Name: generation of escape variants of neutralizing influenza virus monoclonal antibodies
Uploaded: 2017-08-29T13:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies at JoVE.com

Этот проект частично финансируется с федеральных средств от национального института аллергии и инфекционных болезней, национальные институты здравоохранения, Департамент здравоохранения и социальных служб, под CEIRS договора HHSN272201400008C (Ф.К); НИЗ U19AI109946-01 (Ф.К.); и P01AI097092-04S1 (P.E.L.).

<ol>
	<li>Shaw, M. L., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Orthomyxoviridae: the viruses and their replication. , (2013).</li><li>Nelson, M. I., Holmes, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+epidemic+influenza.">The evolution of epidemic influenza.</a> Nat Rev Genet. 8 (3), 196-205 (2007).</li><li>Lauring, A. S., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasispecies+Theory+and+the+Behavior+of+RNA+Viruses.">Quasispecies Theory and the Behavior of RNA Viruses.</a> PLoS Pathog. 6 (7), e1001005 (2010).</li><li>Henry Dunand, C. J., Leon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preexisting+human+antibodies+neutralize+recently+emerged+H7N9+influenza+strains.">Preexisting human antibodies neutralize recently emerged H7N9 influenza strains.</a> J Clin Invest. 125 (3), 1255-1268 (2015).</li><li>Dunand, C. J. H., Leon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+Neutralizing+and+Non-Neutralizing+Human+H7N9+Influenza+Vaccine-Induced+Monoclonal+Antibodies+Confer+Protection.">Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection.</a> Cell Host Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).</li><li>Tan, G. S., Lee, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Broadly+Neutralizing+Monoclonal+Antibody+That+Targets+the+Fusion+Domain+of+Group+2+Influenza+A+Virus+Hemagglutinin.">Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin.</a> J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).</li><li>Tan, G. S., Leon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadly-Reactive+Neutralizing+and+Non-neutralizing+Antibodies+Directed+against+the+H7+Influenza+Virus+Hemagglutinin+Reveal+Divergent+Mechanisms+of+Protection.">Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection.</a> PLoS Pathog. 12 (4), e1005578 (2016).</li><li>Smith, K., Garman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+fully+human+monoclonal+antibodies+specific+to+a+vaccinating+antigen.">Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen.</a> Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).</li><li>Steel, J., Lowen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+vaccine+based+on+the+conserved+hemagglutinin+stalk+domain.">Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain.</a> mBio. 1 (1), (2010).</li><li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly+protective+stalk-specific+antibodies.">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies.</a> J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).</li><li>Wang, T. T., Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+a+synthetic+peptide+from+the+influenza+virus+hemagglutinin+provides+protection+against+distinct+viral+subtypes.">Vaccination with a synthetic peptide from the influenza virus hemagglutinin provides protection against distinct viral subtypes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18979-18984 (2010).</li><li>Impagliazzo, A., Milder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+trimeric+influenza+hemagglutinin+stem+as+a+broadly+protective+immunogen.">A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen.</a> Science. 349 (6254), 1301-1306 (2015).</li><li>Krammer, F., Palese, P., Steel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Universal+Influenza+Virus+Vaccine+Design+and+Antibody+Mediated+Therapies+Based+on+Conserved+Regions+of+the+Hemagglutinin.">Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. , (2014).</li><li>Wohlbold, T. J., Nachbagauer, R., Margine, I., Tan, G. S., Hirsh, A., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+soluble+headless+hemagglutinin+protects+mice+from+challenge+with+divergent+influenza+viruses.">Vaccination with soluble headless hemagglutinin protects mice from challenge with divergent influenza viruses.</a> Vaccine. 33 (29), 3314-3321 (2015).