Name: determination of the glycogen content in cyanobacteria
Uploaded: 2017-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria at JoVE.com

Авторы признают, что Nordic Energy Research (AquaFEED, проект № 24), Innovationfonden Denmark (Pant Power, проект № 12-131844) и Villum Fonden (проект № 13363)

1. Подготовка <ol><li> Цианобактериальные культуры <ol><li> Grow Synechocystis sp. PCC 6803 при 30 ° C в жидкой среде BG11 8 с постоянной подачей воздуха, дополненной 1% (об. / Об.) CO 2 . Освещать культуры непрерывно светом при плотности фотосинтетического фотона 50 мкмоль фотон / м ...

<ol>
	<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Entner-Doudoroff+pathway+is+an+overlooked+glycolytic+route+in+cyanobacteria+and+plants.">The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).</li><li>Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+flux+analysis+in+Synechocystis+using+isotope+distribution+from+C-13-labeled+glucose.">Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose.</a> Metab Eng. 4 (3), 202-216 (2002).</li><li>Pelroy, R. A., Levine, G. A., Bassham, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+light-dark+CO2+fixation+and+glucose+assimilation+by+Aphanocapsa+6714.">Kinetics of light-dark CO2 fixation and glucose assimilation by Aphanocapsa 6714.</a> J Bacteriol. 128, 633-643 (1976).</li><li>You, L., Berla, B., He, L., Pakrasi, H. B., Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C-MFA+delineates+the+photomixotrophic+metabolism+of+Synechocystis.+sp.+PCC+6803+under+light-+and+carbon-sufficient+conditions.">13C-MFA delineates the photomixotrophic metabolism of Synechocystis. sp. PCC 6803 under light- and carbon-sufficient conditions.</a> Biotechnol J. 9, 684-692 (2014).</li><li>Jacobsen, J. H., Frigaard, N. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+photosynthetic+mannitol+biosynthesis+from+CO2+in+a+cyanobacterium.">Engineering of photosynthetic mannitol biosynthesis from CO2 in a cyanobacterium.</a> Metab Eng. 21, 60-70 (2014).</li><li>M&#246;llers, K. B., Cannella, D., J&#248;rgensen, H., Frigaard, N. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+biomass+as+carbohydrate+and+nutrient+feedstock+for+bioethanol+production+by+yeast+fermentation.">Cyanobacterial biomass as carbohydrate and nutrient feedstock for bioethanol production by yeast fermentation.</a> Biotechnol Biofuels. 7, 64 (2014).</li><li>Angermayr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+Synechocystis.+sp.+strain+PCC+6803+with+N2+and+CO+2+in+a+diel+regime+reveals+multiphase+glycogen+dynamics+with+low+maintenance+costs.">Culturing Synechocystis. sp. strain PCC 6803 with N2 and CO 2 in a diel regime reveals multiphase glycogen dynamics with low maintenance costs.</a> Appl Environ Microbiol. 82, 4180-4189 (2016).</li><li>de Porcellinis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Non-coding+RNA+Ncr0700/PmgR1+is+required+for+photomixotrophic+growth+and+the+regulation+of+glycogen+accumulation+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The Non-coding RNA Ncr0700/PmgR1 is required for photomixotrophic growth and the regulation of glycogen accumulation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Plant Cell Physiol. 57 (10), 2091-2103 (2016).</li><li>Sakuragi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Tocopherol+plays+a+role+in+photosynthesis+and+macronutrient+homeostasis+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+that+is+independent+of+its+antioxidant+function.">alpha-Tocopherol plays a role in photosynthesis and macronutrient homeostasis of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 that is independent of its antioxidant function.</a> Plant Physiol. 141, 508-521 (2006).</li><li>Osanai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+regulation+of+sugar+catabolic+pathways+in+the+cyanobacterium+Synechocystis.+sp.+PCC+6803+by+the+group+2+sigma+factor+sigE.">Positive regulation of sugar catabolic pathways in the cyanobacterium Synechocystis. sp. PCC 6803 by the group 2 sigma factor sigE.</a> J Biol Chem. 280, 30653-30659 (2005).</li><li>Yamauchi, Y., Kaniya, Y., Kaneko, Y., Hihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+of+the+cyAbrB+transcriptional+regulator+pair+Sll0822+and+Sll0359+in+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803.">Physiological roles of the cyAbrB transcriptional regulator pair Sll0822 and Sll0359 in Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> J Bacteriol. 193, 3702-3709 (2011).</li><li>Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, J., Rebers, P., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances.">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Anal Chem. 28, 350-356 (1956).</li><li>Osanai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+group+2+{sigma}+factor+SigE+widely+activates+expressions+of+sugar+catabolic+genes+in+Synechocystis+species+PCC+6803.">Genetic engineering of group 2 {sigma} factor SigE widely activates expressions of sugar catabolic genes in Synechocystis species PCC 6803.</a> J Biol Chem. 286, 30962-30971 (2011).</li><li>Miao, X., Wu, Q., Wu, G., Zhao, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sucrose+accumulation+in+salt-stressed+cells+of+agp+gene+deletion-mutant+in+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Sucrose accumulation in salt-stressed cells of agp gene deletion-mutant in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> FEMS Microbiol Letters. 