Name: generation of escape variants of neutralizing influenza virus monoclonal antibodies
Uploaded: 2017-08-29T13:00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies at JoVE.com

Detta projekt har delvis finansierats med federala medel från nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, under CEIRS kontrakt HHSN272201400008C (F.K.); NIH U19AI109946-01 (F.K.); och P01AI097092-04S1 (P.E.L.).

<ol>
	<li>Shaw, M. L., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Orthomyxoviridae: the viruses and their replication. , (2013).</li><li>Nelson, M. I., Holmes, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+epidemic+influenza.">The evolution of epidemic influenza.</a> Nat Rev Genet. 8 (3), 196-205 (2007).</li><li>Lauring, A. S., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quasispecies+Theory+and+the+Behavior+of+RNA+Viruses.">Quasispecies Theory and the Behavior of RNA Viruses.</a> PLoS Pathog. 6 (7), e1001005 (2010).</li><li>Henry Dunand, C. J., Leon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preexisting+human+antibodies+neutralize+recently+emerged+H7N9+influenza+strains.">Preexisting human antibodies neutralize recently emerged H7N9 influenza strains.</a> J Clin Invest. 125 (3), 1255-1268 (2015).</li><li>Dunand, C. J. H., Leon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+Neutralizing+and+Non-Neutralizing+Human+H7N9+Influenza+Vaccine-Induced+Monoclonal+Antibodies+Confer+Protection.">Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection.</a> Cell Host Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).</li><li>Tan, G. S., Lee, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Broadly+Neutralizing+Monoclonal+Antibody+That+Targets+the+Fusion+Domain+of+Group+2+Influenza+A+Virus+Hemagglutinin.">Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin.</a> J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).</li><li>Tan, G. S., Leon, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadly-Reactive+Neutralizing+and+Non-neutralizing+Antibodies+Directed+against+the+H7+Influenza+Virus+Hemagglutinin+Reveal+Divergent+Mechanisms+of+Protection.">Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection.</a> PLoS Pathog. 12 (4), e1005578 (2016).</li><li>Smith, K., Garman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+generation+of+fully+human+monoclonal+antibodies+specific+to+a+vaccinating+antigen.">Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen.</a> Nat Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).</li><li>Steel, J., Lowen, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+vaccine+based+on+the+conserved+hemagglutinin+stalk+domain.">Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain.</a> mBio. 1 (1), (2010).</li><li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly+protective+stalk-specific+antibodies.">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies.</a> J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).</li><li>Wang, T. T., Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+a+synthetic+peptide+from+the+influenza+virus+hemagglutinin+provides+protection+against+distinct+viral+subtypes.">Vaccination with a synthetic peptide from the influenza virus hemagglutinin provides protection against distinct viral subtypes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18979-18984 (2010).</li><li>Impagliazzo, A., Milder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+trimeric+influenza+hemagglutinin+stem+as+a+broadly+protective+immunogen.">A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen.</a> Science. 349 (6254), 1301-1306 (2015).</li><li>Krammer, F., Palese, P., Steel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Universal+Influenza+Virus+Vaccine+Design+and+Antibody+Mediated+Therapies+Based+on+Conserved+Regions+of+the+Hemagglutinin.">Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. , (2014).</li><li>Wohlbold, T. J., Nachbagauer, R., Margine, I., Tan, G. S., Hirsh, A., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vaccination+with+soluble+headless+hemagglutinin+protects+mice+from+challenge+with+divergent+influenza+viruses.">Vaccination with soluble headless hemagglutinin protects mice from challenge with divergent influenza viruses.</a> Vaccine. 33 (29), 3314-3321 (2015).</li><li>Ekiert, D. C., Bhabha, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope.">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324 (5924), 246-251 (2009).