Name: determination of the glycogen content in cyanobacteria
Uploaded: 2017-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria at JoVE.com

Forfatterne anerkjenner Nordic Energy Research (AquaFEED, prosjekt nr. 24), Innovasjonsfond Danmark (Pant Power, prosjekt nr. 12-131844) og Villum Fonden (prosjekt nr. 13363)

1. Fremstilling <ol><li> Cyanobakteriske kulturer <ol><li> Vokse synechocystis sp. PCC 6803 ved 30 ° C i flytende BG11 medium 8 , med konstant tilførsel av luft tilsatt 1% (volum / volum) CO 2 . Belyse kulturene kontinuerlig med lys på en fotosyntetisk foton flukstetthet på 50 umol fotoner / m2 / s. </li><li> Vokse synechococcus sp. PCC 7002 i flytende A + medium 23 (BG11 medium kan også brukes), med konstant ...

<ol>
	<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Entner-Doudoroff+pathway+is+an+overlooked+glycolytic+route+in+cyanobacteria+and+plants.">The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).</li><li>Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+flux+analysis+in+Synechocystis+using+isotope+distribution+from+C-13-labeled+glucose.">Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose.</a> Metab Eng. 4 (3), 202-216 (2002).</li><li>Pelroy, R. A., Levine, G. A., Bassham, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+light-dark+CO2+fixation+and+glucose+assimilation+by+Aphanocapsa+6714.">Kinetics of light-dark CO2 fixation and glucose assimilation by Aphanocapsa 6714.</a> J Bacteriol. 128, 633-643 (1976).</li><li>You, L., Berla, B., He, L., Pakrasi, H. B., Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C-MFA+delineates+the+photomixotrophic+metabolism+of+Synechocystis.+sp.+PCC+6803+under+light-+and+carbon-sufficient+conditions.">13C-MFA delineates the photomixotrophic metabolism of Synechocystis. sp. PCC 6803 under light- and carbon-sufficient conditions.</a> Biotechnol J. 9, 684-692 (2014).</li><li>Jacobsen, J. H., Frigaard, N. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+photosynthetic+mannitol+biosynthesis+from+CO2+in+a+cyanobacterium.">Engineering of photosynthetic mannitol biosynthesis from CO2 in a cyanobacterium.</a> Metab Eng. 21, 60-70 (2014).</li><li>M&#246;llers, K. B., Cannella, D., J&#248;rgensen, H., Frigaard, N. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+biomass+as+carbohydrate+and+nutrient+feedstock+for+bioethanol+production+by+yeast+fermentation.">Cyanobacterial biomass as carbohydrate and nutrient feedstock for bioethanol production by yeast fermentation.</a> Biotechnol Biofuels. 7, 64 (2014).</li><li>Angermayr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+Synechocystis.+sp.+strain+PCC+6803+with+N2+and+CO+2+in+a+diel+regime+reveals+multiphase+glycogen+dynamics+with+low+maintenance+costs.">Culturing Synechocystis. sp. strain PCC 6803 with N2 and CO 2 in a diel regime reveals multiphase glycogen dynamics with low maintenance costs.</a> Appl Environ Microbiol. 82, 4180-4189 (2016).</li><li>de Porcellinis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Non-coding+RNA+Ncr0700/PmgR1+is+required+for+photomixotrophic+growth+and+the+regulation+of+glycogen+accumulation+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The Non-coding RNA Ncr0700/PmgR1 is required for photomixotrophic growth and the regulation of glycogen accumulation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Plant Cell Physiol. 57 (10), 2091-2103 (2016).</li><li>Sakuragi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Tocopherol+plays+a+role+in+photosynthesis+and+macronutrient+homeostasis+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+that+is+independent+of+its+antioxidant+function.">alpha-Tocopherol plays a role in photosynthesis and macronutrient homeostasis of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 that is independent of its antioxidant function.</a> Plant Physiol. 141, 508-521 (2006).</li><li>Osanai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+regulation+of+sugar+catabolic+pathways+in+the+cyanobacterium+Synechocystis.+sp.+PCC+6803+by+the+group+2+sigma+factor+sigE.">Positive regulation of sugar catabolic pathways in the cyanobacterium Synechocystis. sp. PCC 6803 by the group 2 sigma factor sigE.</a> J Biol Chem. 280, 30653-30659 (2005).</li><li>Yamauchi, Y., Kaniya, Y., Kaneko, Y., Hihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+of+the+cyAbrB+transcriptional+regulator+pair+Sll0822+and+Sll0359+in+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803.">Physiological roles of the cyAbrB transcriptional regulator pair Sll0822 and Sll0359 in Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> J Bacteriol. 193, 3702-3709 (2011).</li><li>Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, J., Rebers, P., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances.">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Anal Chem. 28, 350-356 (1956).</li><li>Osanai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+group+2+{sigma}+factor+SigE+widely+activates+expressions+of+sugar+catabolic+genes+in+Synechocystis+species+PCC+6803.">Genetic engineering of group 2 {sigma} factor SigE widely activates expressions of sugar catabolic genes in Synechocystis species PCC 6803.</a> J Biol Chem. 286, 30962-30971 (2011).