Name: generation of escape variants of neutralizing influenza virus monoclonal antibodies
Uploaded: 2017-08-29T13:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies at JoVE.com

Este proyecto ha sido financiado en parte con fondos federales del Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas, institutos nacionales de salud, Departamento de salud y servicios humanos, bajo CEIRS contrato HHSN272201400008C (F.K.); U19AI109946 NIH-01 (F.K.); y P01AI097092-04S1 (P.E.L.).

<ol>
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Los autores no declaran conflictos de interés.

Aunque la mayoría de los residuos identificados a través de mutantes de escape han sido exacta, una de las principales advertencias de este enfoque es que las mutaciones de punto de variantes de escape no pueden corresponderse necesariamente dentro de la huella molecular de anticuerpos determinado por análisis estructurales. Esto es debido a la capacidad de llevar a un cambio conformacional distal a la localización de los residuos mutados, análogo a un efecto alostérico de una mutación en un determinado residuo. Otra limitación es que esta metodología puede aplicarse sólo para neutralizar anticuerpos; anticuerpos que falta en la vitro presión selectiva no dará lugar a mutantes de escape. Sin embargo, esta limitación puede superarse con el uso de un panel de variantes de escape generada anticuerpos neutralizantes previamente caracterizados. Tan et al usaron una variante de escape de un mAb neutralizante para el virus H7N9 para mapear el epitopo de un anticuerpo no neutralizante7.
Sin embargo, elucidar los epítopos de anticuerpos a través de la generación de variantes de escape proporciona una alternativa viable a la microscopía Cristalografía y cryo-electrón, los cuales requieren una gran inversión de equipo. Otras alternativas son determinar la región mínima obligatoria de mAbs utilizando a mutantes de truncamiento/escaneo escaneo o péptido alanina. Exploración de mutagénesis de la alanina puede requerir una cantidad significativa de trabajo en la generación de un gran número de variantes durante la proyección29, mientras que el análisis de péptidos se limita a epitopos lineales30. El método descrito en el presente Protocolo no requiere equipo especial o técnica y de hecho, hace uso de los existentes en vitro neutralización análisis modificados para generar variantes de escape de los anticuerpos de interés.
El protocolo para generar variantes de escape que requieren múltiples pasos (p. ej., anticuerpos específicos del tallo) es altamente dependiente de la concentración inicial de anticuerpos en el paso 0. Es mejor pecar de cauteloso y empezar en un tronco en medio un registro inferior a la concentración inhibitoria máxima media de un anticuerpo y permiten crecimiento robusto del virus. El investigador puede especular que un cultivo de virus de alto título en presencia de baja presión inmunológica tendrá una gran variación genética en la población viral. Variantes de escape pueden seleccionarse para poco a poco aumentando la concentración de anticuerpos en los siguientes pasajes. En caso de que el crecimiento del virus disminuye, la cantidad de sobrenadante viral puede incrementarse en el pasaje siguiente manteniendo la misma cantidad de la concentración de anticuerpo en el paso anterior.
El objetivo de la mayoría de vacunas contra la influenza universal es provocar una respuesta de anticuerpo robusta hacia la región del tallo de la HA. El análisis de variantes de escape a los anticuerpos específicos del tallo son importantes en la definición de la relación entre la aptitud del virus de la gripe y la presión inmunológica. Curiosamente, virus mutante de escape resultante de mAbs específicos de tallo eran todo atenuado en vivo en murinos LD50 estudios4. Estos estudios proporcionan un fuerte caso para plataformas de vacunación basada en tallo. Además, este protocolo puede utilizarse para identificar a mutantes de escape a otros compuestos anti-virales, como los inhibidores de molécula pequeña. Por último, esta metodología no se limita a glicoproteínas de superficie de virus de influenza, pero también puede aplicarse más ampliamente para determinar los epitopos de otras glicoproteínas virales.

