Name: determination of the glycogen content in cyanobacteria
Uploaded: 2017-07-17T15:00:00
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Die Autoren bestätigen die nordische Energieforschung (AquaFEED, Projekt Nr. 24), Innovationfonden Dänemark (Pant Power, Projekt Nr. 12-131844) und Villum Fonden (Projekt Nr. 13363)

1. Vorbereitung <ol><li> Cyanobakterielle Kulturen <ol><li> Wachsen Synechocystis sp. PCC 6803 bei 30 ° C in flüssigem BG11-Medium 8 , mit einer konstanten Luftzufuhr, ergänzt mit 1% (V / V) CO 2 . Beleuchten Sie die Kulturen kontinuierlich mit Licht bei einer photosynthetischen Photonenflussdichte von 50 μmol Photon / m 2 / s. </li><li> Wachsen Synechococcus sp. PCC 7002 in flüssigem A + Medium 23 (BG11-Mediu...

<ol>
	<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Entner-Doudoroff+pathway+is+an+overlooked+glycolytic+route+in+cyanobacteria+and+plants.">The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).</li><li>Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+flux+analysis+in+Synechocystis+using+isotope+distribution+from+C-13-labeled+glucose.">Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose.</a> Metab Eng. 4 (3), 202-216 (2002).</li><li>Pelroy, R. A., Levine, G. A., Bassham, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+light-dark+CO2+fixation+and+glucose+assimilation+by+Aphanocapsa+6714.">Kinetics of light-dark CO2 fixation and glucose assimilation by Aphanocapsa 6714.</a> J Bacteriol. 128, 633-643 (1976).</li><li>You, L., Berla, B., He, L., Pakrasi, H. B., Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C-MFA+delineates+the+photomixotrophic+metabolism+of+Synechocystis.+sp.+PCC+6803+under+light-+and+carbon-sufficient+conditions.">13C-MFA delineates the photomixotrophic metabolism of Synechocystis. sp. PCC 6803 under light- and carbon-sufficient conditions.</a> Biotechnol J. 9, 684-692 (2014).</li><li>Jacobsen, J. H., Frigaard, N. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+photosynthetic+mannitol+biosynthesis+from+CO2+in+a+cyanobacterium.">Engineering of photosynthetic mannitol biosynthesis from CO2 in a cyanobacterium.</a> Metab Eng. 21, 60-70 (2014).</li><li>M&#246;llers, K. B., Cannella, D., J&#248;rgensen, H., Frigaard, N. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+biomass+as+carbohydrate+and+nutrient+feedstock+for+bioethanol+production+by+yeast+fermentation.">Cyanobacterial biomass as carbohydrate and nutrient feedstock for bioethanol production by yeast fermentation.</a> Biotechnol Biofuels. 7, 64 (2014).</li><li>Angermayr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+Synechocystis.+sp.+strain+PCC+6803+with+N2+and+CO+2+in+a+diel+regime+reveals+multiphase+glycogen+dynamics+with+low+maintenance+costs.">Culturing Synechocystis. sp. strain PCC 6803 with N2 and CO 2 in a diel regime reveals multiphase glycogen dynamics with low maintenance costs.</a> Appl Environ Microbiol. 82, 4180-4189 (2016).</li><li>de Porcellinis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Non-coding+RNA+Ncr0700/PmgR1+is+required+for+photomixotrophic+growth+and+the+regulation+of+glycogen+accumulation+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The Non-coding RNA Ncr0700/PmgR1 is required for photomixotrophic growth and the regulation of glycogen accumulation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Plant Cell Physiol. 57 (10), 2091-2103 (2016).</li><li>Sakuragi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Tocopherol+plays+a+role+in+photosynthesis+and+macronutrient+homeostasis+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+that+is+independent+of+its+antioxidant+function.">alpha-Tocopherol plays a role in photosynthesis and macronutrient homeostasis of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 that is independent of its antioxidant function.</a> Plant Physiol. 141, 508-521 (2006).</li><li>Osanai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+regulation+of+sugar+catabolic+pathways+in+the+cyanobacterium+Synechocystis.+sp.+PCC+6803+by+the+group+2+sigma+factor+sigE.">Positive regulation of sugar catabolic pathways in the cyanobacterium Synechocystis. sp. PCC 6803 by the group 2 sigma factor sigE.</a> J Biol Chem. 280, 30653-30659 (2005).</li><li>Yamauchi, Y., Kaniya, Y., Kaneko, Y., Hihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+of+the+cyAbrB+transcriptional+regulator+pair+Sll0822+and+Sll0359+in+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803.">Physiological roles of the cyAbrB transcriptional regulator pair Sll0822 and Sll0359 in Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> J Bacteriol. 193, 3702-3709 (2011).</li><li>Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, J., Rebers, P., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances.">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Anal Chem. 28, 350-356 (1956).</li><li>Osanai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+group+2+{sigma}+factor+SigE+widely+activates+expressions+of+sugar+catabolic+genes+in+Synechocystis+species+PCC+6803.">Genetic engineering of group 2 {sigma} factor SigE widely activates expressions of sugar catabolic genes in Synechocystis species PCC 6803.</a> J Biol Chem. 286, 30962-30971 (2011).