Name: generation of escape variants of neutralizing influenza virus monoclonal antibodies
Uploaded: 2017-08-29T13:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies at JoVE.com

Questo progetto è stato finanziato in parte con fondi federali dal National Institute of Allergy e malattie infettive, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, sotto CEIRS contratto HHSN272201400008C (F.K.); NIH U19AI109946-01 (F.K.); e P01AI097092-04S1 (p.e.l.).

<ol>
	<li>Shaw, M. L., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Orthomyxoviridae: the viruses and their replication. , (2013).</li><li>Nelson, M. I., Holmes, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+epidemic+influenza.">The evolution of epidemic influenza.</a> Nat Rev Genet. 8 (3), 196-205 (2007).</li><li>Lauring, A. S., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasispecies+Theory+and+the+Behavior+of+RNA+Viruses.">Quasispecies Theory and the Behavior of RNA Viruses.</a> PLoS Pathog. 6 (7), e1001005 (2010).</li><li>Henry Dunand, C. J., Leon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preexisting+human+antibodies+neutralize+recently+emerged+H7N9+influenza+strains.">Preexisting human antibodies neutralize recently emerged H7N9 influenza strains.</a> J Clin Invest. 125 (3), 1255-1268 (2015).</li><li>Dunand, C. J. H., Leon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+Neutralizing+and+Non-Neutralizing+Human+H7N9+Influenza+Vaccine-Induced+Monoclonal+Antibodies+Confer+Protection.">Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection.</a> Cell Host Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).</li><li>Tan, G. S., Lee, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Broadly+Neutralizing+Monoclonal+Antibody+That+Targets+the+Fusion+Domain+of+Group+2+Influenza+A+Virus+Hemagglutinin.">Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin.</a> J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).</li><li>Tan, G. S., Leon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadly-Reactive+Neutralizing+and+Non-neutralizing+Antibodies+Directed+against+the+H7+Influenza+Virus+Hemagglutinin+Reveal+Divergent+Mechanisms+of+Protection.">Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection.</a> PLoS Pathog. 12 (4), e1005578 (2016).</li><li>Smith, K., Garman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+fully+human+monoclonal+antibodies+specific+to+a+vaccinating+antigen.">Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen.</a> Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).</li><li>Steel, J., Lowen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+vaccine+based+on+the+conserved+hemagglutinin+stalk+domain.">Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain.</a> mBio. 1 (1), (2010).</li><li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly+protective+stalk-specific+antibodies.">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies.</a> J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).</li><li>Wang, T. T., Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+a+synthetic+peptide+from+the+influenza+virus+hemagglutinin+provides+protection+against+distinct+viral+subtypes.">Vaccination with a synthetic peptide from the influenza virus hemagglutinin provides protection against distinct viral subtypes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18979-18984 (2010).</li><li>Impagliazzo, A., Milder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+trimeric+influenza+hemagglutinin+stem+as+a+broadly+protective+immunogen.">A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen.</a> Science. 349 (6254), 1301-1306 (2015).</li><li>Krammer, F., Palese, P., Steel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Universal+Influenza+Virus+Vaccine+Design+and+Antibody+Mediated+Therapies+Based+on+Conserved+Regions+of+the+Hemagglutinin.">Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. , (2014).</li><li>Wohlbold, T. J., Nachbagauer, R., Margine, I., Tan, G. S., Hirsh, A., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+soluble+headless+hemagglutinin+protects+mice+from+challenge+with+divergent+influenza+viruses.">Vaccination with soluble headless hemagglutinin protects mice from challenge with divergent influenza viruses.</a> Vaccine. 33 (29), 3314-3321 (2015).</li><li>Ekiert, D. C., Bhabha, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope.">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324 (5924), 246-251 (2009).</li><li>Ekiert, D. C., Friesen, R. H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Highly+Conserved+Neutralizing+Epitope+on+Group+2+Influenza+A+Viruses.">A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.</a> Science. 333 (6044), 843-850 (2011).</li><li>Dreyfus, C., Laursen, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Conserved+Protective+Epitopes+on+Influenza+B+Viruses.">Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses.</a> Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).</li><li>Tran, E. E. H., Podolsky, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+Microscopy+Structures+of+Chimeric+Hemagglutinin+Displayed+on+a+Universal+Influenza+Vaccine+Candidate.">Cryo-electron Microscopy Structures of Chimeric Hemagglutinin Displayed on a Universal Influenza Vaccine Candidate.</a> mBio. 7 (2), e00257 (2016).</li><li>Wiley, D. C., Wilson, I. A., Skehel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+identification+of+the+antibody-binding+sites+of+Hong+Kong+influenza+haemagglutinin+and+their+involvement+in+antigenic+variation.">Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation.</a> Nature. 289 (5796), 373-378 (1981).</li><li>Gerhard, W., Yewdell, J., Frankel, M. E., Webster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+structure+of+influenza+virus+haemagglutinin+defined+by+hybridoma+antibodies.">Antigenic structure of influenza virus haemagglutinin defined by hybridoma antibodies.</a> Nature. 290 (5808), 713-717 (1981).</li><li>Jackson, D. C., Murray, J. M., White, D. O., Gerhard, W. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+antigenic+sites+of+influenza+virus+hemagglutinin.">Enumeration of antigenic sites of influenza virus hemagglutinin.</a> Infect Immun. 37 (3), 912-918 (1982).</li><li>Matsuzaki, Y., Sugawara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+Mapping+of+the+Hemagglutinin+Molecule+of+A/(H1N1)pdm09+Influenza+Virus+by+Using+Monoclonal+Antibody+Escape+Mutants.">Epitope Mapping of the Hemagglutinin Molecule of A/(H1N1)pdm09 Influenza Virus by Using Monoclonal Antibody Escape Mutants.</a> J Virol. 88 (21), 12364-12373 (2014).</li><li>Tan, G. S., Krammer, F., Eggink, D., Kongchanagul, A., Moran, T. M., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pan-H1+anti-hemagglutinin+monoclonal+antibody+with+potent+broad-spectrum+efficacy+in+vivo.">A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo.</a> J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).</li><li>Geneva: World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance. , (2002).</li><li>Brauer, R., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+Virus+Propagation+in+Embryonated+Chicken+Eggs.">Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs.</a> J Vis Exp. (97), e52421 (2015).</li><li>Mart&#237;nez-Sobrido, L., Garc&#237;a-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Recombinant+Influenza+Virus+from+Plasmid+DNA.">Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA.</a> J Vis Exp. (42), e2057 (2010).</li><li>Hoffmann, E., Stech, J., Guan, Y., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+primer+set+for+the+full-length+amplification+of+all+influenza+A+viruses.">Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses.</a> ArchVirol. 146 (12), 2275-2289 (2001).</li><li>Zhou, B., Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+Influenza+B+Virus+Genomic+Amplification+Facilitates+Sequencing,+Diagnostics,+and+Reverse+Genetics.">Universal Influenza B Virus Genomic Amplification Facilitates Sequencing, Diagnostics, and Reverse Genetics.</a> J Clin Microbiol. 52 (5), 1330-1337 (2014).</li><li>Sidhu, S. S., Kossiakoff, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+and+designing+protein+function+with+restricted+diversity.">Exploring and designing protein function with restricted diversity.</a> Curr Opin Chem Biol. 11, 347-354 (2007).</li><li>Chen, C. -. W., Chang, C. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+Scanning-assisted+Identification+of+a+Monoclonal+Antibody-recognized+Linear+B-cell+Epitope.">Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope.</a> J Vis Exp. (121), e55417 (2017).</li></ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Anche se la maggior parte dei residui identificati tramite mutanti di fuga è stata accurata, una delle principali avvertenze di questo approccio è che mutazioni puntiformi di varianti di fuga necessariamente potrebbe non essere mappato all'interno l'impronta molecolare dell'anticorpo come determinato dal analisi strutturali. Ciò è dovuto la capacità di una mutazione ad un certo residuo di portare ad un cambiamento conformazionale distale alla posizione del residuo mutato, analogo a un effetto allosterico. Un'altra limitazione è che questa metodologia può essere implementata solo per neutralizzazione degli anticorpi; gli anticorpi che mancano in vitro pressione selettiva non porterà a fuggire mutanti. Tuttavia, questo limite può essere superato con l'uso di un panel di varianti di fuga generato dagli anticorpi neutralizzanti precedentemente caratterizzati. Tan et al. utilizzata una variante di fuga di un mAb neutralizzanti il virus H7N9 per mappare l'epitopo di un anticorpo neutralizzante non7.