</li><li>Ekiert, D. C., Bhabha, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope.">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324 (5924), 246-251 (2009).</li><li>Ekiert, D. C., Friesen, R. H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Highly+Conserved+Neutralizing+Epitope+on+Group+2+Influenza+A+Viruses.">A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.</a> Science. 333 (6044), 843-850 (2011).</li><li>Dreyfus, C., Laursen, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Conserved+Protective+Epitopes+on+Influenza+B+Viruses.">Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses.</a> Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).</li><li>Tran, E. E. H., Podolsky, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+Microscopy+Structures+of+Chimeric+Hemagglutinin+Displayed+on+a+Universal+Influenza+Vaccine+Candidate.">Cryo-electron Microscopy Structures of Chimeric Hemagglutinin Displayed on a Universal Influenza Vaccine Candidate.</a> mBio. 7 (2), e00257 (2016).</li><li>Wiley, D. C., Wilson, I. A., Skehel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+identification+of+the+antibody-binding+sites+of+Hong+Kong+influenza+haemagglutinin+and+their+involvement+in+antigenic+variation.">Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation.</a> Nature. 289 (5796), 373-378 (1981).</li><li>Gerhard, W., Yewdell, J., Frankel, M. E., Webster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+structure+of+influenza+virus+haemagglutinin+defined+by+hybridoma+antibodies.">Antigenic structure of influenza virus haemagglutinin defined by hybridoma antibodies.</a> Nature. 290 (5808), 713-717 (1981).</li><li>Jackson, D. C., Murray, J. M., White, D. O., Gerhard, W. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+antigenic+sites+of+influenza+virus+hemagglutinin.">Enumeration of antigenic sites of influenza virus hemagglutinin.</a> Infect Immun. 37 (3), 912-918 (1982).</li><li>Matsuzaki, Y., Sugawara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+Mapping+of+the+Hemagglutinin+Molecule+of+A/(H1N1)pdm09+Influenza+Virus+by+Using+Monoclonal+Antibody+Escape+Mutants.">Epitope Mapping of the Hemagglutinin Molecule of A/(H1N1)pdm09 Influenza Virus by Using Monoclonal Antibody Escape Mutants.</a> J Virol. 88 (21), 12364-12373 (2014).</li><li>Tan, G. S., Krammer, F., Eggink, D., Kongchanagul, A., Moran, T. M., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pan-H1+anti-hemagglutinin+monoclonal+antibody+with+potent+broad-spectrum+efficacy+in+vivo.">A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo.</a> J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).</li><li>Geneva: World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance. , (2002).</li><li>Brauer, R., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+Virus+Propagation+in+Embryonated+Chicken+Eggs.">Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs.</a> J Vis Exp. (97), e52421 (2015).</li><li>Mart&#237;nez-Sobrido, L., Garc&#237;a-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Recombinant+Influenza+Virus+from+Plasmid+DNA.">Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA.</a> J Vis Exp. (42), e2057 (2010).</li><li>Hoffmann, E., Stech, J., Guan, Y., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+primer+set+for+the+full-length+amplification+of+all+influenza+A+viruses.">Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses.</a> ArchVirol. 146 (12), 2275-2289 (2001).</li><li>Zhou, B., Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+Influenza+B+Virus+Genomic+Amplification+Facilitates+Sequencing,+Diagnostics,+and+Reverse+Genetics.">Universal Influenza B Virus Genomic Amplification Facilitates Sequencing, Diagnostics, and Reverse Genetics.</a> J Clin Microbiol. 52 (5), 1330-1337 (2014).</li><li>Sidhu, S. S., Kossiakoff, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+and+designing+protein+function+with+restricted+diversity.">Exploring and designing protein function with restricted diversity.</a> Curr Opin Chem Biol. 11, 347-354 (2007).</li><li>Chen, C. -. W., Chang, C. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+Scanning-assisted+Identification+of+a+Monoclonal+Antibody-recognized+Linear+B-cell+Epitope.">Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope.</a> J Vis Exp. (121), e55417 (2017).</li></ol>