</li><li>Miao, X., Wu, Q., Wu, G., Zhao, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sucrose+accumulation+in+salt-stressed+cells+of+agp+gene+deletion-mutant+in+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Sucrose accumulation in salt-stressed cells of agp gene deletion-mutant in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> FEMS Microbiol Letters. 218, 71-77 (2003).</li><li>Hagemann, M., Erdmann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+pathway+of+glucosylglycerol+synthesis+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Activation and pathway of glucosylglycerol synthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Microbiology. 140, 1427-1431 (1994).</li><li>Nobles, D. R., Romanovicz, D. K., Brown, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+in+cyanobacteria.+Origin+of+vascular+plant+cellulose+synthase.">Cellulose in cyanobacteria. Origin of vascular plant cellulose synthase.</a> Plant Physiol. 127, 529-542 (2001).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+production+of+extracellular+type-I+cellulose+by+the+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+PCC+7002.">High-yield production of extracellular type-I cellulose by the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002.</a> Cell Discovery. 1, 15004 (2015).</li><li>Kawano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+accumulation+and+a+cellulose+synthase+gene+are+responsible+for+cell+aggregation+in+the+cyanobacterium+Thermosynechococcus+vulcanus+RKN.">Cellulose accumulation and a cellulose synthase gene are responsible for cell aggregation in the cyanobacterium Thermosynechococcus vulcanus RKN.</a> Plant Cell Physiol. 52, 957-966 (2011).</li><li>Angermayr, S. A., Gorchs Rovira, A., Hellingwerf, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+cyanobacteria+for+the+synthesis+of+commodity+products.">Metabolic engineering of cyanobacteria for the synthesis of commodity products.</a> Trends Biotechnol. 33, 352-361 (2015).</li><li>Zhang, B., Dhital, S., Gidley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+and+antagonistic+effects+of+&#945;-amylase+and+amyloglucosidase+on+starch+digestion.">Synergistic and antagonistic effects of &#945;-amylase and amyloglucosidase on starch digestion.</a> Biomacromolecules. 14, 1945-1954 (2013).</li><li>Harholt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARABINAN+DEFICIENT+1+is+a+putative+arabinosyltransferase+involved+in+biosynthesis+of+pectic+arabinan+in+Arabidopsis.">ARABINAN DEFICIENT 1 is a putative arabinosyltransferase involved in biosynthesis of pectic arabinan in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 140, 49-58 (2006).</li><li>Fernando, C. D., Soysa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+enzymatic+colorimetric+assay+for+determination+of+hydrogen+peroxide+(H2O2)+scavenging+activity+of+plant+extracts.">Optimized enzymatic colorimetric assay for determination of hydrogen peroxide (H2O2) scavenging activity of plant extracts.</a> MethodsX. 2, 283-291 (2015).</li><li>Jacobsen, J. H., Rosgaard, L., Sakuragi, Y., Frigaard, N. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+plasmid+construction+for+generation+of+knock-out+mutants+in+cyanobacteria:+studies+of+glycogen+metabolism+in+Synechococcus+sp+PCC+7002.">One-step plasmid construction for generation of knock-out mutants in cyanobacteria: studies of glycogen metabolism in Synechococcus sp PCC 7002.</a> Photosynth Res. 107 (2), 215-221 (2011).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophylls+and+carotenoids:+Pigments+of+photosynthetic+biomembranes.">Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes.</a> Methods Enzymol. 148, 350-382 (1987).</li><li>L&#243;pez, C. V. G., del Carmen Cer&#243;n Garc&#237;a, M., Fern&#225;ndez, F. G. A., Bustos, C. S., Chisti, Y., Sevilla, J. M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurements+of+microalgal+and+cyanobacterial+biomass.">Protein measurements of microalgal and cyanobacterial biomass.</a> Bioresource Technol. 101, 7587-7591 (2010).</li><li>Hasunuma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+metabolic+profiling+of+cyanobacterial+glycogen+biosynthesis+under+conditions+of+nitrate+depletion.">Dynamic metabolic profiling of cyanobacterial glycogen biosynthesis under conditions of nitrate depletion.</a> J Exp Bot. 64, 2943-2954 (2013).</li><li>D&#237;az-Troya, S., L&#243;pez-Maury, L., S&#225;nchez-Riego, A. M., Rold&#225;n, M., Florencio, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+glycogen+biosynthesis+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803:+Analysis+of+the+AGP+and+glycogen+synthases.">Redox regulation of glycogen biosynthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: Analysis of the AGP and glycogen synthases.</a> Molecular Plant. 7, 87-100 (2014).</li><li>Parrott, L. M., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA,+RNA+and+protein+composition+of+the+cyanobacterium+Anacystis+nidulans+grown+in+light-+and+carbon+dioxide-limited+chemostats.">The DNA, RNA and protein composition of the cyanobacterium Anacystis nidulans grown in light- and carbon dioxide-limited chemostats.</a> Arch Microbiol. 127, 53-58 (1980).</li><li>Hihara, Y., Kamei, A., Kanehisa, M., Kaplan, A., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+microarray+analysis+of+cyanobacterial+gene+expression+during+acclimation+to+high+light.">DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light.</a> Plant Cell. 13, 793-806 (2001).</li></ol>