Similar a otros virus de ARN, los virus de influenza A poseen una polimerasa propensa a errores que permite la generación de una multitud de variantes antigénicas con cada ronda de replicación1,2,3. El virus de influenza A tiene una capacidad asombrosa para adaptarse y evadir la respuesta inmune humana a través de deriva antigénica, que se logra a través de una acumulación de mutaciones en las glicoproteínas de superficie que conduce a la pérdida de unión de anticuerpos. Deriva antigénica de las glicoproteínas de superficie virales, HA y neuraminidasa (NA), exige la necesidad de reformular y administrar la vacuna anualmente.
Los avances tecnológicos en el aislamiento y la generación de anticuerpos antígeno específicos han producido un número elevado de mAbs inducida por la vacuna4,5,6,7,8. A su vez, la caracterización de los epitopos de mAbs que ampliamente neutralizar los virus de la gripe A ha ayudado grandemente el desarrollo de varios universal gripe vacuna candidatos9,10,11, 12,13,14. Dilucidar la huella antigénica de una mAb revela los determinantes estructurales de la neutralización y permite un acercamiento informado hacia el diseño de la vacuna. Sin embargo, no es ni realista ni rentable para los laboratorios caracterizar estructuralmente paneles extensos de mAbs a través de Cristalografía de rayos x o microscopia del cryo-electrón para mapa epitopos del antígeno viral15, 16 , 17 , 18.
Cristalografía de rayos x o microscopia del cryo-electrón requiere equipo costoso, técnicas especializadas y potencialmente una gran cantidad de tiempo para generar datos. Un enfoque alternativo y más rápido es la utilización de la generación rápida de diversas poblaciones virales vía el propenso RNA-dependiente polimerasa del RNA para generar mutantes de escape para determinar los epitopos de mAbs19,20, 21,22,23. La generación de variantes de escape no requiere ningún equipo especial o técnica y se puede realizar con equipos y reactivos de laboratorio convencional.
Aquí, describimos un método que permite la asignación de residuos críticos requerida para el atascamiento de mAb que reconocen la gripe HA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1159">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Falcon 96-well clear flat bottom TC-treated culture microplate with Lid</td>
			<td style="width:197px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">353072</td>
			<td style="width:429px;">Assay plate use for the microneutralization assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Falcon 96-well clear V-bottom plate</td>
			<td style="width:197px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">353263</td>
			<td>Assay plate use for the hemagglutination inhibition assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">1X Minimal Essential Medium (MEM)</td>
			<td style="width:197px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11095080</td>
			<td>Infection medium</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Tosyl phenylalanyl chloromethyl (TPCK)-treated trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T8802</td>
			<td>Cleaves immature HA0 to HA1 and HA2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Biotinylated anti-NP primary antibody (IAV)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB8258B</td>
			<td>An antibody that recognizes the NP protein of influenza A viruses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Biotinylated anti-NP primary antibody (IBV)</td>
			<td style="width:197px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB8260B-5</td>
			<td>An antibody that recognizes the NP protein of influenza B viruses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Streptavidin-HRP antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">18-152</td>
			<td>This is used as a secondary antibody for the biotinylated anti-NP antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">HRP substrate (SIGMAFAST-OPD)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9187-5SET</td>
			<td>o-phenylenediamine dihydrochloride water soluble substrate for HRP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">96-well V-bottom plate</td>
			<td style="width:197px;">Nunc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">249662</td>
			<td>Assay plate used for the hemagglutination assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Chicken red blood cells</td>
			<td>Lampire Biological Laboratories</td>
			<td align="right" style="width:119px;">7201403</td>
			<td>Used to assess the ability of influenza virus to agglutinate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TRIzol</td>
			<td style="width:197px;">Ambion</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15596026</td>
			<td>Extraction of RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Superscript III</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12574018</td>
			<td>Reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:197px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28704</td>
			<td>Isolation of amplified PCR product</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11668027</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Anti-human IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-11013</td>
			<td>Fluorescent secondary antibody for human antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-11001</td>
			<td>Fluorescent secondary antibody for murine antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">6-well polystyrene microplate</td>
			<td style="width:197px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">353934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Nalgene long term storage Cryo-tubes</td>
			<td style="width:197px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">5012-0020</td>
			<td>Freezing of viral culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">reassortant A/California/04/09 (H1)</td>
			<td style="width:197px;">Palese Laboratory</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reassortant virus expressing the HA and NA of A/California/04/09 (H1N1) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">reassortant A/Shanghai/1/13 (H7)</td>
			<td style="width:197px;">Palese Laboratory</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reassortant virus expressing the HA and NA of A/Shanghai/1/13 (H7N9) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Bovine serum albumin solution (35%)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Qiagen gel extration kit</td>
			<td style="width:197px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28704</td>
			<td>Silica-membrane-based purification of DNA fragments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of escape variants of neutralizing influenza virus monoclonal antibodies

Virus de la gripe presentan una notable capacidad para adaptarse y evadir la respuesta inmune del huésped. Una forma es a través de cambios antigénicos que se producen en las glicoproteínas de superficie del virus. La generación de variantes de escape es un método de gran alcance en la aclaración de cómo el virus escapan detección inmune y en la identificación de residuos críticos necesarios para la Unión de anticuerpos. Aquí, describimos un protocolo sobre cómo generar variantes de escape del virus de influenza A mediante la utilización de humanos o murinos anticuerpos monoclonales (mAbs) dirigido contra la hemaglutinina viral (HA). Con el uso de nuestra técnica, anteriormente caracterizamos residuos críticos para la Unión de anticuerpos a la cabeza o el tallo de la novela aviar H7N9 HA. El protocolo puede ser fácilmente adaptado para otros sistemas de virus. Análisis de variantes de escape son importantes para el modelado de deriva antigénica, determinación de polimorfismos de nucleótido único (SNPs) que confieren resistencia y aptitud del virus y en el diseño de vacunas y terapias.

