Name: live imaging of primary cerebral cortex cells using a 2d culture system
Uploaded: 2017-08-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) e FAPERN (Fundação de Amparo a Pesquisa do Rio Grande do Norte).

All experiments involving live animals described in this protocol are conducted according to the National and International laws and were approved by the local University Animal Care and Use Committee (CEUA/UFRN), under the license 009/2014. The following protocol is performed in a sterile environment. Familiarity with basic cell culture is expected.
1. Dorsolateral Telencephalon Microdissection
<ol>
	<li>Prepare the dissection medium (100 mL): 98.5 mL Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS...

Observação em tempo real das células do córtex cerebral primário permite a análise da proliferação celular, modo de divisão celular, comprimento do ciclo celular, diferenciação celular e célula de sobrevivência3,14,15,37. Mais importante, permite o estudo das linhagens de célula única, para a identificação das fases intermédias promulgada durante a progressão de NSCs para neu...

Células-tronco neurais (NSC) gerar neurônios e células de macroglial durante o desenvolvimento do córtex cerebral. No início-corticogenesis, NSCs passam por várias rodadas simétrica da divisão de pilha e expandir o pool de progenitor. Em seguida, NSCs dividir assimetricamente para gerar neurônios diretamente ou indiretamente através de de intermediários1. Somente no mid - ao tarde-corticogenesis, progenitores alternar para gerar astrócitos e oligodendrócitos2,3,4. No entanto, os completos mecanismos que controlam a proliferação celular e diferenciação, bem como a contribuição dos progenitores destino restrito à geração de tipos exclusivos de neurônios ou células de macroglial permanecem uma questão de debate intenso4,5,6. O potencial de NSCs corticais individuais para gerar neurônios, astrócitos e oligodendrócitos tem sido extensivamente estudados em vitro e em vivo usando uma miríade de técnicas tais como: viver de imagem em culturas de célula única7,8,9,10,11,12,13; ao vivo de imagens em alta densidade culturas culturas3,14,15; viver de imagem em fatia culturas16,17,18; clonal análise usando viral mediada por vector genético rotulagem em culturas de alta densidade14,15,19,20,21; análise clonal em vivo usando retrovírus22,23,24,25,26,,27,28,29,30,31,32,33; e análise clonal em vivo usando animais transgénicos34.
Cada uma dessas técnicas apresenta prós e contras. Por exemplo, na vivo rastreamento de linhagem é suscetível a divisão e amontoando erros3, levando a conclusões contraditórias sobre o potencial dos progenitores corticais individuais. Além disso, tanto estudos in vitro e em vivo baseiam sobre a rotulagem de células progenitoras nos pontos de tempo iniciais e posterior análise das linhagens de células pode ser influenciada pela ocorrência de morte celular durante a progressão de linhagem35sem ser detectado. Portanto, um sistema adequado para analisar o potencial de NSCs único deve permitir a identificação de todas as células geradas, bem como a caracterização adequada dos destinos de célula dentro da linhagem. Combinação de cultura de células primárias e de imagem ao vivo fornece essa configuração. Usando cultura de célula única e Time-Lapse vídeo microscopia, templo et al . demonstraram o interruptor na linhagem de progenitores individuais córtex cerebral da neurogênese gliogenesis11. Mais tarde, eles usaram o mesmo sistema para mostrar que diferentes tipos de neurônios são gerados a partir de um único progenitor cortical12. No entanto, este sistema apresenta uma ressalva importante: apenas 1% dos progenitores corticais isoladas no início corticogenesis gerar clones de 4 ou mais descendência9. Após a adição de FGF2, a frequência das células gerando 4 ou mais células aumenta para 8-10%9. No entanto, esse número é muito pequeno, Considerando que praticamente todos os progenitores corticais são proliferativas nesta fase. Além disso, os efeitos potenciais de FGF2 na especificação de destino não podem ser descartados36. Para contornar essas limitações, nós usamos a culturas de células de alta densidade que suportam a proliferação de ambos ventricular (Pax6-expressando) e progenitores cortical subventricular (Tbr2-expressando)15. Além disso, a observação em tempo real destas culturas demonstrou que várias características de progressão de linhagem NSC são reproduzidas sob estas condições, tais como modo de divisão celular, alongamento do ciclo celular, potencial de células únicas para gerar neurônios e glia, entre outros,3,15. Mais recentemente, também usamos este sistema para mostrar que a sinalização de CREB afeta a sobrevivência da pilha de neurônios imaturos córtex cerebral em ratos37. Assim, acreditamos que esse lapso de tempo vídeo-microscopia de córtex cerebral murino primário cultivados em alta densidade é uma ferramenta poderosa e acessível para estudar os mecanismos celulares e moleculares da progressão do ciclo celular, o modo de divisão celular, a sobrevivência da célula e a célula destino especificação. Este último pode ser realizado usando animais transgénicos, permitindo a identificação de destinos de célula específica em tempo real38,39,40 ou o uso de pós de imagem imunocitoquímica3,38,41,,42.
Aqui, nós fornecemos um protocolo passo a passo para preparar a cultura de células do córtex cerebral primário apoiando a proliferação de NSCs e a geração subsequente de neurônios e células macroglial. Também discutimos o uso do transfection retroviral mediada para manipular a expressão gênica de células individuais, que podem ser identificadas e controladas a nível de célula única usando microscopia vídeo lapso de tempo. Este protocolo pode ser usado para estudar as células do córtex cerebral primário isoladas desde o início até o fim do corticogenesis em roedores, mas alguns ajustes podem ser necessários de acordo com a etapa14. NSCs isoladas de outras fontes também podem ser estudadas usando microscopia de vídeo Time-Lapse de culturas 2D, mas o sistema de cultivo adequado deve ser determinado comparando célula comportamentos in vitro e in vivo38,43.