Kritiske trinn i protokollen er glykogenutfelling og resuspensjon. Etter sentrifugering etter etanolutfelling danner glykogen en gjennomskinnelig pellet som løst adherer til veggene i mikrocentrifugerørene. Når du fjerner supernatanten, må du derfor gi spesiell oppmerksomhet for ikke å fjerne pelleten. Glykogenpelleten er klebrig, og solubilisering kan være vanskelig hvis den tørker ut. Merk at den fullstendige oppløsningen av glykogenpelletet er viktig fordi ufullstendig solubilisering vil føre til ineffektiv ...

Cyanobakterier akkumulerer glykogen som den viktigste karbohydratbutikken av karbon fra CO 2 fastgjort i lys gjennom fotosyntese. Glykogen er en glykan bestående av lineær a-1,4-koblet glukan med grener opprettet av a-1,6-koblede glukosylbindinger. Glykogenbiosyntese i cyanobakterier starter ved omdannelse av glukose-6-fosfat til ADP-glukose gjennom sekvensiell virkning av fosfoglukomutase og ADP-glukose-pyrofosforylase. Glukosedelen i ADP-glukose overføres til den ikke-reduserende enden av a-1,4-glukan-ryggradene av glykogen med en eller flere glykogensyntaser (GlgA). Deretter introduserer et forgreningsenzymer a-1,6-koblet glukosylbinding, som videre utvides til å generere glykogenpartikkelen. I mørket brytes glykogen ned av glykogenfosforylase, glykogenforgreningsenzymer, a-glukanotransferase og maltodekstrinfosforylase i fosforylert glukose og fri glukose. Disse feed intO katabolske veier, inkludert oksidativ pentosefosfatbane, Embden-Meyerhof-Parnas-vei (glykolyse) og Entner-Doudoroff-vei 1 , 2 , 3 , 4 . Glykogen metabolisme i cyanobakterier har fått økende interesse de siste årene på grunn av potensialet for cyanobakterier å utvikle seg til mikrobielle cellefabrikker drevet av sollys for å produsere kjemikalier og drivstoff. Glykogen metabolisme kan modifiseres for å øke utbyttet av produktene, fordi glykogen er det største fleksible karbonpulveret i disse bakteriene. Et eksempel er cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002, som har blitt genetisk konstruert for å produsere mannitol; Den genetiske forstyrrelsen av glykogensyntese øker mannitolutbyttet 3 ganger 5 . Et annet eksempel er produksjon av bioetanol fra glykogenbelastet wildtYpe Synechococcus sp. PCC 7002 6 . Vilttypecelleglykogeninnholdet kan være opp til 60% av tørrvekten av cellen under nitrogenhud 6 . Vår forståelse av glykogen metabolisme og regulering har også utvidet de siste årene. Selv om glykogen er kjent for å akkumulere i lyset og bli katabolisert i mørket, ble det nylig avslørt i Synechocystis sp. Detaljert kinetikk av glykogenmetabolismen under dielsyklusen. PCC 6803 7 . Videre er flere gener som påvirker akkumuleringen av glykogen blitt identifisert. Et bemerkelsesverdig eksempel er funnet at den formodede histidinkinasen PmgA og det ikke-kodende RNA PmgR1 danner en regulatorisk kaskade og kontrollerer akkumuleringen av glykogen. Interessant, akkumulerer pmgA og pmgR1 deletjonsmutanter dobbelt så mye glykogen som wildtypestammen av Synechocystis sp. PCC 68038 , 9 . Andre regulatoriske elementer er også kjent for å påvirke akkumuleringen av glykogen, inkludert den alternative sigmafaktor E og transkripsjonsfaktoren CyAbrB2 10 , 11 . Da interessen for glykogenregulering og metabolisme vokser, er en detaljert protokoll som beskriver bestemmelsen av glykogeninnholdet berettiget. Flere metoder brukes i litteraturen. Syr hydrolyse etterfulgt av bestemmelse av monosakkaridinnholdet gjennom høytrykks anionbytter-væskekromatografi koplet med en pulserende amperometrisk detektor eller spektrometrisk bestemmelse etter behandling med syre og fenol, er allment brukte metoder for tilnærming av glykogeninnholdet 9 , 10 , 12 , 13 . Imidlertid utveksler en høytrykksanion væskekromatografiC-instrumentet er svært kostbart og diskriminerer ikke glukose avledet fra glykogen fra det som er avledet fra andre glukoseholdige glykokonjugater, slik som sukrose 14 , glukosylglycerol 15 og cellulose 16 , 17 , 18 , som er kjent for å akkumulere i noen cyanobakterielle arter. Syren-fenolmetoden kan utføres ved bruk av standard laboratorieutstyr. Imidlertid bruker den høyt giftige reagenser og skiller ikke glukose fra forskjellige glykokonjugater, og det skiller