Name: live imaging of primary cerebral cortex cells using a 2d culture system
Uploaded: 2017-08-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System at JoVE.com

Detta arbete stöds av CNPq (Conselho Nacional de skattemyndigheten Científico e Tecnológico), uddar (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) och FAPERN (Fundação de Amparo en Pesquisa do Rio Grande do Norte).

All experiments involving live animals described in this protocol are conducted according to the National and International laws and were approved by the local University Animal Care and Use Committee (CEUA/UFRN), under the license 009/2014. The following protocol is performed in a sterile environment. Familiarity with basic cell culture is expected.
1. Dorsolateral Telencephalon Microdissection
<ol>
	<li>Prepare the dissection medium (100 mL): 98.5 mL Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS...

Realtid observation av primära hjärnbarken celler gör analysen av cellproliferation, celldelning, cellcykelns längd, celldifferentiering och cell överlevnad3,14,15,37. Viktigare, tillåter det studier av encelliga härstamningar, leder till identifiering av de mellanliggande etapperna antagit under progression från Karolina till nervceller3. Slutligen, kombinatione...

Neurala stamceller (NSC) generera nervceller och macroglial celler under hjärnbarken utveckling. På tidigt-corticogenesis, Karolina genomgå flera omgångar av symmetriska celldelning och expandera stamcellspoolen. Sedan, Karolina klyftan asymmetriskt att generera nervceller direkt eller indirekt genom intermediärer1. Endast på Växla mitten av - till sent-corticogenesis, stamfäder för att generera astrocyter och oligodendrocyter2,3,4. De fullständiga mekanismer som styr cellproliferation och differentiering, samt bidraget från öde-begränsad stamfäder till generation av unika typer av nervceller eller macroglial celler är dock en fråga om intensiv debatt4,5,6. Enskilda kortikala Karolina potential att generera nervceller, astrocyter och oligodendrocyter har varit flitigt studerade in vitro- och in-vivo med en myriad av tekniker såsom: live imaging i encelliga kulturer7,8,9,10,11,12,13. Live-imaging i hög densitet kulturer kulturer3,14,15. Live-imaging i slice kulturer16,17,18. klonal analys med viral vektor-medierad genetiska märkning i hög densitet kulturer14,15,19,20,21. klonal analys i vivo som använder retrovirus22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33; och klonal analys i vivo med transgena djur34.
Var och en av dessa tekniker utgör för- och nackdelar. Exempelvis är i vivo lineage tracing mottagliga till bunta och blixtra fel3, leder till motstridiga slutsatser om potentialen av enskilda kortikala stamfäder. Dessutom både in vitro och in-vivo studier utifrån märkningen av stamceller på tidiga tidpunkter och bakre analys av cell härstamningar kan påverkas av oupptäckt förekomsten av celldöd under härstamning-progression35. Därför måste ett lämpligt system att analysera potentialen för enda Karolina tillåta identifiering av alla celler genereras, samt lämpliga karakterisering av cell öden av härstamning. Kombinationen av primär cellkultur och levande imaging ger inställningen. Använda single-cell kultur och time-lapse video mikroskopi, har templet et al. visat växeln i linjen av enskilda hjärnbarken stamfäder från neurogenes till gliogenesis11. Senare, används de samma system för att visa att olika typer av nervceller genereras från en enda kortikala stamceller12. Men detta system utgör en viktig varning: endast 1% av kortikala föräldraparets isolerad på tidig corticogenesis generera kloner av 4 eller fler avkommor9. Efter tillägg av FGF2 ökar frekvensen av celler som genererar 4 eller fler celler till 8-10%9. Detta nummer är dock för liten med tanke på att nästan alla kortikala föräldraparets proliferativ i detta skede. Dessutom uteslutas inte de potentiella effekterna av FGF2 på öde-specifikation36. För att kringgå dessa begränsningar, vi använde högdensitets cellkulturer som stöder spridningen av både ventrikulära (Pax6-uttrycker) och subventrikulära (Tbr2-uttryckande) kortikala föräldraparets15. Realtid observation av dessa kulturer har dessutom visat att flera funktioner av NSC härstamning progression återges under dessa förhållanden, som funktionsläget av celldelning, förlängning av cellcykeln, enstaka celler potential att generera nervceller och glia, bland annat3,15. Mer nyligen har vi också använt detta system för att visa att CREB-signalering påverkar cellöverlevnad av omogna hjärnbarken nervceller i möss37. Således anser vi att time-lapse video-mikroskopi av primära murina hjärnbarken celler odlade i hög densitet är en kraftfull och tillgängliga verktyg att studera cellulära och molekylära mekanismer av cellcykelns förlopp, celldelning, cellöverlevnad och cell öde specifikation. Dessa produkter kan åstadkommas med transgena djur, möjliggör identifiering av viss cell öden på realtid38,39,40 eller användning av efter imaging immuncytokemi3,38,41,42.
Här, ger vi en steg för steg-protokollet för att förbereda primära hjärnbarken cellkultur stödja spridningen av Karolina och den efterföljande generationen av nervceller och macroglial celler. Vi diskuterar också användningen av retroviral-medierad transfection att manipulera genuttryck av enskilda celler, som kan identifieras och spåras på enskild cell nivå med time-lapse video mikroskopi. Detta protokoll kan användas för att studera primära hjärnbarken celler isolerade från början till slutet av corticogenesis hos gnagare, men några justeringar kan krävas enligt den scen14. Karolina isolerade från andra källor kan också studeras med time-lapse video mikroskopi av 2D kulturer, men lämpliga culturing systemet bör fastställas genom att jämföra cell beteenden in vitro- och in-vivo38,43.