</li><li>Miao, X., Wu, Q., Wu, G., Zhao, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sucrose+accumulation+in+salt-stressed+cells+of+agp+gene+deletion-mutant+in+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Sucrose accumulation in salt-stressed cells of agp gene deletion-mutant in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> FEMS Microbiol Letters. 218, 71-77 (2003).</li><li>Hagemann, M., Erdmann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+pathway+of+glucosylglycerol+synthesis+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Activation and pathway of glucosylglycerol synthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Microbiology. 140, 1427-1431 (1994).</li><li>Nobles, D. R., Romanovicz, D. K., Brown, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+in+cyanobacteria.+Origin+of+vascular+plant+cellulose+synthase.">Cellulose in cyanobacteria. Origin of vascular plant cellulose synthase.</a> Plant Physiol. 127, 529-542 (2001).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+production+of+extracellular+type-I+cellulose+by+the+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+PCC+7002.">High-yield production of extracellular type-I cellulose by the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002.</a> Cell Discovery. 1, 15004 (2015).</li><li>Kawano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+accumulation+and+a+cellulose+synthase+gene+are+responsible+for+cell+aggregation+in+the+cyanobacterium+Thermosynechococcus+vulcanus+RKN.">Cellulose accumulation and a cellulose synthase gene are responsible for cell aggregation in the cyanobacterium Thermosynechococcus vulcanus RKN.</a> Plant Cell Physiol. 52, 957-966 (2011).</li><li>Angermayr, S. A., Gorchs Rovira, A., Hellingwerf, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+cyanobacteria+for+the+synthesis+of+commodity+products.">Metabolic engineering of cyanobacteria for the synthesis of commodity products.</a> Trends Biotechnol. 33, 352-361 (2015).</li><li>Zhang, B., Dhital, S., Gidley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+and+antagonistic+effects+of+&#945;-amylase+and+amyloglucosidase+on+starch+digestion.">Synergistic and antagonistic effects of &#945;-amylase and amyloglucosidase on starch digestion.</a> Biomacromolecules. 14, 1945-1954 (2013).</li><li>Harholt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARABINAN+DEFICIENT+1+is+a+putative+arabinosyltransferase+involved+in+biosynthesis+of+pectic+arabinan+in+Arabidopsis.">ARABINAN DEFICIENT 1 is a putative arabinosyltransferase involved in biosynthesis of pectic arabinan in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 140, 49-58 (2006).</li><li>Fernando, C. D., Soysa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+enzymatic+colorimetric+assay+for+determination+of+hydrogen+peroxide+(H2O2)+scavenging+activity+of+plant+extracts.">Optimized enzymatic colorimetric assay for determination of hydrogen peroxide (H2O2) scavenging activity of plant extracts.</a> MethodsX. 2, 283-291 (2015).</li><li>Jacobsen, J. H., Rosgaard, L., Sakuragi, Y., Frigaard, N. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+plasmid+construction+for+generation+of+knock-out+mutants+in+cyanobacteria:+studies+of+glycogen+metabolism+in+Synechococcus+sp+PCC+7002.">One-step plasmid construction for generation of knock-out mutants in cyanobacteria: studies of glycogen metabolism in Synechococcus sp PCC 7002.</a> Photosynth Res. 107 (2), 215-221 (2011).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophylls+and+carotenoids:+Pigments+of+photosynthetic+biomembranes.">Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes.</a> Methods Enzymol. 148, 350-382 (1987).</li><li>L&#243;pez, C. V. G., del Carmen Cer&#243;n Garc&#237;a, M., Fern&#225;ndez, F. G. A., Bustos, C. S., Chisti, Y., Sevilla, J. M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurements+of+microalgal+and+cyanobacterial+biomass.">Protein measurements of microalgal and cyanobacterial biomass.</a> Bioresource Technol. 101, 7587-7591 (2010).</li><li>Hasunuma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+metabolic+profiling+of+cyanobacterial+glycogen+biosynthesis+under+conditions+of+nitrate+depletion.">Dynamic metabolic profiling of cyanobacterial glycogen biosynthesis under conditions of nitrate depletion.</a> J Exp Bot. 64, 2943-2954 (2013).</li><li>D&#237;az-Troya, S., L&#243;pez-Maury, L., S&#225;nchez-Riego, A. M., Rold&#225;n, M., Florencio, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+glycogen+biosynthesis+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803:+Analysis+of+the+AGP+and+glycogen+synthases.">Redox regulation of glycogen biosynthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: Analysis of the AGP and glycogen synthases.</a> Molecular Plant. 7, 87-100 (2014).</li><li>Parrott, L. M., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA,+RNA+and+protein+composition+of+the+cyanobacterium+Anacystis+nidulans+grown+in+light-+and+carbon+dioxide-limited+chemostats.">The DNA, RNA and protein composition of the cyanobacterium Anacystis nidulans grown in light- and carbon dioxide-limited chemostats.</a> Arch Microbiol. 127, 53-58 (1980).</li><li>Hihara, Y., Kamei, A., Kanehisa, M., Kaplan, A., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+microarray+analysis+of+cyanobacterial+gene+expression+during+acclimation+to+high+light.">DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light.</a> Plant Cell. 13, 793-806 (2001).</li></ol>