Ciò nonostante, chiarire gli epitopi degli anticorpi attraverso la generazione di varianti di fuga fornisce una valida alternativa alla microscopia cristallografia e cryo-elettrone, entrambi i quali richiedono un investimento ampio di attrezzature. Altre alternative sono per determinare la regione minima associazione di anticorpi monoclonali usando mutanti di scansione/troncamento di scansione o peptide alanina. Alanina mutagenesi di scansione può richiedere una notevole quantità di lavoro nel generare un gran numero di varianti durante lo screening29, durante la scansione del peptide limitata a epitopi lineari30. Il metodo descritto in questo protocollo non richiede attrezzature speciali o tecnica e, infatti, fa uso di esistente in vitro neutralizzazione saggi modificate per generare varianti di fuga degli anticorpi di interesse.
Il protocollo per generare varianti di fuga che richiedono più passaggi (ad esempio, gli anticorpi specifici del gambo) dipende fortemente dalla concentrazione iniziale di anticorpi nel passaggio 0. È meglio peccare per eccesso di cautela e avviare un registro per metà un registro inferiore la metà massima concentrazione inibitoria di un anticorpo e consentire la crescita robusta virus. Il ricercatore può speculare che una cultura di virus di alto titolo in presenza di bassa pressione immunologica avrà una grande variazione genetica nella popolazione virale. Varianti di fuga possono essere selezionati per aumentando gradualmente la concentrazione di anticorpi nei seguenti passaggi. Nel caso in cui la crescita di virus diminuisce, la quantità del surnatante virale può essere aumentata nel passaggio successivo, pur mantenendo la stessa quantità di concentrazione di anticorpi nel passaggio precedente.
L'obiettivo della maggioranza dei vaccini antinfluenzali per uso universale è quello di suscitare una risposta anticorpale robusto nei confronti della regione gambo l'HA. Le analisi delle varianti di fuga per gli anticorpi specifici del gambo sono importanti nel definire la relazione tra l'influenza virus fitness e pressione immunologica. Interessante, fuga virus mutanti derivanti da specifiche del gambo mAbs erano tutti attenuati in vivo in murino LD50 studi4. Questi studi forniscono un forte caso per piattaforme basate su fusti di vaccinazione. Inoltre, questo protocollo potrebbe essere utilizzato per identificare i mutanti di fuga ad altri composti anti-virale, come piccole molecole inibitrici. Infine, questa metodologia non è limitata alle glicoproteine di superficie di virus dell'influenza, ma può anche essere più ampiamente applicata per determinare gli epitopi di altre glicoproteine virali.

Simile ad altri virus RNA, virus di riossidazione A possedere una polimerasi errori che consente la generazione di una moltitudine di varianti antigeniche con ogni turno di replica1,2,3. Il virus dell'influenza A ha una sorprendente capacità di adattarsi e di eludere la risposta immunitaria umana tramite deriva antigenica, che si ottiene attraverso un accumulo di mutazioni sulle glicoproteine di superficie che conduce alla perdita del legame anticorpo. Deriva antigenica delle glicoproteine di superficie virale, HA e neuraminidasi (NA), richiede la necessità di riformulare e somministrare il vaccino ogni anno.
I progressi tecnologici nell'isolamento e la generazione di anticorpi antigene-specifiche hanno prodotto un numero elevato di mAbs indotta da vaccino4,5,6,7,8. A sua volta, la caratterizzazione degli epitopi di mAbs che sostanzialmente neutralizzare i virus dell'influenza A ha aiutato lo sviluppo di parecchi universale dell'influenza vaccino candidati9,10,11, 12,13,14. Delucidamento l'impronta antigenica di un mAb rivela i determinanti strutturali di neutralizzazione e consente un approccio consapevole verso la progettazione di vaccino. Tuttavia, non è né realistico né conveniente per i laboratori di caratterizzare strutturalmente ampi pannelli di mAbs attraverso cristallografia a raggi x o cryo-microscopia elettronica al fine di mappare epitopi dell' antigene virale15, 16 , 17 , 18.
Cristallografia a raggi x o cryo-microscopia elettronica richiede costose attrezzature, tecniche specializzate e potenzialmente una vasta quantità di tempo per generare dati. Un approccio alternativo e più veloce è utilizzando la generazione rapida di diverse popolazioni virali tramite errori RNA-dipendente polimerasi del RNA per generare mutanti di fuga per determinare gli epitopi di mAbs19,20, 21,22,23. La generazione di varianti di fuga non richiede attrezzature speciali o tecnica e può essere eseguita con attrezzature e reagenti di laboratorio convenzionali.
