Name: generation of escape variants of neutralizing influenza virus monoclonal antibodies
Uploaded: 2017-08-29T13:00:00
Duration: 7 min 55 s
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このプロジェクトは、一部国立研究所のアレルギーと感染症から連邦政府の資金で賄われている、健康の国民の協会の保健社会福祉省、CEIRS の下で契約 HHSN272201400008C (f. k.);NIH の U19AI109946-01 (F. K.);P01AI097092-04S1 (P.E.L.)。

<ol>
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著者は利益相反を宣言しません。

エスケープ変異を介して特定の残基の大部分を正確にされているが、このアプローチの主な注意事項の 1 つはエスケープの亜種の点突然変異がありますは、必ずしもによって決定される抗体の分子のフット プリント内対応構造解析。これは立体配座変化の変異の残渣、アロステリック効果に類似している場所の遠位につながる特定の残基に突然変異の能力のためです。別の制限は、この方法論はの中和抗体; のみ実装できます。生体外で選択的な圧力がない抗体は変異体の脱出につながることはありません。しかし、既報の中和抗体によって生成されたエスケープ亜種のパネルを使ってこの制限を克服できます。Tan et al.は、H7N9 ウイルスに対する中和モノクローナル抗体のエスケープ バリアントを使用7非中和抗体のエピトープをマップします。
それにもかかわらず、エスケープのバリエーションの生成によって抗体のエピトープの解明装置の大規模な投資が必要どちらの結晶構造解析とクライオ電子顕微鏡への現実的な選択肢を提供します。他の選択肢は、アラニンのスキャンまたはペプチド スキャン/トランケーション変異体を用いた Mab の最小限の結合領域を決定します。突然変異誘発をスキャン アラニンは、大量のペプチド スキャンは線形エピトープ3029日のスクリーニング中にバリエーションの数が多いを生成する作業を必要があります。このプロトコルで説明されているメソッドには、特別な機器や技術が不要と実際では、既存の in vitro中和試金興味の抗体のエスケープの亜種を生成するように変更します。
(例えば、茎特異的抗体) 複数の通路が必要な生成のエスケープ バリエーションのプロトコルは開始 0 の通路で抗体濃度に大きく依存。注意の側面で誤ると抗体の半最大阻害濃度より低い半分のログにログを開始し、堅牢なウイルス増殖を可能にすることをお勧めします。研究者は、低免疫学的圧力の存在下で高価のウイルス培養がウイルスの人口に大規模な遺伝的変異があることを推測できます。次の通路に抗体濃度を徐々 に増やすことでの脱出のバリエーションを選択できます。ウイルス増殖が減少すると、イベントで前の通路で抗体濃度の同じ量を維持しながら次の文章のウイルス上清の量を増やすことができます。
万能インフルエンザ ワクチンの大半の目的は、HA の茎地域に向けて強力な抗体応答を引き出すことです。エスケープの亜種茎特異抗体の解析、インフルエンザ ウイルス適応と免疫学的圧力との関係を定義するときに重要です。興味深いことに、茎特異抗体に起因エスケープ変異ウイルスでマウス LD50研究4ですべて弱毒生体内であった。これらの研究は、予防接種の茎ベース プラットフォームの強力なケースを提供します。さらに、小分子阻害剤などの他の抗ウイルス化合物にエスケープ変異を識別するためにこのプロトコルを使用することができます。最後に、この方法論はインフルエンザ ウイルスの表面糖タンパク質に限定されていませんが、他のウイルスの糖蛋白の抗原を確認するもより広く適用できます。

