Name: determination of the glycogen content in cyanobacteria
Uploaded: 2017-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria at JoVE.com

המחברים מכירים במחקר Nordic Energy (AquaFEED, פרויקט מס &#39;24), Innovationfonden Denmark (Pant Power, פרויקט מס&#39; 12-131844) וווילום פונדן (פרויקט מס &#39;13363)

1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבויות Cyanobacterial <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול Synechocystis sp. PCC 6803 ב 30 מעלות צלזיוס BG11 בינוני 8 , עם אספקה ​​קבועה של אוויר בתוספת 1% (V / V) CO 2 . להאיר את התרבויות...

<ol>
	<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Entner-Doudoroff+pathway+is+an+overlooked+glycolytic+route+in+cyanobacteria+and+plants.">The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).</li><li>Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+flux+analysis+in+Synechocystis+using+isotope+distribution+from+C-13-labeled+glucose.">Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose.</a> Metab Eng. 4 (3), 202-216 (2002).</li><li>Pelroy, R. A., Levine, G. A., Bassham, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+light-dark+CO2+fixation+and+glucose+assimilation+by+Aphanocapsa+6714.">Kinetics of light-dark CO2 fixation and glucose assimilation by Aphanocapsa 6714.</a> J Bacteriol. 128, 633-643 (1976).</li><li>You, L., Berla, B., He, L., Pakrasi, H. B., Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C-MFA+delineates+the+photomixotrophic+metabolism+of+Synechocystis.+sp.+PCC+6803+under+light-+and+carbon-sufficient+conditions.">13C-MFA delineates the photomixotrophic metabolism of Synechocystis. sp. PCC 6803 under light- and carbon-sufficient conditions.</a> Biotechnol J. 9, 684-692 (2014).</li><li>Jacobsen, J. H., Frigaard, N. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+photosynthetic+mannitol+biosynthesis+from+CO2+in+a+cyanobacterium.">Engineering of photosynthetic mannitol biosynthesis from CO2 in a cyanobacterium.</a> Metab Eng. 21, 60-70 (2014).</li><li>M&#246;llers, K. B., Cannella, D., J&#248;rgensen, H., Frigaard, N. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+biomass+as+carbohydrate+and+nutrient+feedstock+for+bioethanol+production+by+yeast+fermentation.">Cyanobacterial biomass as carbohydrate and nutrient feedstock for bioethanol production by yeast fermentation.</a> Biotechnol Biofuels. 7, 64 (2014).</li><li>Angermayr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+Synechocystis.+sp.+strain+PCC+6803+with+N2+and+CO+2+in+a+diel+regime+reveals+multiphase+glycogen+dynamics+with+low+maintenance+costs.">Culturing Synechocystis. sp. strain PCC 6803 with N2 and CO 2 in a diel regime reveals multiphase glycogen dynamics with low maintenance costs.</a> Appl Environ Microbiol. 82, 4180-4189 (2016).</li><li>de Porcellinis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Non-coding+RNA+Ncr0700/PmgR1+is+required+for+photomixotrophic+growth+and+the+regulation+of+glycogen+accumulation+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The Non-coding RNA Ncr0700/PmgR1 is required for photomixotrophic growth and the regulation of glycogen accumulation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Plant Cell Physiol. 57 (10), 2091-2103 (2016).</li><li>Sakuragi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Tocopherol+plays+a+role+in+photosynthesis+and+macronutrient+homeostasis+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+that+is+independent+of+its+antioxidant+function.">alpha-Tocopherol plays a role in photosynthesis and macronutrient homeostasis of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 that is independent of its antioxidant function.</a> Plant Physiol. 141, 508-521 (2006).</li><li>Osanai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+regulation+of+sugar+catabolic+pathways+in+the+cyanobacterium+Synechocystis.+sp.+PCC+6803+by+the+group+2+sigma+factor+sigE.">Positive regulation of sugar catabolic pathways in the cyanobacterium Synechocystis. sp. PCC 6803 by the group 2 sigma factor sigE.</a> J Biol Chem. 280, 30653-30659 (2005).</li><li>Yamauchi, Y., Kaniya, Y., Kaneko, Y., Hihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+of+the+cyAbrB+transcriptional+regulator+pair+Sll0822+and+Sll0359+in+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803.">Physiological roles of the cyAbrB transcriptional regulator pair Sll0822 and Sll0359 in Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> J Bacteriol. 193, 3702-3709 (2011).</li><li>Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, J., Rebers, P., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances.">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Anal Chem. 28, 350-356 (1956).</li><li>Osanai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+group+2+{sigma}+factor+SigE+widely+activates+expressions+of+sugar+catabolic+genes+in+Synechocystis+species+PCC+6803.">Genetic engineering of group 2 {sigma} factor SigE widely activates expressions of sugar catabolic genes in Synechocystis species PCC 6803.</a> J Biol Chem. 286, 30962-30971 (2011).</li><li>Miao, X., Wu, Q., Wu, G., Zhao, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sucrose+accumulation+in+salt-stressed+cells+of+agp+gene+deletion-mutant+in+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Sucrose accumulation in salt-stressed cells of agp gene deletion-mutant in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> FEMS Microbiol Letters. 