218, 71-77 (2003).</li><li>Hagemann, M., Erdmann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+pathway+of+glucosylglycerol+synthesis+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Activation and pathway of glucosylglycerol synthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Microbiology. 140, 1427-1431 (1994).</li><li>Nobles, D. R., Romanovicz, D. K., Brown, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+in+cyanobacteria.+Origin+of+vascular+plant+cellulose+synthase.">Cellulose in cyanobacteria. Origin of vascular plant cellulose synthase.</a> Plant Physiol. 127, 529-542 (2001).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+production+of+extracellular+type-I+cellulose+by+the+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+PCC+7002.">High-yield production of extracellular type-I cellulose by the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002.</a> Cell Discovery. 1, 15004 (2015).</li><li>Kawano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+accumulation+and+a+cellulose+synthase+gene+are+responsible+for+cell+aggregation+in+the+cyanobacterium+Thermosynechococcus+vulcanus+RKN.">Cellulose accumulation and a cellulose synthase gene are responsible for cell aggregation in the cyanobacterium Thermosynechococcus vulcanus RKN.</a> Plant Cell Physiol. 52, 957-966 (2011).</li><li>Angermayr, S. A., Gorchs Rovira, A., Hellingwerf, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+cyanobacteria+for+the+synthesis+of+commodity+products.">Metabolic engineering of cyanobacteria for the synthesis of commodity products.</a> Trends Biotechnol. 33, 352-361 (2015).</li><li>Zhang, B., Dhital, S., Gidley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+and+antagonistic+effects+of+&#945;-amylase+and+amyloglucosidase+on+starch+digestion.">Synergistic and antagonistic effects of &#945;-amylase and amyloglucosidase on starch digestion.</a> Biomacromolecules. 14, 1945-1954 (2013).</li><li>Harholt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARABINAN+DEFICIENT+1+is+a+putative+arabinosyltransferase+involved+in+biosynthesis+of+pectic+arabinan+in+Arabidopsis.">ARABINAN DEFICIENT 1 is a putative arabinosyltransferase involved in biosynthesis of pectic arabinan in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 140, 49-58 (2006).</li><li>Fernando, C. D., Soysa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+enzymatic+colorimetric+assay+for+determination+of+hydrogen+peroxide+(H2O2)+scavenging+activity+of+plant+extracts.">Optimized enzymatic colorimetric assay for determination of hydrogen peroxide (H2O2) scavenging activity of plant extracts.</a> MethodsX. 2, 283-291 (2015).</li><li>Jacobsen, J. H., Rosgaard, L., Sakuragi, Y., Frigaard, N. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+plasmid+construction+for+generation+of+knock-out+mutants+in+cyanobacteria:+studies+of+glycogen+metabolism+in+Synechococcus+sp+PCC+7002.">One-step plasmid construction for generation of knock-out mutants in cyanobacteria: studies of glycogen metabolism in Synechococcus sp PCC 7002.</a> Photosynth Res. 107 (2), 215-221 (2011).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophylls+and+carotenoids:+Pigments+of+photosynthetic+biomembranes.">Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes.</a> Methods Enzymol. 148, 350-382 (1987).</li><li>L&#243;pez, C. V. G., del Carmen Cer&#243;n Garc&#237;a, M., Fern&#225;ndez, F. G. A., Bustos, C. S., Chisti, Y., Sevilla, J. M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurements+of+microalgal+and+cyanobacterial+biomass.">Protein measurements of microalgal and cyanobacterial biomass.</a> Bioresource Technol. 101, 7587-7591 (2010).</li><li>Hasunuma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+metabolic+profiling+of+cyanobacterial+glycogen+biosynthesis+under+conditions+of+nitrate+depletion.">Dynamic metabolic profiling of cyanobacterial glycogen biosynthesis under conditions of nitrate depletion.</a> J Exp Bot. 64, 2943-2954 (2013).</li><li>D&#237;az-Troya, S., L&#243;pez-Maury, L., S&#225;nchez-Riego, A. M., Rold&#225;n, M., Florencio, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+glycogen+biosynthesis+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803:+Analysis+of+the+AGP+and+glycogen+synthases.">Redox regulation of glycogen biosynthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: Analysis of the AGP and glycogen synthases.</a> Molecular Plant. 7, 87-100 (2014).</li><li>Parrott, L. M., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA,+RNA+and+protein+composition+of+the+cyanobacterium+Anacystis+nidulans+grown+in+light-+and+carbon+dioxide-limited+chemostats.">The DNA, RNA and protein composition of the cyanobacterium Anacystis nidulans grown in light- and carbon dioxide-limited chemostats.</a> Arch Microbiol. 127, 53-58 (1980).</li><li>Hihara, Y., Kamei, A., Kanehisa, M., Kaplan, A., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+microarray+analysis+of+cyanobacterial+gene+expression+during+acclimation+to+high+light.">DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light.</a> Plant Cell. 13, 793-806 (2001).</li></ol>