<table width="953">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td style="width:344px;">14175129</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>12400-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:344px;">16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Goat serum</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">69023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">VWR International Ltd.</td>
			<td style="width:344px;">306324N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>792632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-MAP2, mouse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-GFP chicken</td>
			<td>Aves</td>
			<td>0511FP12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat anti-mouse alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat anti-chicken alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">ImageJ</td>
			<td style="width:123px;">NIH</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">tTt</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell observer microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pasteur pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">The Tracking Tool (tTt) software</td>
			<td></td>
			<td>https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html</td>
			<td>download link</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of primary cerebral cortex cells using a 2d culture system

Under hjärnbarken utveckling genomgå stamceller flera omgångar av symmetriska och asymmetriska celldelningar att generera nya föräldraparets eller postmitotic nervceller. Senare, byta några föräldraparets till ett gliogenic öde, att lägga till de astrocyt och oligodendrocyte populationerna. Med time-lapse video-mikroskopi av primära hjärnbarken cellkulturer, är det möjligt att studera de cellulära och molekylära mekanismer som styr funktionsläget av celldelning och cellcykeln parametrar av stamceller. Likaså kan ödet för postmitotic celler undersökas med hjälp av cell-specifika fluorescerande reporter proteiner eller efter imaging immuncytokemi. Viktigare, kan alla dessa funktioner analyseras på enskild cell nivå, möjliggör identifiering av föräldraparets begått till generation av specifika celltyper. Manipulation av genuttryck kan också utföras med viral-medierad transfection, möjliggör studiet av cell-självständiga och icke-cell-autonoma fenomen. Slutligen, användning av fusion fluorescerande proteiner gör studien av symmetriska och asymmetriska fördelningen av valda proteiner under avdelningen och sambandet med dottercellerna öde. Här, beskriver vi metoden time-lapse video-mikroskopi för att bilden primära hjärnbarken murina celler för upp till flera dagar och analysera läget för celldelning, cellcykelns längd och ödet av nygenererad celler. Vi beskriver också en enkel metod för att transfect stamceller, som kan tillämpas för att manipulera gener av intresse eller helt enkelt etikettera celler med reporter proteiner.

Primary cultures of cerebral cortex cells isolated from embryos E14 contain both progenitor and neuronal cells. During the period of imaging, progenitors undergo several rounds of cell division, increasing the number of cells (Figure 5 and Video Figure 1).
Retroviral-mediated transfection of a few progenitor cells facilitates the identification of cell clones (F...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System at JoVE.com

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Levande bildbehandling är ett kraftfullt verktyg att studera cellulära beteenden i realtid. Här beskriver vi ett protokoll för time-lapse video-mikroskopi av primära hjärnbarken celler som gör att en detaljerad granskning av de faser som antogs under härstamning progression från primära neurala stamceller till differentierade nervceller och glia.

Live avbildning av primära hjärnbarken celler använder ett 2D kultur

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

Resonansspektroskopi av levande Drosophila melanogaster Med hjälp av Magic Angle Spinning

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral ...

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Kronisk Imaging av Mouse syncentrum Använda en uttunnade skallen Förberedelser

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-avbildning av PKC translokation hos Sf9 celler och i Aplysia sensoriska neuroner

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging av sensoriska celler orgel Precursor i intakt Drosophila Puppor

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Detektion av Microregional hypoxi i mus Cerebral Cortex med två-foton Imaging av endogen NADH fluorescens

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisering och Genetic Manipulation av dendriter och ryggar i mus hjärnbarken och hippocampus med användning av<em&gt; I utero</em&gt; Elektroporering

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Samtidig Elektroencefalografi, realtidsmätning av laktat koncentration och optogenetic Manipulering av neuronal aktivitet hos gnagare Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Funktionell avbildning av hörselbarken hos vuxna katter med hjälp av hög-fält fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Live avbildning av Mitos i utvecklings Mouse embryonala Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live avbildning av<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvneuroblaster

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...