<table width="953">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td style="width:344px;">14175129</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>12400-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:344px;">16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Goat serum</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">69023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">VWR International Ltd.</td>
			<td style="width:344px;">306324N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>792632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-MAP2, mouse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-GFP chicken</td>
			<td>Aves</td>
			<td>0511FP12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat anti-mouse alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat anti-chicken alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">ImageJ</td>
			<td style="width:123px;">NIH</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">tTt</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell observer microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pasteur pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">The Tracking Tool (tTt) software</td>
			<td></td>
			<td>https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html</td>
			<td>download link</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of primary cerebral cortex cells using a 2d culture system

Durante o desenvolvimento do córtex cerebral, as células progenitoras são submetidos a várias rodadas de simétricas e assimétricas de divisões celulares para gerar novos progenitores ou neurônios postmitotic. Mais tarde, alguns progenitores alternar para um destino gliogenic, adicionando às populações astrocyte e oligodendrocyte. Usando o Time-Lapse vídeo-microscopia de culturas de células do córtex cerebral primário, é possível estudar os mecanismos celulares e moleculares, controlando o modo de divisão celular e parâmetros do ciclo celular de células progenitoras. Da mesma forma, o destino das células postmitotic pode ser examinado usando proteínas fluorescentes repórter célula específica ou pós-imagem imunocitoquímica. Mais importante ainda, todas estas características podem ser analisadas a nível de célula única, permitindo a identificação dos progenitores comprometidos com a geração de tipos de células específicas. Manipulação da expressão genética também pode ser executada usando a transfeccao mediada por viral, permitindo o estudo dos fenômenos não-celular-autónomos e célula autónomos. Finalmente, o uso de proteínas fluorescentes fusão permite o estudo da distribuição simétrica e assimétrica de proteínas selecionadas durante a divisão e a correlação com o destino de células-filhas. Aqui, descrevemos o método vídeo-microscopia de lapso de tempo para células murino córtex cerebral primário por até vários dias de imagem e analisar o modo de divisão celular, comprimento do ciclo celular e destino das células recém-gerado. Também descrevemos um método simples para transfect células progenitoras, que podem ser aplicadas a manipular os genes de interesse ou simplesmente rotular células com proteínas de repórter.

Primary cultures of cerebral cortex cells isolated from embryos E14 contain both progenitor and neuronal cells. During the period of imaging, progenitors undergo several rounds of cell division, increasing the number of cells (Figure 5 and Video Figure 1).
Retroviral-mediated transfection of a few progenitor cells facilitates the identification of cell clones (F...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System at JoVE.com

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Imagem ao vivo é uma ferramenta poderosa para estudar comportamentos celulares em tempo real. Aqui, descrevemos um protocolo para Time-Lapse vídeo-microscopia das células do córtex cerebral primário que permite uma análise detalhada das fases promulgada durante a progressão da linhagem de células-tronco neurais primárias diferenciada de neurônios e glia.

Viver a imagem das células do córtex Cerebral primário usando um sistema de cultura 2D

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

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