Авторы заявляют отсутствие конфликта интересов.

Хотя большинство из остатков, выявленных через побег мутанты были точные, один из основных оговорок этого подхода является, что точечные мутации побег вариантов не может обязательно карта в молекулярных след антител определяется структурный анализ. Это из-за мутации в некоторых остатков способность привести к конформационные изменения дистальной в расположение остатков мутировал, аналогично аллостерический эффект. Другое ограничение состоит в том, что эта методология могут осуществляться только для нейтрализации антител; антитела, которые отсутствуют в vitro селективного давления не приведет к бежать мутантов. Однако это ограничение можно преодолеть с помощью группы побег вариантов, созданных ранее характеризуется нейтрализующих антител. Загар et al. бежать вариант нейтрализации МАБ H7N9 вирус используется для сопоставления epitope не нейтрализуя антитело7.
Тем не менее выяснения epitopes антитела через поколение побег вариантов обеспечивает жизнеспособную альтернативу Кристаллография и крио электронная микроскопия, оба из которых требует обширных инвестиций оборудования. Другие альтернативы, чтобы определить минимальный привязки региона mAbs с помощью аланина сканирование или пептид сканирование/усечение мутантов. Аланин, сканирование мутагенеза может потребовать значительное количество работ в генерации большое количество вариантов во время отбора29, в то время как пептид сканирование ограничивается линейной epitopes30. Метод, описанный в настоящем Протоколе не требует специального оборудования или техники, и в самом деле, делает использование существующих в vitro нейтрализации анализы изменения для создания вариантов побег антител интерес.
Протокол для создания побег вариантов, которые требуют несколько проходов (например, стебель специфические антитела) сильно зависит от начальной концентрации антител в проход 0. Лучше ошибаться в сторону осторожности и начать журнал в половину меньше половины максимальной тормозной концентрации антитела журнал и разрешить надежные вирус роста. Исследователь может предположить, что высокий титр вируса культуры при наличии иммунологической низкого давления будет иметь большой генетической вариации в вирусной популяции. Побег варианты могут быть выбраны для, постепенно увеличивая концентрация антител в следующие отрывки. В случае, если вирус роста уменьшается, количество вирусных супернатант может быть увеличена в следующий проход при сохранении такое же количество концентрации антител в предыдущем проходе.
Цель большинства универсальных противогриппозных вакцин является выявить надежный антител ответ на стебле регион HA. Анализ вариантов побег на стебле специфические антитела имеют важное значение в определении взаимоотношений между фитнес вирус гриппа и иммунологические давления. Интересно, что побег мутантов вирусов результате стебель конкретных mAbs были все ослабленных в естественных условиях в мышиных LD50 исследования4. Эти исследования дают веские основания для платформ, основанных на стебле вакцинации. Кроме того этот протокол может использоваться для идентификации побег мутантов, чтобы другие анти-вирусные соединений, например ингибиторов малые молекулы. Наконец эта методология не ограничивается гриппа вирус поверхностных гликопротеинов, но также может быть более широко применяется для определения epitopes других вирусных гликопротеинов.

Подобно другим РНК-вирусов, вирусов гриппа A обладают ошибкам полимеразы, который позволяет для генерации множества антигенные варианты с каждым раундом репликации1,2,3. Вирусом гриппа имеет удивительное способность адаптироваться и уклониться от человека иммунный ответ через антигенный дрейф, который достигается за счет накопления мутаций на поверхностных гликопротеинов, что приводит к потере антитела связывая. Антигенный дрейф вирусных поверхностных гликопротеинов, HA и нейраминидазы (NA), требует необходимость пересмотреть и администрировать вакцина ежегодно.
Технологические достижения в изоляции и поколения антиген специфические антитела дали большое количество вакцины индуцированной mAbs4,5,6,,78. В свою очередь характеристика epitopes mAbs, что широко нейтрализовать вирусы гриппа A значительно способствовало развитие нескольких универсальных гриппа вакцины кандидатов9,10,11, 12,,1314. Разъяснение антигенной след МАБ раскрывает Структурные детерминанты нейтрализации и позволяет для осознанного подхода к разработке вакцины. Однако это ни реалистичным, ни экономически эффективным для лабораторий для структурно характеризуют широкие панели mAbs через кристаллографии рентгеновского снимка или крио электронной микроскопии для того, чтобы карта epitopes антигена вирусного15, 16 , 17 , 18.
Кристаллографии рентгеновского снимка или крио электронная микроскопия требует дорогостоящего оборудования, специализированных методов и, возможно, обширные количество времени для создания данных. Быстрее и альтернативный подход является использование быстрого поколения различных вирусных населения через ошибкам РНК зависимой РНК-полимеразы для создания побег мутантов, чтобы определить epitopes mAbs19,20, 21,,22-23. Поколение побег вариантов не требует специального оборудования и техники и могут выполняться с обычными лабораторные реактивы и оборудование.