Qui, descriviamo un metodo che consente per la mappatura dei residui critici richieste per l'associazione mAb che riconoscono l'influenza HA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1159">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Falcon 96-well clear flat bottom TC-treated culture microplate with Lid</td>
			<td style="width:197px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">353072</td>
			<td style="width:429px;">Assay plate use for the microneutralization assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Falcon 96-well clear V-bottom plate</td>
			<td style="width:197px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">353263</td>
			<td>Assay plate use for the hemagglutination inhibition assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">1X Minimal Essential Medium (MEM)</td>
			<td style="width:197px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11095080</td>
			<td>Infection medium</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Tosyl phenylalanyl chloromethyl (TPCK)-treated trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T8802</td>
			<td>Cleaves immature HA0 to HA1 and HA2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Biotinylated anti-NP primary antibody (IAV)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB8258B</td>
			<td>An antibody that recognizes the NP protein of influenza A viruses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Biotinylated anti-NP primary antibody (IBV)</td>
			<td style="width:197px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB8260B-5</td>
			<td>An antibody that recognizes the NP protein of influenza B viruses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Streptavidin-HRP antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">18-152</td>
			<td>This is used as a secondary antibody for the biotinylated anti-NP antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">HRP substrate (SIGMAFAST-OPD)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9187-5SET</td>
			<td>o-phenylenediamine dihydrochloride water soluble substrate for HRP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">96-well V-bottom plate</td>
			<td style="width:197px;">Nunc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">249662</td>
			<td>Assay plate used for the hemagglutination assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Chicken red blood cells</td>
			<td>Lampire Biological Laboratories</td>
			<td align="right" style="width:119px;">7201403</td>
			<td>Used to assess the ability of influenza virus to agglutinate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TRIzol</td>
			<td style="width:197px;">Ambion</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15596026</td>
			<td>Extraction of RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Superscript III</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12574018</td>
			<td>Reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:197px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28704</td>
			<td>Isolation of amplified PCR product</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11668027</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Anti-human IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-11013</td>
			<td>Fluorescent secondary antibody for human antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-11001</td>
			<td>Fluorescent secondary antibody for murine antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">6-well polystyrene microplate</td>
			<td style="width:197px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">353934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Nalgene long term storage Cryo-tubes</td>
			<td style="width:197px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">5012-0020</td>
			<td>Freezing of viral culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">reassortant A/California/04/09 (H1)</td>
			<td style="width:197px;">Palese Laboratory</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reassortant virus expressing the HA and NA of A/California/04/09 (H1N1) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">reassortant A/Shanghai/1/13 (H7)</td>
			<td style="width:197px;">Palese Laboratory</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reassortant virus expressing the HA and NA of A/Shanghai/1/13 (H7N9) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Bovine serum albumin solution (35%)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Qiagen gel extration kit</td>
			<td style="width:197px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28704</td>
			<td>Silica-membrane-based purification of DNA fragments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of escape variants of neutralizing influenza virus monoclonal antibodies

Virus influenzali esibiscono una notevole capacità di adattarsi e di eludere la risposta immunitaria. Un modo è attraverso cambiamenti antigenici che si verificano sulle glicoproteine di superficie del virus. La generazione di varianti di fuga è un metodo potente nel delucidamento come virus sfuggire rilevazione immune e nell'identificazione di residui critiche necessarie per il legame dell'anticorpo. Qui, descriviamo un protocollo su come generare varianti di fuga del virus di riossidazione A utilizzando umani o murini anticorpi monoclonali (mAbs) diretto contro il virale emoagglutinina (HA). Con l'uso della nostra tecnica, abbiamo caratterizzato precedentemente residui critici necessari per il legame degli anticorpi targeting la testa o il gambo del romanzo aviaria H7N9 HA. Il protocollo può essere facilmente adattato per altri sistemi di virus. Analisi delle varianti di fuga sono importanti per la modellazione deriva antigenica, determinazione di polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) che conferisce resistenza e fitness di virus e nella progettazione di vaccini e/o terapeutica.

In precedenza abbiamo usato variazioni di questo metodo per generare varianti di fuga di anticorpi monoclonali umani e murini indotta dal vaccino contro il virus dell'influenza stagionale, H7N9 vaccinazione o sequenziale HA DNA/ricombinante proteina vaccinazione4,5 ,6,7. Come descritto sopra, gli anticorpi sono stati caratterizzati in primo luogo utilizzando le analisi HI e microneutralization al fine di informarci del quale protocollo specifico di continuare con il prossimo4,5. Gli anticorpi 07-5D 03, 07-5F01, 07-5G 01, 07-4B03, 07-4E02 e 07-4D 05 sono stati trovati per avere attività HI e neutralizzazione contro l'aviaria H7N9 virus (A/Shanghai/1/2013) (tabella 1), e così è stato utilizzato il protocollo n. 1 (punto 2.1). Per mAbs con che attività di HI, come 41-5E04, 045-051310-2B06, 042-100809-2F04 e S6-B01 (tabella 1), la mancanza di neutralizzazione protocollo 2 (punto 2.2) è stato utilizzato per generare varianti di fuga. Il tracciato mutante fuga ha rivelato che molti degli anticorpi riconoscono residui critici in luoghi diversi sul virale HA4,5 (Figura 4). Mentre la maggior parte degli anticorpi HI-positivi hanno fuga mutante residui vicino precedentemente segnalati siti antigenici di H7 HA, gli anticorpi di HI-negativi generati mutanti di fuga con mutazioni puntiformi in fusti regione4,5 .
