Name: live imaging of primary cerebral cortex cells using a 2d culture system
Uploaded: 2017-08-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System at JoVE.com

Эта работа была поддержана CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e парке), накидки (повышению де Coordenação де Pessoal де уровня Superior) и FAPERN (Фонд-де-ампаро Pesquisa ду Риу-Гранди-ду-Норти).

All experiments involving live animals described in this protocol are conducted according to the National and International laws and were approved by the local University Animal Care and Use Committee (CEUA/UFRN), under the license 009/2014. The following protocol is performed in a sterile environment. Familiarity with basic cell culture is expected.
1. Dorsolateral Telencephalon Microdissection
<ol>
	<li>Prepare the dissection medium (100 mL): 98.5 mL Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS...

Реальном времени наблюдения клеток первичной коры головного мозга позволяет анализ пролиферации клеток, режим деления клеток, длина клеточного цикла, дифференцировки клеток и клеток выживания3,14,15,37. Что еще более в?...

Нервные стволовые клетки (НСК) генерировать нейронов и macroglial клетки во время разработки коры головного мозга. В начале corticogenesis NSCs пройти несколько раундов симметричный деления клеток и расширение пула прародителя. Затем NSCs делят несимметрично сформировать нейронов, прямо или косвенно через промежуточные1. Только в середине - до конца corticogenesis, прародители переключиться генерировать астроциты и Олигодендроциты2,3,4. Однако полная механизмы, которые управляют клеточной пролиферации и дифференциации, а также вклада ограничено судьбы прародителями для генерации уникальных типов нейронов или macroglial клетки остаются считанные интенсивных дебатов4,5,6. Потенциал отдельных корковых NSCs для создания нейронов, астроциты и Олигодендроциты был широко изучены в пробирке и в естественных условиях с помощью множество методов, таких как: жить изображений в сингл клеточных культур,78,9,10,11,12,13; живут изображений в высокой плотности культур культур3,,1415; живут изображений в ломтик культур16,17,18; Клональный анализ с использованием вирусный вектор опосредованной генетических маркировки в высокой плотности культур14,15,19,,2021; Клональный анализ в естественных условиях с помощью ретровируса22,23,24,25,26,27,28,29,30,,3132,33; и Клональный анализ в естественных условиях с использованием трансгенные животные34.
Каждый из этих методов представлены плюсы и минусы. К примеру в естественных условиях трассировки линии подвержен комков и расщепления ошибки3, ведущих к противоречивые выводы о потенциале отдельных корковых прародителей. Кроме того как в пробирке и в vivo исследования на основе маркировки прогениторных клеток в начале моменты времени и задняя анализ линий клеток может зависеть от незамеченными наступления смерти клетки во время lineage прогрессии35. Таким образом приемлемую систему для анализа потенциальных возможностей одного NSCs должны позволить идентификации всех созданных клеток, а также соответствующие характеристики клеток судьбы в lineage. Сочетание культуры главной ячейки и живой изображений обеспечивает этот параметр. С помощью одной клеточной культуры и покадровой видео микроскопии, Храм et al. показали переключатель линии отдельных коре прародителей от нейрогенез глиогенез11. Позже они использовали ту же систему чтобы показать, что различные типы нейронов создаются из одного кортикального прародитель12. Однако, эта система представляет важное предостережение: только 1% кортикальной прародителей, изолированных в начале corticogenesis создавать клоны 4 или больше потомства9. После добавления FGF2 частота генерации 4 или более ячеек клеток увеличивается до 8-10%9. Тем не менее это число является слишком мала, учитывая, что практически все корковых прародителями пролиферативной на этой стадии. Кроме того нельзя исключать потенциальные последствия FGF2 на судьбу спецификации36. Чтобы обойти эти ограничения, мы использовали высокой плотности клеточных культур, которые поддерживают распространения обоих желудочков (Pax6-выражая) и субвентрикулярной корковых прародителями (Tbr2-выражая)15. Кроме того в реальном времени наблюдения этих культур показал, что некоторые особенности НСК линии прогрессии воспроизводятся в этих условиях, таких как режим деление клеток, удлинение клеточного цикла, потенциал одиночных клеток генерировать нейронов и глии, среди прочих3,15. Совсем недавно мы использовали эту систему чтобы показать, что CREB-сигнализации влияет на выживание клетки незрелые коре нейронов в мышей37. Таким образом, мы считаем, что промежуток времени видео микроскопия первичной мышиных коре клеток, выращиваемых в высокой плотности является мощным и доступным инструментом для изучения молекулярных и клеточных механизмов клеточного цикла прогрессии, режим деления клеток, выживаемость клеток и клеток судьба спецификации. Последний может осуществляться с помощью трансгенных животных, позволяя определение судьбы конкретных клеток на реальном времени38,,3940 или использование после визуализации immunocytochemistry3,38,,41-42.
Здесь мы предоставляем пошаговые протокол подготовить культуры клеток первичной коры головного мозга, поддержки распространения NSCs и последующее поколение нейронов и macroglial клеток. Мы также обсудим использование антиретровирусной опосредованной трансфекции манипулировать экспрессии генов отдельных клеток, которые могут быть определены и отслеживаются на уровне одной ячейки, используя покадровой видео микроскопии. Этот протокол может использоваться для изучения клетки первичной коры головного мозга, изолированные от начала до конца corticogenesis грызунов, но несколько корректировок, которые могут потребоваться согласно этап14. NSCs, изолированный от других источников также могут быть изучены с помощью покадровой видео микроскопии 2D культур, но соответствующие культивирования система должна определяться путем сравнения клеток поведений in vitro и in vivo38,43.

