortex cells isolated from embryos E14 contain both progenitor and neuronal cells. During the period of imaging, progenitors undergo several rounds of cell division, increasing the number of cells (Figure 5 and Video Figure 1).
Retroviral-mediated transfection of a few progenitor cells facilitates the identification of cell clones (F...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System at JoVE.com

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Live bildebehandling er et kraftig verktøy for å studere mobilnettet atferd i sanntid. Her beskriver vi en protokoll for time-lapse video-mikroskopi primære hjernebarken celler som gir en detaljert undersøkelse av fasene vedtatt under avstamning progresjon fra primære nevrale stamceller differensiert nevroner og glia.

Live bildebehandling av primære hjernebarken celler ved hjelp av en 2D kultur-systemet

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral ...

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Påvisning av Microregional Hypoksi i Mus Cerebral Cortex av to-foton Imaging av endogen NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisering og genetisk manipulering av dendritter og pigger i Mus hjernebarken og hippocampus hjelp<em&gt; I fosterlivet</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Samtidig Electroencephalography, Real-time Måling av laktat Konsentrasjon og Optogenetic Manipulering av neuronal aktivitet i Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Funksjonell Imaging av auditive cortex hos voksne katter ved hjelp av høy-feltet fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Levende Imaging av Mitosis i utviklings Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live-Imaging av<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...