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls sind Glykogenpräzipitation und Resuspension. Nach der Zentrifugation nach Ethanol-Präzipitation bildet Glykogen ein lichtdurchlässiges Pellet, das lose an den Wänden der Mikrozentrifugenröhrchen haftet. Daher muss beim Entfernen des Überstandes besondere Aufmerksamkeit gegeben werden, um das Pellet nicht zu entfernen. Das Glykogen-Pellet ist klebrig, und Solubilisierung kann schwierig sein, wenn es austrocknet. Man beachte, daß die vollständige Solubilisierung des Glyk...

Cyanobakterien akkumulieren Glykogen als den Hauptkohlenhydratspeicher von Kohlenstoff aus CO 2, der durch Lichtsynthese in Licht fixiert ist. Glykogen ist ein Glycan, bestehend aus linearem α-1,4-verknüpften Glucan mit Verzweigungen, die durch α-1,6-verknüpfte Glucosyl-Bindungen erzeugt werden. Die Glykogen-Biosynthese in Cyanobakterien beginnt mit der Umwandlung von Glucose-6-phosphat in ADP-Glucose durch die sequentielle Wirkung von Phosphoglucomutase und ADP-Glucose-Pyrophosphorylase. Der Glucoseanteil in ADP-Glucose wird auf das nicht-reduzierende Ende des α-1,4-Glucan-Grundgerüsts von Glykogen durch eine oder mehrere Glykogensynthasen (GlgA) übertragen. Anschließend führt eine Verzweigungsenzyme die α-1,6-verknüpfte Glucosylbindung ein, die weiter ausgedehnt wird, um das Glykogenteilchen zu erzeugen. Im Dunkeln wird Glykogen durch Glykogenphosphorylase, Glykogen-Entzweigungsenzyme, α-Glucanotransferase und Malto-Dextrin-Phosphorylase in phosphorylierte Glukose und freie Glukose abgebaut. Diese FuttermittelO katabolische Wege, einschließlich des oxidativen Pentose-Phosphat-Weges, des Embden-Meyerhof-Parnas-Weges (Glykolyse) und des Entner-Doudoroff-Weges 1 , 2 , 3 , 4 . Der Glykogen-Metabolismus in Cyanobakterien hat in den letzten Jahren zunehmend Interesse geweckt, weil Cyanobakterien die Möglichkeit haben, sich in mikrobielle Zellfabriken zu entwickeln, die von Sonnenlicht angetrieben werden, um Chemikalien und Kraftstoffe herzustellen. Der Glykogen-Stoffwechsel könnte modifiziert werden, um die Ausbeute der Produkte zu erhöhen, da Glykogen der größte flexible Kohlenstoff-Pool in diesen Bakterien ist. Ein Beispiel ist das Cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002, das genetisch hergestellt wurde, um Mannit zu produzieren; Die genetische Störung der Glykogensynthese erhöht die Mannit-Ausbeute 3-fach 5 . Ein weiteres Beispiel ist die Herstellung von Bioethanol aus Glykogen-beladenem WildtYpe Synechococcus sp. PCC 7002 6 Der Wildtyp-Zell-Glykogengehalt kann bis zu 60% des Trockengewichts der Zelle während des Stickstoff-Verhungerns 6 betragen. Unser Verständnis von Glykogenstoffwechsel und Regulierung hat sich auch in den letzten Jahren erweitert. Während Glykogen bekannt ist, sich im Licht zu akkumulieren und im Dunkeln zu kalibrieren, wurde die detaillierte Kinetik des Glykogenstoffwechsels während des Diel-Zyklus erst vor kurzem in Synechocystis sp. PCC 6803 7 . Darüber hinaus wurden mehrere Gene, die die Akkumulation von Glykogen beeinflussen, identifiziert. Ein bemerkenswertes Beispiel ist die Entdeckung, dass die mutmaßliche Histidinkinase PmgA und die nicht-kodierende RNA PmgR1 eine regulatorische Kaskade bilden und die Akkumulation von Glykogen kontrollieren. Interessanterweise sammeln die pmgA- und pmgR1- Deletionsmutanten doppelt so viel Glykogen wie der Wildtyp-Stamm von Synechocystis sp. PCC 68038 , 9 Es sind auch andere regulatorische Elemente bekannt, die die Akkumulation von Glykogen beeinflussen, einschließlich des alternativen Sigma-Faktors E und des Transkriptionsfaktors CyAbrB2 10 , 11 . Da das Interesse an der Glykogenregulation und dem Metabolismus zunimmt, ist ein detailliertes Protokoll, das die Bestimmung des Glykogengehalts beschreibt, gerechtfertigt. In der Literatur werden mehrere Methoden angewendet. Säurehydrolyse, gefolgt von der Bestimmung des Monosaccharidgehalts durch Hochdruck-Anionenaustausch-Flüssigkeitschromatographie, gekoppelt mit einem gepulsten amperometrischen Detektor oder spektrometrische Bestimmung nach Behandlungen mit Säure und Phenol, sind weit verbreitete Verfahren zur Annäherung des Glykogengehalts 9 , 10 , 12 , 13 . Allerdings ist ein Hochdruck-Anionenaustausch Flüssigkeit ChromatographieC-Instrument ist sehr teuer und unterscheidet nicht Glukose, die aus Glykogen stammt, aus jener, die von anderen glucosehaltigen Glycokonjugaten abgeleitet ist, wie Saccharose 14 , Glucosylglycerin 15 und Cellulose 16 , 17 , 18 , von denen bekannt ist, dass sie sich in einigen Cyanobakterienarten ansammeln. Das Säure-Phenol-Verfahren kann mit