Name: generation of escape variants of neutralizing influenza virus monoclonal antibodies
Uploaded: 2017-08-29T13:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies at JoVE.com

Ce projet a été financé en partie avec des fonds fédéraux depuis le National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, sous CEIRS contrat HHSN272201400008C (F.K.) ; U19AI109946 NIH-01 (F.K.) ; et P01AI097092-04S1 (P.E.L.).

<ol>
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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

Bien que la majorité des résidus identifiés par l’intermédiaire de mutants d’échappement ont été exacte, les avertissements importants de cette approche est que les mutations ponctuelles de variants d’échappement peut mappent pas nécessairement au sein de l’empreinte moléculaire de l’anticorps, telle que déterminée par analyses structurales. Cela est dû à la possibilité d’une mutation à un certain résidu de conduire à un changement de conformation distal par rapport à l’emplacement du résidu muté, analogue à un effet allostérique. Une autre limitation est que cette méthodologie ne peut être appliquée pour la neutralisation des anticorps ; les anticorps que le manque de pression de sélection in vitro ne conduira pas à échapper à des mutants. Toutefois, cette limitation peut être surmontée avec l’utilisation d’un panel de variantes d’échappement générés par des anticorps neutralisants précédemment caractérisées. Tan et coll. permettant de mapper l’épitope d’un des anticorps non neutralisants7une variante de l’évasion d’un mAb neutralisant le virus H7N9.
Néanmoins, élucider les épitopes des anticorps par la génération des variants d’échappement fournit une alternative viable à la cristallographie et cryo-electron microscopy, qui nécessitent un investissement étendu de matériel. Autres solutions consistent à déterminer la région de liaison minimale du mAbs à l’aide de mutants de troncature/numérisation numérisation ou peptide alanine. Alanine mutagénèse de balayage peut exiger une quantité importante de travail dans la production d’un grand nombre de variantes au cours de dépistage29, numérisation de peptide est limitée aux épitopes linéaires30. La méthode décrite dans le présent protocole ne nécessite pas un équipement spécial ou technique et utilise en fait, existant en vitro neutralisation dosages modifiés pour générer des variantes d’évasion des anticorps d’intérêt.
Le protocole de production variantes d’évasion qui nécessitent plusieurs passages (par exemple, des anticorps spécifiques à tige) dépend fortement de la concentration initiale d’anticorps dans le passage 0. Il est préférable de pécher par excès de prudence et de commencer à un demi-rondin inférieure à la concentration inhibitrice maximale la moitié d’un anticorps d’un journal et de permettre la croissance robuste de virus. Le chercheur peut conjecturer qu’une culture de virus de titre élevé en présence de basse pression immunologique auront une grande variation génétique dans la population virale. Variantes d’échappement peuvent être sélectionnés pour en augmentant graduellement la concentration d’anticorps dans les passages suivants. Dans le cas où la croissance du virus diminue, la quantité de liquide surnageant viral peut être augmentée dans le passage suivant, tout en conservant la même quantité de concentration d’anticorps dans le passage précédent.
La majorité des vaccins contre la grippe universelle vise à susciter une forte réponse anticorps vers la région de la tige de l’AP. Les analyses des variantes d’échapper aux anticorps spécifiques à tige sont importants pour définir la relation entre la pression immunologique et de fitness de virus de la grippe. Fait intéressant, échappement des virus mutants résultant de tige spécifique mAbs étaient tout atténué en vivo en murine LD50 études4. Ces études fournissent des arguments solides pour les plates-formes de vaccination axés sur la tige. En outre, ce protocole pourrait servir à identifier des mutants d’échappement à d’autres composés antiviraux, tels que de petites molécules inhibitrices. Enfin, cette méthode n’est pas limitée aux glycoprotéines de surface de virus de grippe, mais peut aussi être appliquée plus largement afin de déterminer les épitopes d’autres glycoprotéines virales.