<table width="953">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td style="width:344px;">14175129</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>12400-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:344px;">16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Goat serum</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">69023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">VWR International Ltd.</td>
			<td style="width:344px;">306324N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>792632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-MAP2, mouse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-GFP chicken</td>
			<td>Aves</td>
			<td>0511FP12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat anti-mouse alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat anti-chicken alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">ImageJ</td>
			<td style="width:123px;">NIH</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">tTt</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell observer microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pasteur pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">The Tracking Tool (tTt) software</td>
			<td></td>
			<td>https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html</td>
			<td>download link</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of primary cerebral cortex cells using a 2d culture system

В ходе развития головного мозга клетки-предшественники пройти несколько раундов симметричных и асимметричных клеточных делений для создания новых прародителями или Постмитотические нейронов. Позже некоторые прародителями переключиться на gliogenic судьбы, добавив экзоцитоз и Олигодендроциты населению. Использование отснятого видео микроскопия культур клеток первичной коры головного мозга, это возможно для изучения молекулярных и клеточных механизмов, контролирующих режим деления клеток и клеточного цикла параметров клеток-предшественников. Аналогично судьба постмитотических клеток может проверяться с помощью клеток конкретных флуоресцентные репортер белки или после визуализации иммуноцитохимии. Что еще более важно все эти особенности могут быть проанализированы на уровне одной ячейки, позволяя идентификации прародителями, совершенные в поколение типов конкретных клеток. Манипуляция экспрессии генов также может выполняться с использованием вирусных опосредованной трансфекции, позволяя изучение клеток автономной и клеток неавтономной явлений. Наконец использование флуоресцентных белков фьюжн позволяет исследование симметричного и асимметричного распределения отдельных белков во время разделения и корреляции с судьбой клетки дочи. Здесь мы описываем метод покадровой видео микроскопии изображений первичной коры головного мозга мышиных клетки для до нескольких дней и анализировать режим деления клеток, длина клеточного цикла и судьба вновь сгенерированный клеток. Мы также описать простой метод для transfect клеток-предшественников, которые могут быть применены для манипулирования генов интерес или просто ярлык клетки с репортером белков.

Primary cultures of cerebral cortex cells isolated from embryos E14 contain both progenitor and neuronal cells. During the period of imaging, progenitors undergo several rounds of cell division, increasing the number of cells (Figure 5 and Video Figure 1).
Retroviral-mediated transfection of a few progenitor cells facilitates the identification of cell clones (F...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System at JoVE.com

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Живая визуализация является мощным инструментом для изучения клеточного поведения в режиме реального времени. Здесь мы описываем протокол для покадровой видео микроскопии клетки первичной коры головного мозга, позволяющий подробного изучения фаз, принятый в ходе линии переход от первичного нервных стволовых клеток в дифференцированных нейронов и глии.

Живой изображений клеток первичной коры головного мозга, с использованием системы 2D культуры

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

Магнитно-резонансной спектроскопии живых Дрозофилы С помощью магии прядильной Угол

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral ...

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Хронический изображений Мыши зрительной коры Использование тоньше черепа-подготовка

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-изображений PKC транслокации в Sf9 клеток и в Aplysia сенсорных нейронов

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-ячейки изображения сенсорных клеток-предшественников органов в интактных Drosophila Куколки

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Обнаружение микрорегиональном Гипоксия в мышь коры головного мозга на два фотона изображений эндогенной флуоресценции NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Визуализация и генетических манипуляций дендритов и шипы в мышь коры головного мозга и гиппокамп использования<em&gt; Внутриутробное</em&gt; Электропорация

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Одновременное электроэнцефалография, в режиме реального времени измерения концентрации лактата и Optogenetic Манипуляция активности нейронов в коры головного мозга грызунов

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Функциональной визуализации из слуховой коры у взрослых кошек с использованием высокого поля МРТ

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Онлайн Визуализация Митоз в развивающихся мышиных эмбриональных Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Живая съемка<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Личиночные нейробласты

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...