Standard-Laborgeräten durchgeführt werden. Allerdings verwendet es hochgiftige Reagenzien und unterscheidet nicht Glukose, die von verschiedenen Glycokonjugaten abgeleitet ist, noch unterscheidet es Glukose von anderen Monosacchariden, die zelluläre Materialien wie Glykolipide, Lipopolysaccharide und extrazelluläre Matrizen bilden 12 . Bemerkenswerterweise wird der heiße Säure-Phenol-Assay häufig für die Bestimmung des Gesamtkohlenhydratgehaltes und nicht für die spezifische Bestimmung des Glukosegehalts 12 verwendet . Enzymatische hyDie drolyse von Glykogen zu Glucose durch α-Amyloglucosidase, gefolgt von dem Nachweis von Glukose durch einen enzymgekoppelten Assay, erzeugt eine kolorimetrische Auslesung, die hochempfindlich und spezifisch für Glukose ist, die aus Glykogen gewonnen wird. Die Spezifität kann mit der bevorzugten Ausfällung von Glykogen aus Zelllysaten durch Ethanol 5 , 8 , 19 weiter verstärkt werden . Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für einen Enzym-basierten Assay des Glykogengehalts in zwei der am meisten untersuchten Cyanobakterienarten Synechocystis sp. PCC 6803 und Synechococcus sp. PCC 7002, im Wildtyp und Mutantenstämme. Um eine effiziente Hydrolyse zu gewährleisten, wird ein Cocktail aus α-Amylase und α-Amyloglucosidase verwendet 8 . Die endo-wirkende α-Amylase hydrolysiert die α-1,4-Bindungen in verschiedenen Glucanen in Dextrine, die weiter hydrolysiert werdenO Glucose durch exo-aktive α-Amyloglucosidase 20 . Die synergistischen Wirkungen dieser Enzyme sind bekannt, und diese Enzyme werden routinemäßig für die selektive Hydrolyse von Stärke verwendet, die ein α-verknüpftes Glucan wie Glykogen ist, ohne andere Glycokonjuganten wie Cellulose in der Pflanzenbiomasse 21 zu beeinflussen . Die freigesetzte Glukose wird nach einem enzymgekoppelten Assay, bestehend aus Glucoseoxidase, quantifiziert, der die Reduktion von Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid und die Oxidation von Glucose zu einer Lacton- und Peroxidase katalysiert, die einen rosafarbenen Chinoniminfarbstoff aus Wasserstoffperoxid, Eine phenolische Verbindung und 4-Aminoantipyrin 22 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="784">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">QSonica Sonicators Q700</td>
			<td style="width:219px;">Qsonica, LLC</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">QSonica</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax 190 Microplate Reader&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Eliza plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bullet Blender Storm</td>
			<td style="width:219px;">Next Advance</td>
			<td style="width:119px;">BBY24M-CE</td>
			<td>Beads beater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer</td>
			<td style="width:219px;">Amersham Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">HCl</td>
			<td style="width:219px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1-00317</td>
			<td>pH adjutment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32319</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amyloglycosidase (Rhizopus sp.)</td>
			<td style="width:219px;">Megazyme</td>
			<td style="width:119px;">E-AMGPU</td>
			<td>Enzyme for glycogen depolymerization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis)</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3176</td>
			<td>Enzyme for glycogen depolymerization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:219px;">Merch</td>
			<td style="width:119px;">8337</td>
			<td>Standard for the glucose assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pierce BCA Protein assay kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">23225</td>
			<td>For determination of protein concentrations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Aluminum drying trays, disposable</td>
			<td style="width:219px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">611-1362</td>
			<td>For determination of cell dry weights</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">D-Glucose assay kit (GODPOD format)</td>
			<td style="width:219px;">Megazyme</td>
			<td style="width:119px;">K-GLUC</td>
			<td>For determination of glucose concentrations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Zirconium oxide breads, 0.15 mm</td>
			<td style="width:219px;">Next Advance</td>
			<td style="width:119px;">ZrOB015</td>
			<td>Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">RINO tubes</td>
			<td style="width:219px;">Next Advance</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of the glycogen content in cyanobacteria