218, 71-77 (2003).</li><li>Hagemann, M., Erdmann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+pathway+of+glucosylglycerol+synthesis+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Activation and pathway of glucosylglycerol synthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Microbiology. 140, 1427-1431 (1994).</li><li>Nobles, D. R., Romanovicz, D. K., Brown, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+in+cyanobacteria.+Origin+of+vascular+plant+cellulose+synthase.">Cellulose in cyanobacteria. Origin of vascular plant cellulose synthase.</a> Plant Physiol. 127, 529-542 (2001).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+production+of+extracellular+type-I+cellulose+by+the+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+PCC+7002.">High-yield production of extracellular type-I cellulose by the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002.</a> Cell Discovery. 1, 15004 (2015).</li><li>Kawano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+accumulation+and+a+cellulose+synthase+gene+are+responsible+for+cell+aggregation+in+the+cyanobacterium+Thermosynechococcus+vulcanus+RKN.">Cellulose accumulation and a cellulose synthase gene are responsible for cell aggregation in the cyanobacterium Thermosynechococcus vulcanus RKN.</a> Plant Cell Physiol. 52, 957-966 (2011).</li><li>Angermayr, S. A., Gorchs Rovira, A., Hellingwerf, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+cyanobacteria+for+the+synthesis+of+commodity+products.">Metabolic engineering of cyanobacteria for the synthesis of commodity products.</a> Trends Biotechnol. 33, 352-361 (2015).</li><li>Zhang, B., Dhital, S., Gidley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+and+antagonistic+effects+of+&#945;-amylase+and+amyloglucosidase+on+starch+digestion.">Synergistic and antagonistic effects of &#945;-amylase and amyloglucosidase on starch digestion.</a> Biomacromolecules. 14, 1945-1954 (2013).</li><li>Harholt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARABINAN+DEFICIENT+1+is+a+putative+arabinosyltransferase+involved+in+biosynthesis+of+pectic+arabinan+in+Arabidopsis.">ARABINAN DEFICIENT 1 is a putative arabinosyltransferase involved in biosynthesis of pectic arabinan in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 140, 49-58 (2006).</li><li>Fernando, C. D., Soysa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+enzymatic+colorimetric+assay+for+determination+of+hydrogen+peroxide+(H2O2)+scavenging+activity+of+plant+extracts.">Optimized enzymatic colorimetric assay for determination of hydrogen peroxide (H2O2) scavenging activity of plant extracts.</a> MethodsX. 2, 283-291 (2015).</li><li>Jacobsen, J. H., Rosgaard, L., Sakuragi, Y., Frigaard, N. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+plasmid+construction+for+generation+of+knock-out+mutants+in+cyanobacteria:+studies+of+glycogen+metabolism+in+Synechococcus+sp+PCC+7002.">One-step plasmid construction for generation of knock-out mutants in cyanobacteria: studies of glycogen metabolism in Synechococcus sp PCC 7002.</a> Photosynth Res. 107 (2), 215-221 (2011).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophylls+and+carotenoids:+Pigments+of+photosynthetic+biomembranes.">Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes.</a> Methods Enzymol. 148, 350-382 (1987).</li><li>L&#243;pez, C. V. G., del Carmen Cer&#243;n Garc&#237;a, M., Fern&#225;ndez, F. G. A., Bustos, C. S., Chisti, Y., Sevilla, J. M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurements+of+microalgal+and+cyanobacterial+biomass.">Protein measurements of microalgal and cyanobacterial biomass.</a> Bioresource Technol. 101, 7587-7591 (2010).</li><li>Hasunuma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+metabolic+profiling+of+cyanobacterial+glycogen+biosynthesis+under+conditions+of+nitrate+depletion.">Dynamic metabolic profiling of cyanobacterial glycogen biosynthesis under conditions of nitrate depletion.</a> J Exp Bot. 64, 2943-2954 (2013).</li><li>D&#237;az-Troya, S., L&#243;pez-Maury, L., S&#225;nchez-Riego, A. M., Rold&#225;n, M., Florencio, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+glycogen+biosynthesis+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803:+Analysis+of+the+AGP+and+glycogen+synthases.">Redox regulation of glycogen biosynthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: Analysis of the AGP and glycogen synthases.</a> Molecular Plant. 7, 87-100 (2014).</li><li>Parrott, L. M., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA,+RNA+and+protein+composition+of+the+cyanobacterium+Anacystis+nidulans+grown+in+light-+and+carbon+dioxide-limited+chemostats.">The DNA, RNA and protein composition of the cyanobacterium Anacystis nidulans grown in light- and carbon dioxide-limited chemostats.</a> Arch Microbiol. 127, 53-58 (1980).</li><li>Hihara, Y., Kamei, A., Kanehisa, M., Kaplan, A., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+microarray+analysis+of+cyanobacterial+gene+expression+during+acclimation+to+high+light.">DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light.</a> Plant Cell. 13, 793-806 (2001).</li></ol>