他の RNA ウイルスと同様に、インフルエンザ A ウイルス抗原の亜種のレプリケーション1,2,3の各ラウンドでの多数の生成は、エラーを起こしやすいポリメラーゼが所有しています。インフルエンザ ウイルスには、適応、抗体の結合の損失につながる表面の糖蛋白質の突然変異の蓄積によって達成される抗原ドリフトを介して人間の免疫反応を回避するために驚くべき能力があります。HA とノイラミニダーゼ (NA) のウイルスの表面糖の抗原ドリフト再定式化し、毎年ワクチンを管理する必要性を必要とします。
分離と抗原特異的抗体の作製の技術の進歩は、ワクチンによる抗体4,5,6,7,8の数が多いを得られています。ターンでは、広くインフルエンザ A ウイルスを中和する抗体のエピトープの解析が格段にいくつか万能インフルエンザ ワクチン候補9,10,11,の開発 12,13,14。モノクローナル抗体の抗原の足跡を解明中和の構造の決定要因を明らかにし、ワクチンの設計の方の情報に基づいたアプローチが可能します。しかし、それは現実的なも構造的にウイルス抗原15,エピトープをマップするために x 線結晶構造解析や電子顕微鏡を介して Mab の豊富なパネルを特徴づける研究所の費用対効果16,17,18。
X 線結晶構造解析や電子顕微鏡で高価な機器、特殊な技術と可能性のあるデータを生成する時間の豊富な量が必要です。代替、高速アプローチはエラーを起こしやすい RNA 依存性を介して多様なウイルスの人口の急速な生成を利用した Mab19,20、エピトープを決定するエスケープ変異体を生成する RNA ポリメラーゼ 21,22,23。エスケープのバリエーションの生成は、特別な機器や技術は必要ありませんあり、従来実験用試薬と機器を実行できます。
ここでは、mAb のバインディングに必要な重要な残留でインフルエンザ HA を認識のマッピングでは、手法について述べる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1159">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Falcon 96-well clear flat bottom TC-treated culture microplate with Lid</td>
			<td style="width:197px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">353072</td>
			<td style="width:429px;">Assay plate use for the microneutralization assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Falcon 96-well clear V-bottom plate</td>
			<td style="width:197px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">353263</td>
			<td>Assay plate use for the hemagglutination inhibition assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">1X Minimal Essential Medium (MEM)</td>
			<td style="width:197px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11095080</td>
			<td>Infection medium</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Tosyl phenylalanyl chloromethyl (TPCK)-treated trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T8802</td>
			<td>Cleaves immature HA0 to HA1 and HA2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Biotinylated anti-NP primary antibody (IAV)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB8258B</td>
			<td>An antibody that recognizes the NP protein of influenza A viruses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Biotinylated anti-NP primary antibody (IBV)</td>
			<td style="width:197px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB8260B-5</td>
			<td>An antibody that recognizes the NP protein of influenza B viruses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Streptavidin-HRP antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">18-152</td>
			<td>This is used as a secondary antibody for the biotinylated anti-NP antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">HRP substrate (SIGMAFAST-OPD)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9187-5SET</td>
			<td>o-phenylenediamine dihydrochloride water soluble substrate for HRP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">96-well V-bottom plate</td>
			<td style="width:197px;">Nunc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">249662</td>
			<td>Assay plate used for the hemagglutination assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Chicken red blood cells</td>
			<td>Lampire Biological Laboratories</td>
			<td align="right" style="width:119px;">7201403</td>
			<td>Used to assess the ability of influenza virus to agglutinate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TRIzol</td>
			<td style="width:197px;">Ambion</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15596026</td>
			<td>Extraction of RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Superscript III</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12574018</td>
			<td>Reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:197px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28704</td>
			<td>Isolation of amplified PCR product</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11668027</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Anti-human IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-11013</td>
			<td>Fluorescent secondary antibody for human antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-11001</td>
			<td>Fluorescent secondary antibody for murine antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">6-well polystyrene microplate</td>
			<td style="width:197px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">353934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Nalgene long term storage Cryo-tubes</td>
			<td style="width:197px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">5012-0020</td>
			<td>Freezing of viral culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">reassortant A/California/04/09 (H1)</td>
			<td style="width:197px;">Palese Laboratory</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reassortant virus expressing the HA and NA of A/California/04/09 (H1N1) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">reassortant A/Shanghai/1/13 (H7)</td>
			<td style="width:197px;">Palese Laboratory</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reassortant virus expressing the HA and NA of A/Shanghai/1/13 (H7N9) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Bovine serum albumin solution (35%)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Qiagen gel extration kit</td>
			<td style="width:197px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28704</td>
			<td>Silica-membrane-based purification of DNA fragments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of escape variants of neutralizing influenza virus monoclonal antibodies

インフルエンザ ウイルスは、適応、ホストの免疫反応を回避するために驚くべき能力を展示します。1 つの方法は、ウイルスの表面糖タンパク質は、抗原の変化です。エスケープの亜種の発生は、ウイルスが免疫検出を脱出する方法の解明と抗体の結合のために必要な重要な残基を識別する強力な方法です。ここでは、ウイルスの赤血球凝集素 (HA) に対する人間やマウスのモノクローナル抗体 (Mab) を用いて A 型インフルエンザ ウイルスのエスケープの亜種を生成する方法のプロトコルについて述べる.私たちの技術を使って、私たち以前頭または、新規鳥 H7N9 HA の茎の抗体の結合のために必要な重要な残基の特徴。プロトコルは他のウイルス システムのために容易に適応することができます。エスケープの変形の解析は、抗原ドリフト、一塩基多型 (SNPs) 抵抗とウイルス フィットネスを授与の決定をモデル化するため、ワクチンや治療薬の設計は重要です。