Cyanobakterien akkumulieren Glykogen als eine wichtige intrazelluläre Kohlenstoff- und Energiespeicherung während der Photosynthese. Die jüngsten Entwicklungen in der Forschung haben komplexe Mechanismen des Glykogenstoffwechsels hervorgehoben, einschließlich des Diel-Zyklus der Biosynthese und des Katabolismus, der Redoxregulation und der Beteiligung von nicht-kodierender RNA. Gleichzeitig werden Anstrengungen unternommen, um Kohlenstoff von Glykogen zu wünschenswerten Produkten in gentechnisch veränderten Cyanobakterien umzuleiten, um die Produktausbeuten zu erhöhen. Mehrere Methoden werden verwendet, um den Glykogengehalt in Cyanobakterien mit variablen Genauigkeiten und technischen Komplexitäten zu bestimmen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die zuverlässige Bestimmung des Glykogengehalts in Cyanobakterien zur Verfügung, die in einem Standard-Life-Science-Labor durchgeführt werden können. Das Protokoll beinhaltet die selektive Ausfällung von Glykogen aus dem Zelllysat und die enzymatische Depolymerisation von Glykogen zur Erzeugung von Glucose-Monomeren, die durch einen Glukoseoxyd nachgewiesen werdenIdase-Peroxidase (GOD-POD) enzymgekoppelter Assay. Die Methode wurde auf Synechocystis sp. PCC 6803 und Synechococcus sp. PCC 7002, zwei Modell-Cyanobakterienarten, die in der Stoffwechseltechnik weit verbreitet sind. Darüber hinaus zeigte das Verfahren erfolgreich Unterschiede in den Glykogeninhalten zwischen dem Wildtyp und Mutanten, die in regulatorischen Elementen oder Glykogen-Biosynthesegenen defekt sind.