Semblable à d’autres virus à ARN, virus A possèdent une polymérase erreurs qui permet la génération d’une multitude de variants antigéniques avec chaque cycle de réplication1,2,3. Le virus grippal A a une capacité étonnante à s’adapter et de se soustraire à la réponse immunitaire humaine via dérive antigénique, qui est obtenue grâce à une accumulation de mutations sur les glycoprotéines de surface qui entraîne la perte de la liaison de l’anticorps. La dérive antigénique des virales glycoprotéines de surface, HA et la neuraminidase (NA), nécessite la nécessité de reformuler et d’administrer le vaccin chaque année.
Les progrès technologiques dans l’isolement et la production d’anticorps spécifiques de l’antigène ont abouti à un nombre élevé de mAbs induite par le vaccin4,5,6,7,8. À son tour, la caractérisation des épitopes du mAbs largement de neutraliser les virus grippaux A a beaucoup aidé à l’élaboration de plusieurs universelle grippe vaccin candidats9,10,11, 12,13,14. Élucider l’empreinte antigénique d’un mAb révèle les causes structurelles de neutralisation et permet une approche éclairée vers la conception de vaccins. Cependant, il n’est ni réaliste ni rentable pour les laboratoires de caractériser structurellement vastes panneaux du mAbs par cristallographie aux rayons x ou cryo-microscopie électronique afin de cartographier les épitopes sur l’antigène viral15, 16 , 17 , 18.
Cristallographie aux rayons x ou cryo-microscopie électronique nécessite des équipements coûteux, des techniques spécialisées et potentiellement une quantité considérable de temps à générer des données. Une approche alternative et plus rapide utilise la génération rapide des diverses populations virales via l’Erreurs RNA-dependent RNA polymérase pour générer des mutants d’échappement afin de déterminer les épitopes du mAbs19,20, 21,22,23. La génération des variants d’échappement ne nécessite pas de matériel spécial ou technique et peut être effectuée avec le matériel et réactifs de laboratoire classiques.
Nous décrivons ici une méthode qui permet le mappage de résidus importants requis pour la liaison de mAb qui reconnaissent la grippe HA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1159">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Falcon 96-well clear flat bottom TC-treated culture microplate with Lid</td>
			<td style="width:197px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">353072</td>
			<td style="width:429px;">Assay plate use for the microneutralization assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Falcon 96-well clear V-bottom plate</td>
			<td style="width:197px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">353263</td>
			<td>Assay plate use for the hemagglutination inhibition assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">1X Minimal Essential Medium (MEM)</td>
			<td style="width:197px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11095080</td>
			<td>Infection medium</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Tosyl phenylalanyl chloromethyl (TPCK)-treated trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T8802</td>
			<td>Cleaves immature HA0 to HA1 and HA2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Biotinylated anti-NP primary antibody (IAV)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB8258B</td>
			<td>An antibody that recognizes the NP protein of influenza A viruses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Biotinylated anti-NP primary antibody (IBV)</td>
			<td style="width:197px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB8260B-5</td>
			<td>An antibody that recognizes the NP protein of influenza B viruses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Streptavidin-HRP antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">18-152</td>
			<td>This is used as a secondary antibody for the biotinylated anti-NP antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">HRP substrate (SIGMAFAST-OPD)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9187-5SET</td>
			<td>o-phenylenediamine dihydrochloride water soluble substrate for HRP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">96-well V-bottom plate</td>
			<td style="width:197px;">Nunc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">249662</td>
			<td>Assay plate used for the hemagglutination assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Chicken red blood cells</td>
			<td>Lampire Biological Laboratories</td>
			<td align="right" style="width:119px;">7201403</td>
			<td>Used to assess the ability of influenza virus to agglutinate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TRIzol</td>
			<td style="width:197px;">Ambion</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15596026</td>
			<td>Extraction of RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Superscript III</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12574018</td>
			<td>Reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:197px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28704</td>
			<td>Isolation of amplified PCR product</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11668027</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Anti-human IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-11013</td>
			<td>Fluorescent secondary antibody for human antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-11001</td>
			<td>Fluorescent secondary antibody for murine antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">6-well polystyrene microplate</td>
			<td style="width:197px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">353934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Nalgene long term storage Cryo-tubes</td>
			<td style="width:197px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">5012-0020</td>
			<td>Freezing of viral culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">reassortant A/California/04/09 (H1)</td>
			<td style="width:197px;">Palese Laboratory</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reassortant virus expressing the HA and NA of A/California/04/09 (H1N1) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">reassortant A/Shanghai/1/13 (H7)</td>
			<td style="width:197px;">Palese Laboratory</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reassortant virus expressing the HA and NA of A/Shanghai/1/13 (H7N9) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Bovine serum albumin solution (35%)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Qiagen gel extration kit</td>
			<td style="width:197px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28704</td>
			<td>Silica-membrane-based purification of DNA fragments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of escape variants of neutralizing influenza virus monoclonal antibodies

Virus de la grippe présentent une remarquable capacité d’adaptation et d’échapper à la réponse immunitaire hôte. Une façon est à travers des changements antigéniques qui se produisent sur les glycoprotéines de surface du virus. La génération des variants d’échappement est une méthode puissante pour élucider comment les virus échappent détection immunitaire et dans l’identification des résidus importants requis pour la liaison de l’anticorps. Nous décrivons ici un protocole sur la façon de générer des variantes de fuite pour le virus influenza de type A en utilisant des anticorps monoclonaux humains ou murins (mAbs) dirigés contre l’hémagglutinine virale (HA). Avec l’utilisation de notre technique, nous avons caractérisé précédemment des résidus importants requis pour la liaison des anticorps ciblant la tête ou la tige du roman aviaire H7N9 HA. Le protocole peut être facilement adapté pour d’autres systèmes de virus. Analyses de variants d’échappement sont importants pour la modélisation de la dérive antigénique, déterminer les polymorphismes de nucléotide simple (SNP) conférant la résistance et remise en forme de virus et dans la conception de vaccins et/ou de thérapeutique.

