Name: live imaging of primary cerebral cortex cells using a 2d culture system
Uploaded: 2017-08-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System at JoVE.com

Bu eser CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), BURUNLARI (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) tarafından desteklenen ve FAPERN (Fundação de Amparo Pesquisa Rio Grande do Norte).

All experiments involving live animals described in this protocol are conducted according to the National and International laws and were approved by the local University Animal Care and Use Committee (CEUA/UFRN), under the license 009/2014. The following protocol is performed in a sterile environment. Familiarity with basic cell culture is expected.
1. Dorsolateral Telencephalon Microdissection
<ol>
	<li>Prepare the dissection medium (100 mL): 98.5 mL Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS...

Gerçek zamanlı gözlem Primer serebral korteks hücre hücre çoğalması analizi, hücre bölünmesi, hücre döngüsünün uzunluğu, hücre farklılaşma ve hücre hayatta kalma3,14,15,37modu sağlar. Daha da önemlisi, bu tek hücreli soy, NSCs üzerinden ilerleme nöronlar3sırasında yürürlüğe giren ara aşama tanımlaması için önde gelen çalışma izin v...

Sinir kök hücreleri (NSC) serebral korteks geliştirme sırasında neurons ve macroglial hücreleri oluşturur. Erken-corticogenesis, NSCs birkaç tur simetrik hücre bölünmesi geçmesi ve progenitör havuzu genişletin. Sonra NSCs nöronlar ara ürün1ile doğrudan veya dolaylı olarak oluşturmak için asimetrik olarak bölün. Sadece orta - için geç-corticogenesis,2,3,4astrocytes ve oligodendrocytes oluşturmak için ataları geçin. Ancak, hücre çoğalması ve farklılaşma gibi kader tarafından kısıtlanmış ataları benzersiz türde nöronlar ve macroglial hücreleri nesil katkısını kontrol tam mekanizmaları meselesi yoğun tartışmalar4,5,6kalır. Nöronlar, astrocytes ve oligodendrocytes oluşturmak için bireysel kortikal NSCs potansiyelini kapsamlı bir şekilde okudu vitro ve in vivo gibi sayısız teknikler kullanarak olmuştur: tek hücre kültürleri7,8,9,10,11,12,13; görüntüleme yaşamak yüksek yoğunluklu kültürler kültürler3,14,15' te görüntüleme canlı; dilim kültürler16,17,18içinde görüntüleme canlı; viral vektör-aracılı genetik yüksek yoğunluklu kültürler14,15,19,20,21' etiketleme klonal analizi; klonal analiz vivo içinde retrovirüsü22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33kullanarak; ve Transjenik hayvanlar34klonal analiz vivo içinde kullanma.
Bu tekniklerin herbirini artılarını ve eksilerini sunar. Örneğin, in vivo soy izleme bireysel kortikal ataları potansiyeli hakkında çelişkili sonuçlar için önde gelen topaklanmasını bölme hataları ve3, duyarlı olduğunu. Ayrıca, hem içinde in vitro ve in vivo çalışmalar progenitör hücrelerin erken zaman noktalarda etiketleme üzerinde temel ve posterior analizi hücre soy soy-ilerleme35sırasında hücre ölümü tespit edilmeden oluşumu tarafından etkilenebilir. Bu nedenle, tek NSCs potansiyelini analiz etmek için uygun bir sistem tüm hücreleri oluşturulan tanımlaması, hem de hücre kaderi lineage içinde uygun karakterizasyonu izin vermesi gerekir. Birincil hücre kültürü ve canlı görüntüleme bu ayarı sağlar. Tek hücre kültür ve hızlandırılmış video mikroskobu kullanılarak, tapınak ve ark. göstermiştir geçiş gliogenesis11neurogenesis üzerinden bireysel serebral korteks ataları soyundan içinde. Daha sonra nöronların farklı türleri tek kortikal progenitör12den oluşturulur göstermek için aynı sistem kullanılır. Ancak, bu sistemi önemli bir uyarı sunar: %1 kortikal ataları erken corticogenesis izole klonlar 4 veya daha fazla döl9oluşturmak sadece. FGF2 eklenmesinden sonra 8-%109' a 4 veya daha fazla hücre üreten hücreleri sıklığı artar. Yine de, bu hemen hemen tüm kortikal ataları proliferatif bu aşamada düşünüldüğünde çok küçük bir sayıdır. Ayrıca, kader-teknik FGF2 potansiyel etkileri36yönetilen olamaz. Bu sınırlamaları aşmak için biz hızla çoğalmak-in her ikisi Ventriküler (Pax6 ifade etme) destek yüksek yoğunluklu hücre kültürlerinde kullanılan ve subventricular (Tbr2-ifade) kortikal ataları15. Ayrıca, gerçek zamanlı gözlem bu kültürlerin çeşitli özellikler NSC lineage progresyon3,15bu koşullar altında hücre bölünmesi, hücre döngüsü uzatma, sinir hücreleri ve glia, diğerleri arasında oluşturmak için potansiyel tek hücre modu gibi çoğaltılabilir göstermiştir. Son zamanlarda, biz de CREB sinyalli fareler37nöronlarda olgunlaşmamış serebral korteks hücre yaşama etkiler göstermek için bu sistemi kullandık. Böylece, biz inanıyoruz Bu hızlandırılmış video mikroskobu birincil fare serebral korteksin yüksek yoğunluklu yetiştirilen hücrelerin hücre döngüsü progresyon hücresel ve moleküler mekanizmaları, hücre bölünmesi, hücre hayatta kalma ve hücre kader belirtimi modu çalışmaya bir araçtır güçlü ve erişilebilir. İkinci Transjenik hayvanlar, belirli hücre kaderi gerçek zamanlı38,39,40 tanımlaması veya immunocytochemistry3,38,41,42sonrası Imaging kullanım izin kullanılarak gerçekleştirilebilir.
Burada, Primer serebral korteks hücre kültürü destekleyen NSCs yayılması ve nöronlar ve macroglial hücreleri sonraki nesil hazırlamak için adım adım bir protokol sağlar. Biz de tespit ve hızlandırılmış video mikroskobu kullanılarak tek hücre düzeyinde izlenen bireysel hücrelerin gen ekspresyonu işlemek için transfection retroviral aracılı kullanımı tartışıyorlar. Bu protokolü en başından sonuna kadar corticogenesis Rodents izole Primer serebral korteks hücreleri çalışma için kullanılabilir, ama bir kaç ayarlama göre sahne14gerekli olabilir. 2D kültürlerin time-lapse video mikroskobu kullanarak diğer kaynaklardan izole NSCs da okudu olabilir ama uygun kodlamayla sistemi cep davranışları vitro ve in vivo38,43karşılaştırarak tespit edilmelidir.