</li><li>Ekiert, D. C., Friesen, R. H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Highly+Conserved+Neutralizing+Epitope+on+Group+2+Influenza+A+Viruses.">A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses.</a> Science. 333 (6044), 843-850 (2011).</li><li>Dreyfus, C., Laursen, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Conserved+Protective+Epitopes+on+Influenza+B+Viruses.">Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses.</a> Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).</li><li>Tran, E. E. H., Podolsky, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+Microscopy+Structures+of+Chimeric+Hemagglutinin+Displayed+on+a+Universal+Influenza+Vaccine+Candidate.">Cryo-electron Microscopy Structures of Chimeric Hemagglutinin Displayed on a Universal Influenza Vaccine Candidate.</a> mBio. 7 (2), e00257 (2016).</li><li>Wiley, D. C., Wilson, I. A., Skehel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+identification+of+the+antibody-binding+sites+of+Hong+Kong+influenza+haemagglutinin+and+their+involvement+in+antigenic+variation.">Structural identification of the antibody-binding sites of Hong Kong influenza haemagglutinin and their involvement in antigenic variation.</a> Nature. 289 (5796), 373-378 (1981).</li><li>Gerhard, W., Yewdell, J., Frankel, M. E., Webster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+structure+of+influenza+virus+haemagglutinin+defined+by+hybridoma+antibodies.">Antigenic structure of influenza virus haemagglutinin defined by hybridoma antibodies.</a> Nature. 290 (5808), 713-717 (1981).</li><li>Jackson, D. C., Murray, J. M., White, D. O., Gerhard, W. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+antigenic+sites+of+influenza+virus+hemagglutinin.">Enumeration of antigenic sites of influenza virus hemagglutinin.</a> Infect Immun. 37 (3), 912-918 (1982).</li><li>Matsuzaki, Y., Sugawara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+Mapping+of+the+Hemagglutinin+Molecule+of+A/(H1N1)pdm09+Influenza+Virus+by+Using+Monoclonal+Antibody+Escape+Mutants.">Epitope Mapping of the Hemagglutinin Molecule of A/(H1N1)pdm09 Influenza Virus by Using Monoclonal Antibody Escape Mutants.</a> J Virol. 88 (21), 12364-12373 (2014).</li><li>Tan, G. S., Krammer, F., Eggink, D., Kongchanagul, A., Moran, T. M., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pan-H1+anti-hemagglutinin+monoclonal+antibody+with+potent+broad-spectrum+efficacy+in+vivo.">A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo.</a> J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).</li><li>Geneva: World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WHO manual on animal influenza diagnosis and surveillance. , (2002).</li><li>Brauer, R., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+Virus+Propagation+in+Embryonated+Chicken+Eggs.">Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs.</a> J Vis Exp. (97), e52421 (2015).</li><li>Mart&#237;nez-Sobrido, L., Garc&#237;a-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Recombinant+Influenza+Virus+from+Plasmid+DNA.">Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA.</a> J Vis Exp. (42), e2057 (2010).</li><li>Hoffmann, E., Stech, J., Guan, Y., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+primer+set+for+the+full-length+amplification+of+all+influenza+A+viruses.">Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses.</a> ArchVirol. 146 (12), 2275-2289 (2001).</li><li>Zhou, B., Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+Influenza+B+Virus+Genomic+Amplification+Facilitates+Sequencing,+Diagnostics,+and+Reverse+Genetics.">Universal Influenza B Virus Genomic Amplification Facilitates Sequencing, Diagnostics, and Reverse Genetics.</a> J Clin Microbiol. 52 (5), 1330-1337 (2014).</li><li>Sidhu, S. S., Kossiakoff, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+and+designing+protein+function+with+restricted+diversity.">Exploring and designing protein function with restricted diversity.</a> Curr Opin Chem Biol. 11, 347-354 (2007).</li><li>Chen, C. -. W., Chang, C. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+Scanning-assisted+Identification+of+a+Monoclonal+Antibody-recognized+Linear+B-cell+Epitope.">Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope.</a> J Vis Exp. (121), e55417 (2017).</li></ol>