Nous avons utilisé précédemment des variations de cette méthode pour générer des variantes d’évasion à mAbs humains et murins induite par le vaccin contre la grippe saisonnière, la vaccination H7N9 ou séquentielle ADN/recombinant HA protéine vaccination4,5 ,6,7. Comme décrit ci-dessus, anticorps ont été d’abord caractérisés en utilisant les tests HI et micro-neutralisation afin de nous informer de quel protocole spécifique de continuer avec le prochain4,5. Anticorps 07-5D 03, 07-5F01, 07-5G 01, 07-4B03, 4E02-07 et 07-4D 05 se sont avérés pour avoir HI et neutralisation des activités contre le virus aviaire de H7N9 (A/Shanghai/1/2013) (tableau 1), et donc le protocole n° 1 (étape 2.1) a été utilisé. Pour mAbs à neutraliser ce manque activité HI, tels que 41-5E04, 045-051310-2B06, 042-100809-2F04 et S6-B01 (tableau 1), protocole 2 (étape 2.2) a été utilisé pour générer des variantes de l’évasion. Échappement cartographie mutante a révélé que bon nombre des anticorps reconnaissent des résidus importants dans des endroits distincts sur le viral HA4,5 (Figure 4). Bien que la majorité des anticorps HI-positives ont échapper mutants résidus près rapportées antérieurement sites antigéniques du H7 HA, les anticorps HI-négatif généré des mutants d’échappement avec mutations ponctuelles dans la région de la tige4,5 .
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anticorps</td>
			<td>Salut l’activité</td>
			<td>Activité NEUT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5D 03</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5F01</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5G 01</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4B03</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4E02</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4D 05</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>41-5E04</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>045-051310-2B06</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>042-100809-2F04</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S6-B01</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : Tableau d’activité HI et neutralisation des anticorps. Dix H7 spécifique mAbs isolées de personnes vaccinées avec un vaccin expérimental de H7N9 pièce différente en vitro activités antivirales5.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="4">Primer avant (5'-3')</td>
			<td colspan="4">Reverse Primer (5'-3')</td>
			<td colspan="2">Conditions de Thermocylcer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV</td>
			<td colspan="4">TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG</td>
			<td colspan="4">ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT</td>
			<td colspan="2">42 ° c pendant 60 min, 94 ° c pendant 2 min/5 cycles de 94 ° c pendant 20 s, 50 ° c pendant 30 s et 68 ° c pendant 3 min 30 s, suivie de 40 cycles de 94 ° c pendant 20 s, 58 ° c pendant 30 s et 68 ° c pendant 3 min 30 s avec un temps final extension à 68 ° c pendant 10 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBV</td>
			<td colspan="4">GGGGGGAGCAGAAGCAGAGC</td>
			<td colspan="4">CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC</td>
			<td colspan="2">45 ° c à 55 ° c pendant 30 min, 60 min, 94 ° c pendant 2 min/5 cycles de 94 ° c pendant 20 s, 40 ° c pendant 30 s et 68 ° c pendant 3 min 30 s, suivie de 40 cycles de 94 ° c pendant 20 s , 58 ° c pendant 30 s et 68 ° c pendant 3 min 30 s avec un temps final extension à 68 ° c pendant 10 min</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 2 : amorces de virus de grippe universelle. Paires d’amorces pour l’amplification des segments HA de27 de la grippe A et de B28 virus et de leurs conditions respectives thermocycleur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig1.jpg"> 
Figure 1 : test HI. Schéma (A) A pour la mise en place un test HI tester l’activité des deux souris spécifiques H1 mAbs 7 b 2 (tête spécifique) et 6F12 (tige spécifique) à l’aide d’une plaque de fond en V 96 puits et (B) un exemple des résultats d’un essai de HI23. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig2.jpg"> 
Figure 2 : test de micro-neutralisation. Un schéma pour mettre en place un test micro-neutralisation tester l’activité des deux mAbs humaine 4 055 et CR911417. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig3.jpg"> 
Figure 3 : génération de mutants d’échappement. La méthodologie proposée sera tributaire de la HI et l’activité de micro-neutralisation exposées par l’anticorps. La génération de mutants d’échappement contre (A) les anticorps neutralisants de HI-positif peuvent exiger un seul passage dans les oeufs, alors que les anticorps neutralisants de HI-négatif (B) peuvent impliquer plusieurs passages avec l’augmentation des quantités d’anticorps dans culture de cellules de tissus. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig4.jpg"> 
Figure 4 : exemple d’une carte de l’épitope du roman aviaire H7N9 HA généré avec variantes mutantes évasion. Anticorps induite par le vaccin isolement de personnes vaccinées avec un candidat H7N9 grippe un vaccin ont été utilisées pour générer des variantes mutantes d’évasion. Chaque résidu a indiqué en rouge représente l’emplacement des critiques acides aminés nécessaires pour la liaison efficace d’un mAb. Données ont été adaptées de Dunand-Henry et al., 20154. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Les auteurs décrivent une méthode par laquelle nous identifions des résidus importants requis pour la liaison des anticorps monoclonaux humains ou murins qui ciblent l’hémagglutinine virale du virus de l’influenza. Le protocole peut être adapté à d’autres glycoprotéines de surface de virus et de leurs anticorps neutralisants correspondants.

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