צעדים קריטיים בפרוטוקול הם משקעים גליקוגן resuspension. לאחר צנטריפוגה לאחר משקעים אתנול, גליקוגן יוצר גלולה שקוף כי באופן רופף דבקות קירות microcentrifuge צינורות. לכן, בעת הסרת supernatant, תשומת לב מיוחדת צריך להינתן כדי לא להסיר את גלולה. גליקוגן גלולה הוא דביק, solubilization יכול להיות ק...

Cyanobacteria לצבור גליקוגן כחנות פחמימות הגדולות של פחמן מ CO 2 קבוע באור באמצעות פוטוסינתזה. גליקוגן הוא גליקן המורכב של גלוקן ליניארי α-1,4 מקושר עם סניפים שנוצרו על ידי α-1,6 המקושרים גלוקוזיל קישורים. גליקוגן ביוסינתזה ב cyanobacteria מתחיל עם ההמרה של גלוקוז -6 פוספט לתוך ADP גלוקוז דרך פעולה רציפה של phosphoglucomutase ו- ADP גלוקוז pyrophosphorylase. מחצית הגלוקוז ב- ADP-glucose מועברת לקצה הלא-מפחית של עמוד השדרה α-1,4-glucan של הגליקוגן על-ידי סינתזה של גליקוגן אחת או יותר (GlgA). לאחר מכן, אנזימים מסתעפים להציג את הקישור α-1,6 מקושר גלוקוזיל, אשר המורחבת נוספת כדי ליצור את החלקיקים גליקוגן. בחושך, גליקוגן מחולק על ידי גליקוגן phosphorylase, אנזים גליקוגן זיוף, α-glucanotransferase, ו- malto-dextrin phosphorylase לתוך גלוקוז phosphorylated גלוקוז חינם. הזנות אלה intO מסלולים קטבוליים, כולל מסלול פוספט חמצון, מסלול Embeden-Meyerhof-Parnas (glycolysis), ואת מסלול Entner-Doudoroff 1 , 2 , 3 , 4 . מטבוליזם גליקוגן ב cyanobacteria יש צבר עניין הולך וגובר בשנים האחרונות בגלל הפוטנציאל של cyanobacteria להתפתח מפעלים תא חיידקים מונע על ידי אור השמש לייצר כימיקלים ודלקים. מטבוליזם גליקוגן יכול להיות שונה כדי להגדיל את התשואה של המוצרים, כי הגליקוגן הוא מאגר פחמן גמיש הגדול ביותר בחיידקים אלה. דוגמה לכך היא cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002, אשר כבר מהונדסים גנטית לייצר mannitol; הפרעה גנטית של סינתזת הגליקוגן מגדיל את התשואה מניטול 3 פי 5 . דוגמה נוספת היא ייצור של ביואתנול מ-גליקוגן נטען wildtYe Synechococcus sp. PCC 7002 6 . תוכן גליקוגן תא wildtype עשוי להיות עד 60% מהמשקל היבש של התא במהלך רעב חנקן 6. ההבנה שלנו של מטבוליזם גליקוגן ורגולציה התרחבה גם בשנים האחרונות. בעוד גליקוגן ידוע לצבור באור להיות catabolized בחושך, קינטיקה מפורטת של מטבוליזם הגליקוגן במהלך מחזור דיל היה רק ​​לאחרונה התגלה Synechocystis sp. PCC 6803 7 . יתר על כן, כמה גנים המשפיעים על הצטברות של גליקוגן זוהו. דוגמה בולטת היא התגלית כי pingA histidine histidine ואת הלא קידוד RNA PmgR1 טופס אשד פיקוח ולשלוט על הצטברות של גליקוגן. מעניין, את pmgA ו pmgR1 מחיקת מוטציות לצבור פעמיים כמו גליקוגן כמו זן wildtype של Synechocystis sp. PCC 68038 , 9 . אלמנטים רגולטוריים אחרים ידועים גם להשפיע על הצטברות של גליקוגן, כולל אלטרנטיבה גורם סיגמא E גורם תעתיק CyAbrB2 10 , 11 . כמו עניין גליקוגן הרגולציה ומטבוליזם לגדול, פרוטוקול מפורט המתאר את קביעת התוכן הגליקוגן הוא מוצדק. מספר שיטות משמשות בספרות. חומצה hydrolysis ואחריו קביעת התוכן monosaccharide באמצעות ניתוח בלחץ גבוה אניון כרומטוגרפיה נוזלית יחד עם גלאי amperometric פעמו או קביעת ספקטרומטריים בעקבות טיפולים עם חומצה פנול נמצאים בשימוש נרחב שיטות כדי משוער תוכן הגליקוגן 9 , 10 , 12 , 13 . עם זאת, בלחץ גבוה אניון החלפת chromatographi נוזלימכשיר C הוא יקר מאוד ואינו להפלות גלוקוז נגזר גליקוגן מן הנגזר אחרים glycoconjugates המכילים גלוקוז, כגון סוכרוז 14 , glucosylglycerol 15 , תאית 16 , 17 , 18 , אשר ידועים לצבור כמה מינים cyanobacterial. השיטה חומצה פנול ניתן לבצע באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי. עם זאת, הוא משתמש ריאגנטים רעילים מאוד אינו מבחין גלוקוז נגזר glycoconjugates שונים, וגם לא להבחין גלוקוז מ monosaccharides אחרים המהווים חומרים סלולריים, כגון גליקוליפידים, lipopolysaccharides, מטריצות תאיים 12 . יש לציין כי חומצה חמה-פנול assay משמש לעתים קרובות לקביעת התוכן הכולל פחמימות ולא על הקביעה הספציפית של תוכן גלוקוז 12 . אנזימטיתDrolysis של גליקוגן לגלוקוז על ידי α-amyloglucosidase