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Även om majoriteten av rester som identifierats via escape mutants har varit korrekt, är en av de stora förbehåll av detta tillvägagångssätt att punktmutationer fly varianter inte kan nödvändigtvis karta inom molekylär fotavtryck av antikroppen som bestäms av strukturella analyser. Detta beror på en mutation på en viss restprodukt förmåga att leda till en conformationaländring distala till platsen för det muterade rest, analogt med en Alloster effekt. En annan begränsning är att denna metod endast kan genomföras för neutraliserande antikroppar. antikroppar som saknar i vitro selektionstryck leder inte fly mutanter. Men kan denna begränsning övervinnas med hjälp av en panel av fly varianter genereras av tidigare kännetecknas neutraliserande antikroppar. Tan et al. används en fly variant av en neutraliserande mAb till H7N9 virus för att mappa epitop av en icke-neutraliserande antikropp7.
Dock ger klarlägga epitoper av antikroppar genom generering av fly varianter ett lönsamt alternativ till crystallography och cryo-elektron mikroskopi, vilka båda kräver en omfattande investering i utrustning. Andra alternativ är att bestämma den minimala bindande regionen mAbs använder alanin skanning eller peptid skanning/trunkering mutanter. Alanin skanning mutagenes kan kräva en betydande mängd arbete i genererar ett stort antal varianter under screening29, medan peptid skanning är begränsad till linjär epitoper30. Den metod som beskrivs i detta protokoll kräver ingen speciell utrustning eller teknik och i själva verket använder befintliga in vitro- neutralisering analyser för att generera fly varianter av antikropparna i intresse.
Protokollet för generera fly varianter som kräver flera passager (t.ex., stjälk-specifika antikroppar) är starkt beroende av start koncentrationen av antikroppar i passage 0. Det är bättre att fela på sidan av försiktighet och börja på en logg till hälften en logg som är lägre än den halv maximal hämmande koncentrationen av en antikropp och möjliggör robust virus tillväxt. Forskaren kan spekulera att en hög titer virus kultur i närvaro av immunologiska lågtryck kommer att ha en stor genetisk variation i viral befolkningen. Fly varianter kan väljas för genom att gradvis öka antikroppkoncentrationen i de följande avsnitt. I händelse av att virus tillväxten minskar, ökas mängden viral supernatanten i nästa passage samtidigt som samma mängd antikroppskoncentrationen i tidigare passage.
Syftet med en majoritet av universal influensavaccin är att framkalla ett robust antikroppssvar mot regionen stjälk i HA. Analyser av fly varianter till stjälk-specifika antikroppar är viktiga i att definiera förhållandet mellan influensa virus fitness och immunologiska trycket. Intressant nog var fly muterade virus följd stjälk-specifika mAbs alla försvagat i vivo i murina LD50 studier4. Dessa studier ger ett starkt fall för stjälk-baserade vaccination plattformar. Detta protokoll kan dessutom användas för att identifiera escape mutants till andra anti-virala föreningar, såsom liten molekyl-hämmare. Slutligen, denna metod är inte begränsat till influensa virus ytan glykoproteiner, men också kan tillämpas mer allmänt för att avgöra epitoper av andra virus glykoproteiner.