Anteriormente hemos utilizado variaciones de este método para generar variantes de escape a mAbs humanos y murinos inducidos por la vacuna antigripal estacional, H7N9 vacunación o secuencial HA ADN/recombinante proteína vacunación4,5 ,6,7. Como se describió anteriormente, los anticuerpos primero se caracterizaron usando el análisis HI y microneutralización para informarnos de que protocolo específico para continuar con siguiente4,5. Anticuerpos 5D 07 03 07-5F01, 07-5G 01, 07-4B03, 07-4E02 y 07-4D 05 se encontraron actividades HI y neutralización contra el virus H7N9 aviar (A/Shanghai/1/2013) (tabla 1), y así se utilizó protocolo 1 (paso 2.1). Para mAbs con neutralizar esa falta de actividad de la HI, como 41-5E04, 045-051310-2B06, 042-100809-2F04 y S6-B01 (tabla 1), protocolo 2 (paso 2.2) se utilizó para generar variantes de escape. Asignación de mutantes de escape reveló que muchos de los anticuerpos reconocen residuos críticos en distintas localizaciones en el viral HA4,5 (figura 4). Aunque la mayoría de los anticuerpos HI-positivas han escapar residuos mutantes cerca sitios antigénicos previamente divulgados de la H7 HA, los anticuerpos HI-negativo generan a mutantes de escape con mutaciones puntuales en el pedúnculo de la región4,5 .
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anticuerpo</td>
			<td>Hola actividad</td>
			<td>Actividad NEUT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5D 03</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5F01</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5G 01</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4B03</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4E02</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4D 05</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>41-5E04</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>045-051310-2B06</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>042-100809-2F04</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S6-B01</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Tabla de anticuerpos HI y neutralización actividad. Diez mAbs específicos de H7 aisladas de individuos vacunados con una vacuna experimental del H7N9 exhiben diferentes en vitro actividades antivirales5.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="4">Primer avance (5' a 3')</td>
			<td colspan="4">Reverse Primer (5' a 3')</td>
			<td colspan="2">Condiciones de Thermocylcer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV</td>
			<td colspan="4">TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG</td>
			<td colspan="4">ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT</td>
			<td colspan="2">42 º c durante 60 min, 94 ° c por 2 min/5 ciclos de 94 º c por 20 s, 50 º c por 30 s y 68 º c durante 3 min 30 s, seguido por 40 ciclos de 94 º c por 20 s, 58 º c por 30 s y 68 º c durante 3 min 30 s con un tiempo de extensión final a 68 º c por 10 min.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBV</td>
			<td colspan="4">GGGGGGAGCAGAAGCAGAGC</td>
			<td colspan="4">CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC</td>
			<td colspan="2">45 º c por 60 min, 55 º c por 30 min, 94 ° c por 2 min/5 ciclos de 94 º c por 20 s, 40 º c por 30 s y 68 º c durante 3 min 30 s, seguido por 40 ciclos de 94 º c por 20 s , 58 º c por 30 s y 68 º c durante 3 min 30 s con un tiempo de extensión final a 68 º c por 10 min.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 2: cartillas de virus de influenza Universal. Pares de primer para la amplificación de los segmentos HA de influenza A27 y B28 virus y sus condiciones respectivas termociclador.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig1.jpg"> 
Figura 1: ensayo HI. (A) A esquema para establecer un ensayo de HI probar la actividad de dos mouse H1 específico mAbs 7B2 (específica de la cabeza) y 6F12 (tallo-específico) con una placa de 96 pocillos fondo V y (B) un ejemplo de los resultados de un ensayo de HI23. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig2.jpg"> 
Figura 2: ensayo de microneutralización. Un esquema para establecer un ensayo de microneutralización probar la actividad de dos mAbs humana 4 055 y CR911417. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig3.jpg"> 
Figura 3: generación de mutantes de escape. La metodología sugerida dependerá la HI y la actividad de microneutralización exhibida por el anticuerpo. La generación de mutantes de escape contra (A) anticuerpos neutralizantes HI-positivas pueden requerir un pasaje único en los huevos, mientras que los anticuerpos neutralizantes de HI-negativo (B) pueden implicar varios pasos con el aumento de cantidades de anticuerpos en cultivo de tejido celular. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig4.jpg"> 
Figura 4: ejemplo de un mapa del epítopo de la novela aviar H7N9 HA generado variantes mutantes de escape. Inducida por la vacuna los anticuerpos aislaron de individuos vacunados con un candidato gripe H7N9 una vacuna se utilizaron para generar variantes mutantes del escape. Cada residuo indicado en rojo representa la situación de críticas aminoácidos necesarios para la Unión eficaz de un mAb. Los datos fueron adaptados de Henry Dunand et al., 20154. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Se describe un método por el cual identificamos residuos críticos necesarios para la Unión de humanos o murinos anticuerpos monoclonales dirigidos a la hemaglutinina viral del virus de la gripe A. El protocolo puede ser adaptado a otras glicoproteínas de superficie del virus y sus correspondientes anticuerpos neutralizantes.

Generación de variantes de Escape de neutralizar anticuerpos Monoclonal del Virus de la Influenza

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Generación de anticuerpos monoclonales contra productos naturales

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