Здесь мы описываем метод, который позволяет для картирования критических для привязки МАБ остатков, которые признают гриппа ха.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1159">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Falcon 96-well clear flat bottom TC-treated culture microplate with Lid</td>
			<td style="width:197px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">353072</td>
			<td style="width:429px;">Assay plate use for the microneutralization assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Falcon 96-well clear V-bottom plate</td>
			<td style="width:197px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">353263</td>
			<td>Assay plate use for the hemagglutination inhibition assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">1X Minimal Essential Medium (MEM)</td>
			<td style="width:197px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11095080</td>
			<td>Infection medium</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Tosyl phenylalanyl chloromethyl (TPCK)-treated trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T8802</td>
			<td>Cleaves immature HA0 to HA1 and HA2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Biotinylated anti-NP primary antibody (IAV)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB8258B</td>
			<td>An antibody that recognizes the NP protein of influenza A viruses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Biotinylated anti-NP primary antibody (IBV)</td>
			<td style="width:197px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB8260B-5</td>
			<td>An antibody that recognizes the NP protein of influenza B viruses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Streptavidin-HRP antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">18-152</td>
			<td>This is used as a secondary antibody for the biotinylated anti-NP antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">HRP substrate (SIGMAFAST-OPD)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9187-5SET</td>
			<td>o-phenylenediamine dihydrochloride water soluble substrate for HRP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">96-well V-bottom plate</td>
			<td style="width:197px;">Nunc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">249662</td>
			<td>Assay plate used for the hemagglutination assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Chicken red blood cells</td>
			<td>Lampire Biological Laboratories</td>
			<td align="right" style="width:119px;">7201403</td>
			<td>Used to assess the ability of influenza virus to agglutinate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TRIzol</td>
			<td style="width:197px;">Ambion</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15596026</td>
			<td>Extraction of RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Superscript III</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12574018</td>
			<td>Reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:197px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28704</td>
			<td>Isolation of amplified PCR product</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11668027</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Anti-human IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-11013</td>
			<td>Fluorescent secondary antibody for human antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-11001</td>
			<td>Fluorescent secondary antibody for murine antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">6-well polystyrene microplate</td>
			<td style="width:197px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">353934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Nalgene long term storage Cryo-tubes</td>
			<td style="width:197px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">5012-0020</td>
			<td>Freezing of viral culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">reassortant A/California/04/09 (H1)</td>
			<td style="width:197px;">Palese Laboratory</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reassortant virus expressing the HA and NA of A/California/04/09 (H1N1) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">reassortant A/Shanghai/1/13 (H7)</td>
			<td style="width:197px;">Palese Laboratory</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reassortant virus expressing the HA and NA of A/Shanghai/1/13 (H7N9) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Bovine serum albumin solution (35%)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Qiagen gel extration kit</td>
			<td style="width:197px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28704</td>
			<td>Silica-membrane-based purification of DNA fragments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of escape variants of neutralizing influenza virus monoclonal antibodies