Liknar andra RNA-virus, influensa A virus besitter en felbenägen polymeras som möjliggör generering av en mängd olika antigena varianter med varje runda av replikering1,2,3. Influensavirus A har en häpnadsväckande förmåga att anpassa sig och undvika mänsklig immunsvaret via antigendrift, som uppnås genom en ackumulation av mutationer på de ytan glykoproteiner som leder till förlust av antikropp bindande. Antigendrift av de virala ytan glykoproteiner, HA och neuraminidas (NA), kräver behovet av att omformulera och administrera vaccinet årligen.
Tekniska framsteg inom isolering och generation av antigen-specifika antikroppar har gett ett stort antal vaccin-inducerad mAbs4,5,6,7,8. I sin tur har karakterisering av epitoper av mAbs som i stort sett neutralisera influensa A virus kraftigt hjälpt utvecklingen av flera universal influensa vaccin kandidater9,10,11, 12,13,14. Belysa antigena fotavtryck av en mAb avslöjar de strukturella bestämningsfaktorerna för neutralisering och möjliggör en informerad förhållningssätt mot vaccinet design. Men är det varken realistiskt eller kostnadseffektiva för laboratorier att strukturellt karakterisera omfattande paneler av mAbs genom röntgenkristallografi eller cryo-elektronmikroskopi för att kartlägga epitoper på virusantigen15, 16 , 17 , 18.
Röntgenkristallografi eller cryo-elektronmikroskopi kräver dyr utrustning, specialiserade tekniker och potentiellt en omfattande mängd tid att generera data. En alternativ och snabbare metod är att utnyttja den snabba generationen av olika viral populationer via den felbenägna RNA-beroende RNA-polymeras att generera escape mutants för att avgöra epitoper mAbs19,20, 21,22,23. Generering av fly varianter kräver inte någon särskild utrustning eller teknik och kan utföras med konventionella laboratoriereagenser och utrustning.
Här beskriver vi en metod som möjliggör för kartläggning av kritiska restsubstanser krävs för mAb bindande som känner igen influensan HA.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1159">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Falcon 96-well clear flat bottom TC-treated culture microplate with Lid</td>
			<td style="width:197px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">353072</td>
			<td style="width:429px;">Assay plate use for the microneutralization assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Falcon 96-well clear V-bottom plate</td>
			<td style="width:197px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">353263</td>
			<td>Assay plate use for the hemagglutination inhibition assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">1X Minimal Essential Medium (MEM)</td>
			<td style="width:197px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11095080</td>
			<td>Infection medium</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Tosyl phenylalanyl chloromethyl (TPCK)-treated trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T8802</td>
			<td>Cleaves immature HA0 to HA1 and HA2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Biotinylated anti-NP primary antibody (IAV)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB8258B</td>
			<td>An antibody that recognizes the NP protein of influenza A viruses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Biotinylated anti-NP primary antibody (IBV)</td>
			<td style="width:197px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">MAB8260B-5</td>
			<td>An antibody that recognizes the NP protein of influenza B viruses</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Streptavidin-HRP antibody</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">18-152</td>
			<td>This is used as a secondary antibody for the biotinylated anti-NP antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">HRP substrate (SIGMAFAST-OPD)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9187-5SET</td>
			<td>o-phenylenediamine dihydrochloride water soluble substrate for HRP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">96-well V-bottom plate</td>
			<td style="width:197px;">Nunc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">249662</td>
			<td>Assay plate used for the hemagglutination assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Chicken red blood cells</td>
			<td>Lampire Biological Laboratories</td>
			<td align="right" style="width:119px;">7201403</td>
			<td>Used to assess the ability of influenza virus to agglutinate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">TRIzol</td>
			<td style="width:197px;">Ambion</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15596026</td>
			<td>Extraction of RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Superscript III</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">12574018</td>
			<td>Reverse transcriptase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:197px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28704</td>
			<td>Isolation of amplified PCR product</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11668027</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Anti-human IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-11013</td>
			<td>Fluorescent secondary antibody for human antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-11001</td>
			<td>Fluorescent secondary antibody for murine antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">6-well polystyrene microplate</td>
			<td style="width:197px;">Corning, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">353934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:197px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Nalgene long term storage Cryo-tubes</td>
			<td style="width:197px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">5012-0020</td>
			<td>Freezing of viral culture supernatant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">reassortant A/California/04/09 (H1)</td>
			<td style="width:197px;">Palese Laboratory</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reassortant virus expressing the HA and NA of A/California/04/09 (H1N1) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">reassortant A/Shanghai/1/13 (H7)</td>
			<td style="width:197px;">Palese Laboratory</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>reassortant virus expressing the HA and NA of A/Shanghai/1/13 (H7N9) with the internal segments of A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Bovine serum albumin solution (35%)</td>
			<td style="width:197px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:415px;">Qiagen gel extration kit</td>
			<td style="width:197px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28704</td>
			<td>Silica-membrane-based purification of DNA fragments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of escape variants of neutralizing influenza virus monoclonal antibodies