ואחריו זיהוי של גלוקוז באמצעות assay אנזים מצמידים מייצר readout colorimetric כי הוא רגיש במיוחד ספציפיים גלוקוז נגזר גליקוגן. הספציפיות יכולה להיות משופרת נוספת עם משקעים מועדפים של גליקוגן מ lysates התא על ידי אתנול 5 , 8 , 19 . כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור assay מבוסס אנזים של תכולת הגליקוגן בשני מינים cyanobacterial הנחקרים ביותר, Synechocystis sp. PCC 6803 ו- Synechococcus sp. PCC 7002, ב wildtype ו זנים מוטציה. על מנת להבטיח הידרוליזה יעילה, קוקטייל של α-amylase ו α-amyloglucosidase משמש 8 . Endo משחק α-amylase hydrolyzes את α-1,4-linkages ב glucans שונים לתוך dextrins, אשר hydrolyzed נוספתO גלוקוז על ידי exo משחק α-amyloglucosidase 20 . ההשפעות הסינרגיסטיות של אנזימים אלה ידועות היטב, ואנזימים אלה משמשים באופן שגרתי להידרוליזה סלקטיבית של עמילן, שהוא גלוקן מקושר ל- α כמו גליקוגן, מבלי להשפיע על גליקוקונג&#39;נטים אחרים, כגון תאית, ביומסה הצמחית 21 . גלוקוז משוחרר מזוהה כמותית לאחר assay אנזים מצמידים המורכב oxidase גלוקוז, אשר מזרז את הפחתת חמצן מי חמצן ואת חמצון של גלוקוז ל lactone ו peroxidase, אשר מייצרת צבע quinoneimine בצבע ורוד מי חמצן, תרכובת פנולית, ו- 4-aminoantipyrine 22 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="784">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">QSonica Sonicators Q700</td>
			<td style="width:219px;">Qsonica, LLC</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">QSonica</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax 190 Microplate Reader&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Eliza plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bullet Blender Storm</td>
			<td style="width:219px;">Next Advance</td>
			<td style="width:119px;">BBY24M-CE</td>
			<td>Beads beater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer</td>
			<td style="width:219px;">Amersham Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">HCl</td>
			<td style="width:219px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1-00317</td>
			<td>pH adjutment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32319</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amyloglycosidase (Rhizopus sp.)</td>
			<td style="width:219px;">Megazyme</td>
			<td style="width:119px;">E-AMGPU</td>
			<td>Enzyme for glycogen depolymerization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis)</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3176</td>
			<td>Enzyme for glycogen depolymerization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:219px;">Merch</td>
			<td style="width:119px;">8337</td>
			<td>Standard for the glucose assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pierce BCA Protein assay kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">23225</td>
			<td>For determination of protein concentrations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Aluminum drying trays, disposable</td>
			<td style="width:219px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">611-1362</td>
			<td>For determination of cell dry weights</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">D-Glucose assay kit (GODPOD format)</td>
			<td style="width:219px;">Megazyme</td>
			<td style="width:119px;">K-GLUC</td>
			<td>For determination of glucose concentrations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Zirconium oxide breads, 0.15 mm</td>
			<td style="width:219px;">Next Advance</td>
			<td style="width:119px;">ZrOB015</td>
			<td>Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">RINO tubes</td>
			<td style="width:219px;">Next Advance</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of the glycogen content in cyanobacteria