<table width="953">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen Life Technologies</td>
			<td style="width:344px;">14175129</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">H3375-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>12400-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glucose</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B27</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">trypsin-EDTA (0.05%)</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:344px;">16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Goat serum</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">69023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">VWR International Ltd.</td>
			<td style="width:344px;">306324N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>792632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-MAP2, mouse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">anti-GFP chicken</td>
			<td>Aves</td>
			<td>0511FP12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat anti-mouse alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat anti-chicken alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:320px;height:40px;">ImageJ</td>
			<td style="width:123px;">NIH</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">tTt</td>
			<td>ETH Zurich</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell observer microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pasteur pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">The Tracking Tool (tTt) software</td>
			<td></td>
			<td>https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html</td>
			<td>download link</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of primary cerebral cortex cells using a 2d culture system

Serebral korteks geliştirme sırasında progenitör hücrelerin yeni ataları veya postmitotic nöronlar oluşturmak için simetrik ve asimetrik hücre bölümler birkaç tur tabi. Daha sonra bazı ataları gliogenic kadere bağlı, astrocyte ve oligodendrocyte nüfus ekleme geçin. Primer serebral korteks hücre kültürleri, hızlandırılmış video mikroskobu kullanılarak, hücre bölünmesi modu ve progenitör hücre hücre döngüsü parametreleri kontrol hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek mümkündür. Benzer şekilde, kader postmitotic hücrelerinin hücre özgü floresan muhabir proteinler kullanarak veya immunocytochemistry sonrası Imaging incelenebilir. Daha da önemlisi, tüm bu özellikler belirli hücre tiplerinin üretimi için taahhüt ataları tanımlaması sağlayan tek hücreli düzeyinde analiz edilebilir. Gen ifadesinin manipülasyon da hücre özerk ve hücre özerk olayların çalışma izin transfection, viral aracılı kullanarak gerçekleştirilebilir. Son olarak, seçili proteinler simetrik ve asimetrik dağıtım sırasında bölünme ve kızı hücreleri kaderi ile korelasyon çalışma füzyon floresan proteinler kullanımına izin verir. Burada, birkaç gün kadar Primer serebral korteks fare hücreler için görüntü ve hücre bölünmesi, hücre döngüsünün uzunluğu ve kader yeni oluşturulan hücre modu çözümlemek için hızlandırılmış video-mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır. Biz de genlerin ilgi yönetmek veya sadece muhabir proteinler hücrelerle etiket için uygulanan progenitör hücre transfect için basit bir yöntem açıklanmaktadır.

Primary cultures of cerebral cortex cells isolated from embryos E14 contain both progenitor and neuronal cells. During the period of imaging, progenitors undergo several rounds of cell division, increasing the number of cells (Figure 5 and Video Figure 1).
Retroviral-mediated transfection of a few progenitor cells facilitates the identification of cell clones (F...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System at JoVE.com

Live Imaging of Primary Cerebral Cortex Cells Using a 2D Culture System

Canlı görüntüleme gerçek zamanlı olarak hücresel davranışlarını incelemek için güçlü bir araçtır. Burada, hızlandırılmış video-ayrıntılı bir inceleme, birincil sinir kök hücreleri farklı nöronlar ve glia lineage ilerleme sırasında yürürlüğe giren aşamaları sağlayan mikroskobu Primer serebral korteks hücre için bir protokol açıklayın.

Primer serebral korteks hücre bir 2D kültür sistemi kullanarak görüntüleme yaşamak

During cerebral cortex development, progenitor cells undergo several rounds of symmetric and asymmetric cell divisions to generate new progenitors or ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

Magnetic Resonance Spectroscopy of live Drosophila melanogaster using Magic Angle Spinning

Canlı Manyetik Rezonans Spektroskopisi Drosophila melanogaster Magic Açısı İplik kullanarak

High-Resolution Magic Angle Spinning (HRMAS) proton magnetic resonance spectroscopy (1H-MRS) is a novel non-destructive technique that improves spectral ...

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Fare Visual Cortex İnceltilen kafatası Hazırlık Kronik Görüntüleme

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Canlı görüntüleme Sf9 Hücreler ve PKC Translokasyon Aplysia Duyu Nöronlar

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Endojen NADH Floresans iki-foton Imaging tarafından Fare Serebral Korteks olarak Microregional Hipoksi Algılama

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Eşzamanlı Elektroensefalografi, Kemirgen Serebral Korteks Laktat Konsantrasyonu ve Nöronal Faaliyet Optogenetic Manipülasyon Gerçek zamanlı ölçüm

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Yüksek alan fMRI kullanılarak Yetişkin kedilerde işitme korteksi Fonksiyonel Görüntüleme

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...