Influensavirus uppvisar en anmärkningsvärd förmåga att anpassa sig och undvika värd immunsvaret. Ett sätt är genom antigena förändringar som sker på de ytan glykoproteiner av viruset. Generering av fly varianter är en kraftfull metod att belysa hur virus undkomma immunsystemet upptäcka och identifiera kritiska restsubstanser krävs för antikropp bindande. Här beskriver vi ett protokoll på hur till generera influensa A virus fly varianter genom att utnyttja människors eller murina monoklonala antikroppar (mAbs) riktas mot den virala hemagglutinin (HA). Med hjälp av vår teknik kännetecknas vi tidigare kritiska restsubstanser krävs för bindning av antikroppar riktade antingen i huvudet eller stjälk av den romanen aviär H7N9 HA. Protokollet kan lätt anpassas för andra virus system. Analyser av fly varianter är viktiga för modellering antigendrift, att fastställa enda nukleotid polymorfismer (SNP) som ger motstånd och virus fitness, och i utformningen av vacciner och/eller therapeutics.

Vi har tidigare använt varianter av denna metod för att generera fly varianter till mänskliga och murina mAbs inducerad av säsongsbunden influensavaccin, H7N9 vaccination eller sekventiella DNA/rekombinant HA protein vaccination4,5 ,6,7. Som beskrivits ovan, präglades först antikroppar med HI och mikroneutraliserings analyserna för att informera oss om vilka specifika protokoll att fortsätta med nästa4,5. Antikroppar 07-5D 03, 07-5F01, 07-5G 01, 07-4B03, 07-4E02 och 07-4D 05 befanns ha HI och neutralisering aktiviteter mot aviär H7N9 virus (A/Shanghai/1/2013) (tabell 1), och således protokoll 1 (steg 2.1) utnyttjades. För mAbs med neutraliserande som saknar HI aktivitet, till exempel 41-5E04, 045-051310-2B06, 042-100809-2F04 och S6-B01 (tabell 1), användes protokoll 2 (steg 2.2) för att generera fly varianter. Escape mutant kartläggning visade att många av antikropparna igen kritiska rester i olika platser på viral HA4,5 (figur 4). Medan majoriteten av HI-positiva antikroppar har escape mutant rester nära tidigare rapporterade antigena platser av den H7 HA, genereras HI-negativ antikroppar escape mutants med punktmutationer i stjälken region4,5 .
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antikropp</td>
			<td>Hej aktivitet</td>
			<td>NEUT aktivitet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5D 03</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5F01</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-5G 01</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4B03</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4E02</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>07-4D 05</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>41-5E04</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>045-051310-2B06</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>042-100809-2F04</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S6-B01</td>
			<td>-</td>
			<td>+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabell 1: Tabell över antikropp HI och neutralisering aktivitet. Tio H7-specifika mAbs isolerade från individer som vaccinerats med en experimentell H7N9 vaccinet uppvisar olika in vitro- antivirala aktiviteter5.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="4">Forward Primer (5' till 3')</td>
			<td colspan="4">Reverse Primer (5' till 3')</td>
			<td colspan="2">Thermocylcer villkor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAV</td>
			<td colspan="4">TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG</td>
			<td colspan="4">ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT</td>
			<td colspan="2">42 ° c i 60 min, 94 ° c under 2 min/5 cykler på 94 ° c för 20 s, 50 ° c under 30 s och 68 ° c under 3 min 30 s, följt av 40 cykler av 94 ° c för 20 s, 58 ° c under 30 s , och 68 ° c under 3 min 30 s med en sista förlängning tid vid 68 ° c i 10 min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBV</td>
			<td colspan="4">GGGGGGAGCAGAAGCAGAGC</td>
			<td colspan="4">CCGGGTTATTAGTAGTAACAAGAGC</td>