heller ikke glukose fra andre monosakkarider som utgjør cellulære materialer, slik som glykolipider, lipopolysakkarider og ekstracellulære matriser 12 . Spesielt brukes det varme syre-fenol-analysen ofte for å bestemme total karbohydratinnhold i stedet for for spesifikk bestemmelse av glukoseinnhold 12 . Enzymatisk hyDrolys av glykogen til glukose ved a-amyloglukosidase etterfulgt av deteksjon av glukose gjennom et enzymkoblet assay genererer en kolorimetrisk avlesning som er svært følsom og spesifikk for glukose avledet fra glykogen. Specificiteten kan forbedres ytterligere med den foretrukne utfelling av glykogen fra cellelysater av etanol 5 , 8 , 19 . Her beskriver vi en detaljert protokoll for en enzymbasert analyse av glykogeninnholdet i to av de mest studerte cyanobakteriene, Synechocystis sp. PCC 6803 og Synechococcus sp. PCC 7002, i wildtype og mutantstammer. For å sikre effektiv hydrolyse brukes en cocktail av a-amylase og a-amyloglukosidase 8 . Den endo-virkende a-amylase hydrolyserer a-1,4-bindingene i forskjellige glukaner i dextriner, som videre hydrolyseres tO glukose ved exo-virkende a-amyloglukosidase 20 . De synergistiske effektene av disse enzymene er velkjente, og disse enzymer benyttes rutinemessig til selektiv hydrolyse av stivelse, som er et a-koblet glukan som glykogen, uten å påvirke andre glykokonjuganter, slik som cellulose, i plantebiomassen 21 . Den frigjorte glukosen detekteres kvantitativt ved å følge et enzymkoblet assay bestående av glukoseoksidase som katalyserer reduksjonen av oksygen til hydrogenperoksid og oksydasjonen av glukose til en lakton- og peroksidase-som frembringer et rosa-farget kinoniminfarve fra hydrogenperoksid, En fenolforbindelse og 4-aminoantipyrin 22 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="784">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">QSonica Sonicators Q700</td>
			<td style="width:219px;">Qsonica, LLC</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">QSonica</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax 190 Microplate Reader&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Eliza plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bullet Blender Storm</td>
			<td style="width:219px;">Next Advance</td>
			<td style="width:119px;">BBY24M-CE</td>
			<td>Beads beater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer</td>
			<td style="width:219px;">Amersham Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">HCl</td>
			<td style="width:219px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1-00317</td>
			<td>pH adjutment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32319</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amyloglycosidase (Rhizopus sp.)</td>
			<td style="width:219px;">Megazyme</td>
			<td style="width:119px;">E-AMGPU</td>
			<td>Enzyme for glycogen depolymerization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis)</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3176</td>
			<td>Enzyme for glycogen depolymerization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:219px;">Merch</td>
			<td style="width:119px;">8337</td>
			<td>Standard for the glucose assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pierce BCA Protein assay kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">23225</td>
			<td>For determination of protein concentrations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Aluminum drying trays, disposable</td>
			<td style="width:219px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">611-1362</td>
			<td>For determination of cell dry weights</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">D-Glucose assay kit (GODPOD format)</td>
			<td style="width:219px;">Megazyme</td>
			<td style="width:119px;">K-GLUC</td>
			<td>For determination of glucose concentrations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Zirconium oxide breads, 0.15 mm</td>
			<td style="width:219px;">Next Advance</td>
			<td style="width:119px;">ZrOB015</td>
			<td>Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">RINO tubes</td>
			<td style="width:219px;">Next Advance</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of the glycogen content in cyanobacteria