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anticorpo</td>
			<td>Ciao attività</td>
			<td>NEUT attività</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>03. 07-5D</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5F01</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5G 01</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4B03</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4E02</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4D 05</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>41-5E04</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>045-051310-2B06</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>042-100809-2F04</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S6-B01</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Tabella di attività dell'anticorpo di neutralizzazione e HI. Dieci mAbs H7 specifiche isolato da individui vaccinati con un vaccino sperimentale H7N9 esibiscono diversi in vitro attività antivirali5.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="4">Forward Primer (5' a 3')</td>
			<td colspan="4">Reverse Primer (5' a 3')</td>
			<td colspan="2">Condizioni di Thermocylcer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV</td>
			<td colspan="4">TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG</td>
			<td colspan="4">ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT</td>
			<td colspan="2">42 ° c per 60 min, 94 ° c per 2 min/5 cicli di 94 ° c per 20 s, 50 ° c per 30 s e 68 ° c per 3 min 30 s, seguiti da 40 cicli di 94 ° c per 20 s, 58 ° c per 30 s e 68 ° c per 3 min 30 s con un tempo di estensione finale a 68 ° c per 10 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBV</td>
			<td colspan="4">GGGGGGAGCAGAAGCAGAGC</td>
			<td colspan="4">CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC</td>
			<td colspan="2">45 ° c per 60 min, 55 ° c per 30 min, 94 ° c per 2 min/5 cicli di 94 ° c per 20 s, 40 ° c per 30 s e 68 ° c per 3 min 30 s, seguiti da 40 cicli di 94 ° c per 20 s , 58 ° c per 30 s e 68 ° c per 3 min 30 s con un tempo di estensione finale a 68 ° c per 10 min</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2: degli iniettori del virus influenzale universale. Coppie di primer per l'amplificazione dei segmenti HA di riossidazione A27 e B28 virus e loro condizioni rispettive termociclatore.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig1.jpg"> 
Figura 1: test HI. (A), A schema per l'allestimento di un test di HI verificare l'attività di due mouse H1 specifiche mAbs 7B2 (testa-specifico) e 6F12 (gambo-specifico) utilizzando una piastra a 96 pozzetti fondo V e (B), un esempio dei risultati di un test di HI23. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig2.jpg"> 
Figura 2: analisi di Microneutralization. Uno schema per l'impostazione di un saggio di microneutralization verificare l'attività di due anticorpi monoclonali umani 4 055 e CR911417. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig3.jpg"> 
Figura 3: generazione di mutanti di fuga. La metodologia suggerita sarà dipenda l'HI e l'attività di microneutralization hanno esibito dall'anticorpo. La generazione di mutanti di fuga contro (A) anticorpi neutralizzanti HI-positivi possono richiedere un singolo passaggio in uova, mentre anticorpi neutralizzanti di HI-negativo (B) possono comportare passaggi multipli con l'aumento della quantità di anticorpo in coltura del tessuto cellulare. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig4.jpg"> 
Figura 4: esempio di una mappa di epitopo del romanzo aviaria H7N9 HA generato con varianti mutante fuga. Gli anticorpi indotti dal vaccino isolato da individui vaccinati con un candidato dell'influenza H7N9 un vaccino sono stati utilizzati per generare varianti mutanti di fuga. Ogni residuo indicato in rosso rappresenta la posizione di aminoacidi critici necessari per l'associazione efficiente di un mAb. I dati sono stati adattati da Dunand-Henry et al., 20154. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Descriviamo un metodo con cui identifichiamo residui critici necessari per l'associazione di anticorpi monoclonali umani o murini destinati l'emoagglutinina virale del virus di riossidazione A. Il protocollo può essere adattato ad altre glicoproteine di superficie del virus e loro corrispondenti anticorpi neutralizzanti.

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