			<td colspan="2">45 ° c under 60 min, 55 ° c under 30 min, 94 ° c under 2 min/5 cykler på 94 ° c för 20 s, 40 ° c under 30 s och 68 ° c under 3 min 30 s, följt av 40 cykler av 94 ° c för 20 s , 58 ° c under 30 s och 68 ° c under 3 min 30 s med en sista förlängning tid vid 68 ° c i 10 min</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabell 2: Universal influensa virus primers. Primer-par för förstärkning av segmenten HA influensa A27 , B28 virus och deras respektive termocyklern villkor.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig1.jpg"> 
Figur 1: HI assay. (A) A Schematisk för inställningen-upp en HI-analysen att testa två mus H1-specifika mAbs 7B2 (huvud-specifik) och 6F12 (stjälk-specifik) använder en plattan med 96 brunnar i V-botten, och (B) ett exempel på resultaten av en HI assay23verksamhet. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig2.jpg"> 
Figur 2: mikroneutraliserings-analys. En schematisk för att inrätta en mikroneutraliserings-analys att testa två mänskliga mAbs 4 d 055 och CR911417verksamhet. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig3.jpg"> 
Figur 3: Generation av escape mutants. Den metod som föreslås kommer att vara beroende av HI och aktiviteten mikroneutraliserings utställda av antikroppen. Generering av escape mutants mot (A) kan neutraliserande HI-positiva antikroppar kräva en enda passage i ägg, medan (B) neutraliserande HI-negativ antikroppar kan innebära flera passager med ökande antikropp belopp i cell vävnadskultur. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56067/56067fig4.jpg"> 
Figur 4: exempel på en epitop karta över den nya aviär H7N9 HA genereras med escape mutant varianter. Vaccininducerade antikroppar isolerade från individer som vaccinerats med en kandidat H7N9 influensa vaccin användes för att generera escape mutant varianter. Varje rester anges i rött representerar platsen för viktiga aminosyror som krävs för effektiv bindning av en mAb. Data anpassades från Dunand-Henry et al., 20154. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56067/56067fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies at JoVE.com

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Vi beskriver en metod genom vilken vi identifiera kritiska restsubstanser krävs för bindning av mänskliga eller murina monoklonala antikroppar som är riktade till den virala hemagglutinin av influensa A virus. Protokollet kan anpassas till andra virus ytan glykoproteiner och deras motsvarande neutraliserande antikroppar.

Generation av Escape varianter av neutraliserande influensa Virus monoklonala antikroppar

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Generering av Rekombinant influensavirus från Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

Isolering av Fidelity Varianter av RNA-virus och karakterisering av virus mutationsfrekvensen

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detektion Metod för Influensa Virus-

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influensa viruspropagering i embryonerade hönsägg

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Framställning av rekombinant human IgG monoklonala antikroppar från Immortaliserade Sorterat B-celler

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Generering av murina monoklonala antikroppar genom hybridomteknik

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection

Influensa A Virus studier på en musmodell av infektion

Influenza viruses cause over 500,000 deaths worldwide1 and are associated with an annual cost of 12 - 14 billion USD in the United States alone ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Mäta influensa neutraliserande antikroppen Svaren till A(H3N2) virus i Humansera av mikroneutraliserings-analyser med MDCK-SIAT1 celler

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Generation av diskriminerande humana monoklonala antikroppar från sällsynta Antigen-specifika B-celler som cirkulerar i blodet

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

Generation av monoklonala antikroppar mot naturliga produkter

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...