10 ml Wildtyp- Synechocystis sp. PCC 6803 wurden unter photochotrophischen Bedingungen gezüchtet, bis der OD 730nm Wert etwa 0,8 erreichte. Die Zellen wurden geerntet und in 50 mM Tris-HCl, pH 8, resuspendiert. Der OD 730nm- Wert wurde auf 2-3 eingestellt. Der Glykogengehalt wurde nach dem oben beschriebenen Protokoll analysiert. Der Glykogengehalt pro OD 730 nm betrug 13 ± 1,8 μg / mL / OD 730 nm ( N = 12). Die Glykogen - ...

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Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Hier stellen wir einen zuverlässigen und einfachen Assay vor, um den Glykogengehalt in Cyanobakterienzellen zu messen. Das Verfahren beinhaltet die Ausfällung, die selektierbare Depolymerisation und den Nachweis von Glukoseresten. Diese Methode eignet sich sowohl für Wildtyp- als auch für gentechnisch veränderte Stämme und kann das metabolische Engineering von Cyanobakterien erleichtern.

Bestimmung des Glykogengehalts in Cyanobakterien

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatische Acoustic Verzicht für die serielle Verdünnung von Peptid-Agonisten im Potency Bestimmung Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Forschung

Biochemie

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Bestimmung der hochaffine Antikörper-Antigen-Bindung Kinetics mit vier Biosensorplattformen

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Hoher Durchsatz, Absolute Bestimmung des Inhalts eines ausgewählten Proteins auf Gewebe Ebenen mit quantitativen Dot Blot Analyse (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

Lipid-Index Bestimmung von flüssigen Fluoreszenz Erholung der pilzliche Erreger Ustilago Maydis

The article shows how to implement the LD index assay, which is a sensitive microplate assay to determine the accumulation of triacylglycerols (TAGs) in ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Ein kolorimetrischen Verfahren zur Messung der Eisengehalt in Pflanzen

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Photometrische Bestimmung des Cyanobakteriums Synechocystis Phycobiliprotein Inhalt

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Verwendung von hohen Gehalt Imaging zu Target Engagement in adhärenten Zellen zu quantifizieren

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Anreicherung von Ureinium Lipoprotein-Partikeln mit Mikro-RNA und anschließender Bestimmung ihrer Absolute/Relative MicroRNA-Inhalte und ihrer Celluläre Transferquote

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung der IKK-bindungsdomäne von NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

Ermöglicht Echtzeitkompensation bei schnellen photochemischen Oxidationen von Proteinen zur Bestimmung von Proteintopographie-Änderungen

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...