Cyanobacteria לצבור גליקוגן כמו פחמן תאיים הגדולות ואנרגיה אחסון במהלך פוטוסינתזה. ההתפתחויות האחרונות במחקר הדגישו מנגנונים מורכבים של מטבוליזם גליקוגן, כולל מחזור diel של biosynthesis ו catabolism, רגולציה רגולציה, ואת מעורבותם של RNA לא קידוד. במקביל, נעשים מאמצים להפנות פחמן מגליקוגן למוצרים רצויים בקיאנובקטריות מהונדסות גנטית כדי לשפר את תפוקת המוצרים. כמה שיטות משמשות כדי לקבוע את תוכן הגליקוגן ב cyanobacteria, עם משתנות משתנה המורכבות הטכנית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לקביעת אמין של תוכן הגליקוגן ב cyanobacteria כי ניתן לבצע במעבדה סטנדרטית מדעי החיים. הפרוטוקול כרוך משקעים סלקטיבי של גליקוגן מן lysate התא ואת deolymerization אנזימטי של גליקוגן לייצר מונומרים גלוקוז, אשר מזוהים על ידי גלוקוז שורIdase-peroxidase (GOD-POD) אנזים מצמידים אנזים. השיטה יושמה על Synechocystis sp. PCC 6803 ו- Synechococcus sp. PCC 7002, שני מינים cyanobacterial מודל כי נמצאים בשימוש נרחב בהנדסה מטבולית. יתר על כן, השיטה בהצלחה הראו הבדלים בתכולת הגליקוגן בין wildtype לבין מוטנטים פגומים ברכיבים רגולטוריים או גליקוגן biosynthetic גנים.