Cyanobakterier akkumulerer glykogen som en stor intracellulær karbon- og energilagring under fotosyntese. Nylige utviklinger i forskning har fremhevet komplekse mekanismer for glykogenmetabolisme, inkludert dielsyklusen av biosyntese og katabolisme, redoksregulering og involvering av ikke-kodende RNA. Samtidig blir det gjort anstrengelser for å omdirigere karbon fra glykogen til ønskelige produkter i genetisk utviklede cyanobakterier for å forbedre produktutbyttet. Flere metoder brukes til å bestemme glykogeninnholdet i cyanobakterier, med variabel nøyaktighet og tekniske kompleksiteter. Her gir vi en detaljert protokoll for pålitelig bestemmelse av glykogeninnholdet i cyanobakterier som kan utføres i et standard livsvitenskapslaboratorium. Protokollen innebærer selektiv utfelling av glykogen fra cellelysatet og den enzymatiske depolymerisering av glykogen for å danne glukose-monomerer, som detekteres av en glukose-oksIdase-peroxidase (GOD-POD) enzymkoblet assay. Metoden har blitt anvendt på Synechocystis sp. PCC 6803 og Synechococcus sp. PCC 7002, to modell cyanobakterielle arter som er mye brukt i metabolsk prosjektering. Videre viste fremgangsmåten med suksess forskjeller i glykogeninnholdet mellom villtype og mutanter som er defekte i regulatoriske elementer eller glykogenbiosyntetiske gener.

10 ml wildtype Synechocystis sp. PCC 6803 ble dyrket under fotoautotrofiske forhold inntil OD 730nm- verdien nådde omtrent 0,8. Cellene ble høstet og resuspendert i 50 mM Tris-HCl, pH 8. OD 730nm- verdien ble justert til 2-3. Glykogeninnholdet ble analysert ved å følge protokollen beskrevet ovenfor. Glykogeninnholdet per OD 730 nm var 13 ± 1,8 ug / ml / OD 730 nm ( N = 12). Den glykogeninnhold i forhold til proteininnhold...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria at JoVE.com

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Her presenterer vi en pålitelig og enkel analyse for å måle glykogeninnholdet i cyanobakterielle celler. Prosedyren innebærer utfelling, selekterbar depolymerisering og påvisning av glukoserester. Denne metoden er egnet for både wildtype og genetisk utviklede stammer og kan lette metabolismen av cyanobakterier.

Bestemmelse av glykogeninnholdet i cyanobakterier

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatisert Acoustic Doserings for serie Fortynning av Peptide agonister i Potens Fastsettelse Analyser

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Bestemmelse av høy-affinitets antistoff-antigen-bindingskinetikken ved hjelp av fire Biosensor plattformer

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Høy gjennomstrømning, absolutt vilje av innholdet i et valgt Protein på vev nivåer ved hjelp av kvantitative Dot Blot analyse (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

Lipid indeks fastsettelse av flytende fluorescens utvinning i Fungal patogen Ustilago Maydis

The article shows how to implement the LD index assay, which is a sensitive microplate assay to determine the accumulation of triacylglycerols (TAGs) in ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Kolorimetrisk metode for å måle jerninnhold i planter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spektrofotometri fastsettelse av Phycobiliprotein innhold i Cyanobacterium Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Bruke høyt innhold å kvantifisere målet engasjement i tilhenger celler

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Berikelse av Native lipoprotein partikler med microRNA og påfølgende fastsettelse av deres Absolute/relative microRNA innhold og deres Cellular overføringshastighet

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Produksjon, krystallisering og struktur bestemmelse av det IKK-bindende domenet til NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

Muliggjør sanntidskompensasjon i raske fotokjemiske oksidasjoner av proteiner for bestemmelse av proteintopografiendringer

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...