我々 は以前エスケープの亜種季節性インフルエンザ ウイルス ワクチン、H7N9 予防接種またはシーケンシャル DNA/組換え HA タンパク質ワクチン接種4,5 による人間とマウスのモノクローナル抗体を生成するのにこのメソッドのバリエーションを使用しています。、6,7。前述のように、抗体が最初 HI と中和の試金を使用して次の4,5を続行する特定プロトコルをお知らせするために特徴付けられます。抗体 07 5 D 03、07 5F01、07 5 G 01、07 4B03、07-4E02 07-4 D 05 鳥インフルエンザ H7N9 ウイルス (A/上海/1/2013) (表 1) に対する HI と中和の活動を持つことがわかったし、こうしてプロトコル 1 (ステップ 2.1) が利用されました。41 5E04、045 051310 2B06, 042 100809 2F04 S6 B01 (表 1) などの HI 活動に欠けている、中和抗体のプロトコル 2 (手順 2.2) はエスケープの亜種を生成に使用されました。エスケープ変異のマッピングでは、抗体の多くはウイルス HA4,5 (図 4) で異なる場所に重要な残基を認識を明らかにしました。こんにちは陽性抗体の大半が、H7 HA の以前に報告された抗原部位近く突然変異体残基を脱出しながら負で HI 抗体エスケープ ポイント突然変異の突然変異体では生成、茎地域4,5.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>抗体</td>
			<td>こんにちは活動</td>
			<td>NEUT 活動</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07 5 D 03</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07 5F01</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07 5 G 01</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07 4B03</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07 4E02</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07 4 D 05</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>41 5E04</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>045 051310 2B06</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>042 100809 2F04</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S6 B01</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1:抗体 HI と中和活性のテーブル。10 H7 固有 Mab 個人実験の H7N9 ワクチン接種から分離された別の in vitro抗ウイルス活動5 を展示します。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="4">前方のプライマー (5' 3')</td>
			<td colspan="4">逆プライマー (5' 3')</td>
			<td colspan="2">Thermocylcer の条件</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV</td>
			<td colspan="4">TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG</td>
			<td colspan="4">ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT</td>
			<td colspan="2">60 分の 42 ° C、20 94 ° C 2 分/5 サイクル 94 ° C s、50 ° C で 30 秒と 3 分 30 秒 68 ° C に続いて 40 サイクル 94 ° C の 20 s、58 ° C 30 s、と 3 分 30 秒 68 ° C で 10 分間の最終延長時間、68 ° C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBV</td>
			<td colspan="4">GGGGGGAGCAGAAGCAGAGC</td>
			<td colspan="4">CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC</td>
			<td colspan="2">60 分、30 分の 55 ° C、20 94 ° C 2 分/5 サイクル 94 ° C 45 ° C s、30 ° C で 40 秒と 3 分 30 秒 68 ° C に続いて 20 94 ° C の 40 のサイクル s、58 ° C 30 秒と 3 分 30 秒 68 ° C で 10 分間の最終延長時間、68 ° C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 2: 普遍的なインフルエンザ ウイルス プライマー 。インフルエンザ A27 B28ウイルスと自分たちのそれぞれの条件の HA セグメントの増幅用プライマー。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig1.jpg"> 
図 1: こんにちはアッセイ。A (A) 図のための 2 つのマウス H1 固有 Mab 7B2 (頭固有) と 6F12 (茎固有) 96 ウェル V 底プレートと HI 法23の結果の例 (B) を使用してアクティビティをテストするのにはこんにちは試金の設定。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig2.jpg"> 
図 2: 中和アッセイ。図 2 つの人間 Mab 4 055 CR911417の活動をテストすると中和試験をセットアップのための。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig3.jpg"> 
図 3: エスケープ変異の生成します。提案手法は HI と抗体による展示と中和活性に依存になります。(A) に対してエスケープ変異の生成中和こんにちは肯定的な抗体は、(B) 中和負で HI 抗体は抗体量の増加とともに複数の通路を伴うことがあります。 一方、卵、単一通路を必要があります。細胞培養。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig4.jpg"> 
図 4: 新規鳥 H7N9 ha エスケープ変異亜種で生成されたエピトープ マップの例です。ワクチンによる抗体は H7N9 インフルエンザ ワクチンはエスケープ変異亜種を生成に使用された候補者を接種個人から分離されました。赤い表す指定した各残基、モノクローナル抗体の効率的なバインドに必要な重要なアミノ酸の位置。データはデュナン ヘンリーら2015年4から合わせられました。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

我々 は A 型インフルエンザ ウイルスのウイルスのヘマグルチニンを対象とする人間やマウスのモノクローナル抗体の結合のために必要な重要な残基を識別する手法を提案します。プロトコルは、他のウイルスの表面糖蛋白質とそれらの対応する中和抗体に適応することができます。

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Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

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