10 מ&quot;ל של wildtype Synechocystis sp. PCC 6803 גדלו בתנאים photautotrophic עד הערך 730nm OD הגיעו כ 0.8. התאים נקצרו resuspended ב 50 מ&quot;מ טריס HCl, pH 8. ערך 730nm OD הותאם 2-3. תכולת הגליקוגן נותחה בעקבות הפרוטוקול שתואר לעיל. תכולת הגליקוגן לכל 730 ננו-מטר היה 13 ± 1.8 מיקרו...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria at JoVE.com

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

כאן, אנו מציגים assay אמין וקל למדידת תוכן הגליקוגן בתאי cyanobacterial. ההליך כרוך משקעים, דה פולימריזציה לבחירה, ואיתור של שאריות גלוקוז. שיטה זו מתאימה הן wildtype והן זנים מהונדסים גנטית והוא יכול להקל על ההנדסה המטבולית של cyanobacteria.

קביעת תוכן הגליקוגן בקיאנובקטריה

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

אקוסטית אוטומטית מחלק עבור דילול סדרה של אגוניסטים פפטיד ב מבחני קביעת און

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

קביעת קינטיקה מחייב אנטיגן נוגדן גבוהה זיקה באמצעות ארבע פלטפורמות biosensor

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

תפוקה גבוהה, נחישות מוחלטת של התוכן של חלבון שנבחר ברמות רקמות באמצעות נקודה כמותיים כתם ניתוח (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

השומנים נחישות אינדקס על-ידי קרינה פלואורסצנטית נוזלי השחזור של פטריות פתוגניות זקן התירס פחמון

The article shows how to implement the LD index assay, which is a sensitive microplate assay to determine the accumulation of triacylglycerols (TAGs) in ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

שיטה ערכי צבע מוחלטים למדידת תכולת ברזל צמחים

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

קביעת spectrophotometric תוכן Phycobiliprotein Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

באמצעות תוכן גבוהה הדמיה לכמת התחייבות היעד תאים חסיד

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

העשרה של ליפופרוטאין חלקיקים מקומיים עם מיקרואורנה והקביעה הבאה של התוכן המוחלט שלהם/מיקרוליאורנה וקצב העברת הסלולר שלהם

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה של התחום המחייב של ה-IKK של נמו

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

מתן אפשרות לפיצוי בזמן אמת בחומציות פוטוכימיות מהירות של חלבונים לקביעת שינויים בטופוגרפיה של חלבונים

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...