Вирусов гриппа обладают замечательной способностью адаптироваться и избежать иммунного ответа. Одним из способов является антигенные изменения, которые происходят на поверхности гликопротеинов вируса. Поколение побег вариантов — это мощный метод в разъяснение, как вирусы бежать иммунной обнаружения и выявления важнейших остатков, необходимых для антитела связывая. Здесь мы описываем протокол о том, как генерировать вариантов побег вируса гриппа A, используя человека или мышиных моноклональных антител (mAbs), направленных против вирусных гемагглютинина (HA). С помощью нашей техники мы ранее характеризуется критической остатков, необходимые для связывания антител, ориентация на голову или стебля Роман птичьего H7N9 га. Протокол может быть легко адаптирована для других систем вирус. Анализ вариантов побег важны для моделирования антигенный дрейф, определения единичных нуклеотидных полиморфизмов (ОНП) присвоении сопротивления и фитнес вирус и в разработке вакцин и/или терапии.

Ранее мы использовали вариации этого метода для создания побег варианты для человека и мышиных mAbs, вызванных вирус вакцины против сезонного гриппа, H7N9 вакцинации или последовательных HA ДНК/рекомбинантных белков вакцинации4,5 ,6,7. Как описано выше, антитела впервые были охарактеризованы с помощью Привет и microneutralization анализов с целью информировать нас о которых конкретного протокола продолжать с следующий4,5. Антитела 07-5D 03, 07-5F01, 07-5G 01, 07-4B03, 07-4E02 и 07-4D 05 были обнаружены Привет и нейтрализации деятельности против птичьего вируса H7N9 (A/Шанхай/1/2013) (Таблица 1), и таким образом использовался протокол 1 (шаг 2.1). Для mAbs с нейтрализации отсутствие активности Привет, например 41-5E04, 045-051310-2B06, 042-100809-2F04 и S6-B01 (Таблица 1) протокол 2 (шаг 2.2) был использован для создания вариантов побег. Побег мутант сопоставления показали, что многие из антител признать критические остатков в различных местах на вирусный HA4,5 (рис. 4). В то время как большинство HI-положительных антител у бежать мутант остатков вблизи сообщалось ранее антигенных участков H7 га, HI-отрицательных антитела сгенерирована побег мутантов с точечные мутации на стебле регион4,5 .
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Антитела</td>
			<td>Привет активность</td>
			<td>NEUT деятельность</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5D 03</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5F01</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5G 01</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4B03</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4E02</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4D 05</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>41-5E04</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>045-051310-2B06</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>042-100809-2F04</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S6-B01</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Таблица 1: Таблица антитела Привет и нейтрализации деятельности. Десять mAbs H7-конкретных, изолированных от лиц, вакциной экспериментальной H7N9 демонстрируют разные в vitro противовирусное деятельности5.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="4">Форвард грунт (5' к 3')</td>
			<td colspan="4">Обратный грунт (5' к 3')</td>
			<td colspan="2">Thermocylcer условия</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV</td>
			<td colspan="4">TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG</td>
			<td colspan="4">ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT</td>
			<td colspan="2">42 ° c 60 мин, 94 ° c на 2 мин/5 циклов 94 ° c для 20 s, 50 ºC для 30 s и 68 ºC за 3 мин 30 сек, затем 40 циклов 94 ° c для 20 s, 58 ° c за 30 s и 68 ºC за 3 мин 30 сек время окончательное расширение на 68 ° c 10 мин</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBV</td>
			<td colspan="4">GGGGGGAGCAGAAGCAGAGC</td>
			<td colspan="4">CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC</td>
			<td colspan="2">45 ºC для 60 мин, 55 ° c за 30 мин., 94 ° c на 2 мин/5 циклов 94 ° c для 20 s, 40 ºC для 30 s и 68 ºC за 3 мин 30 сек, затем 40 циклов 94 ° c для 20 s , 58 ° c за 30 сек и 68 ºC за 3 мин 30 сек время окончательное расширение на 68 ° c 10 мин</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Таблица 2: универсальный гриппа вирус грунты. Грунтовка пары для амплификации HA сегментов гриппа A27 и28 B вирусов и их соответствующих Термоциклер условий.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig1.jpg"> 
Рисунок 1: Привет пробирного. (A) A схема для установки-вверх пробирного HI для проверки деятельности двух мыши H1-конкретных mAbs 7B2 (руководитель специфические) и 6F12 (стебель специфические) с использованием 96-луночных V-днище и (B) пример результатов Привет пробирного23. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig2.jpg"> 
Рисунок 2: проба Microneutralization. Схема для создания microneutralization анализа для проверки деятельности два человека mAbs 05 4 d5 и CR911417. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig3.jpg"> 
Рисунок 3: поколение побег мутантов. Предложил методологию будет зависеть Привет и microneutralization активности, проявляемой антитела. Поколения побег мутантов против (A) нейтрализующих антител HI-положительных может потребовать одного прохода в яйцах, в то время как нейтрализующих антител HI-отрицательных (B) может включать несколько проходов с увеличением количества антител в Культура клеток тканей. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig4.jpg"> 
Рисунок 4: пример epitope составляя карту Роман птичьего H7N9 га с побега мутант варианты. Вакцины индуцированной антитела изолированы от лиц, прививки с кандидатом H7N9 гриппа, вакцины были использованы для создания побег мутант варианты. Каждый остатков указывается в красный представляет расположение важнейших аминокислот, необходимых для эффективной привязки МАБ. Данные были адаптированы с Dunand-Генри et al., 2015-4. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies at JoVE.com

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Мы описываем метод, по которому мы определить критические остатков для привязки человека или мышиных моноклональных антител, ориентированные вирусный гемагглютинин вирусов гриппа А. Этот протокол может быть адаптирована к поверхности гликопротеинов других вирусов и их соответствующих нейтрализующих антител.

Поколение побег вариантов нейтрализующих антител моноклональных вирус гриппа

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Генерация рекомбинантного вируса гриппа от ДНК плазмиды

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Выделение вариантов Fidelity РНК-содержащих вирусов и характеристика вирусов Частота мутаций

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Высокая пропускная способность Метод обнаружения для вируса гриппа

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Грипп Вирус Распространение в куриные эмбрионы

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Генерация рекомбинантного человеческого IgG моноклональных антител из иммортализованных клеток Сортировка В

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Генерация мышиных моноклональных антител с помощью гибридом технологии

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Исследования вирусов гриппа A в мышиной модели инфекции

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Измерения гриппа, нейтрализуя антитело ответы на A(H3N2) вирусов в человеческой сыворотки, Microneutralization Assays клетки с помощью MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Поколение дискриминационных человеческих моноклональных антител от редких антиген специфические клетки, циркулирующие в крови

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

Поколение моноклональных антител против натуральных продуктов

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...