Критические шаги в протоколе - это осаждение гликогена и ресуспензия. После центрифугирования после осаждения этанолом гликоген образует полупрозрачную таблетку, которая свободно прилипает к стенкам микроцентрифужных пробирок. Поэтому при удалении надосадочной жидкости необходимо...

Цианобактерии накапливают гликоген в качестве основного углеводного хранилища углерода из СО 2, закрепленного в свете путем фотосинтеза. Гликоген представляет собой гликан, состоящий из линейного α-1,4-связанного глюкана с ответвлениями, образованными α-1,6-связанными глюкозильными связями. Биосинтез гликогена в цианобактериях начинается с превращения глюкозо-6-фосфата в ADP-глюкозу посредством последовательного действия фосфоглюкомутазы и АДФ-глюкозо-пирофосфорилазы. Глюкозную часть в ADP-глюкозе переносят на невосстанавливающий конец α-1,4-глюкан-скелета гликогена одной или несколькими гликогенсинтазами (GlgA). Впоследствии разветвляющиеся ферменты вводят α-1,6-связанное глюкозильное звено, которое далее расширяется, чтобы генерировать гликогенную частицу. В темноте гликоген разрушается гликогенфосфорилазой, гликогенными дебранирующими ферментами, α-глюканотрансферазой и мальтодекстринфосфорилазой в фосфорилированную глюкозу и свободную глюкозу. Эти фиды intO катаболические пути, включая окислительный пентозофосфатный путь, путь Эмбдена-Мейерхофа-Парнаса (гликолиз) и путь Энтерна-Дудорова 1 , 2 , 3 , 4 . В последние годы метаболизм гликогена в цианобактериях вызвал повышенный интерес из-за возможности развития цианобактерий в заводы микробиологических клеток, вызванных солнечным светом, для производства химических веществ и топлива. Метаболизм гликогена можно модифицировать, чтобы увеличить выход продуктов, поскольку гликоген является самым большим гибким углеродным пулом в этих бактериях. Примером может служить cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002, который был генетически разработан для производства маннита; Генетический разрыв синтеза гликогена увеличивает выход маннита в 3 раза 5 . Другим примером является производство биоэтанола из загруженного гликогенами дикогоYpe Synechococcus sp. PCC 7002 6 . Содержание гликогена в клеточном слое дикого типа может составлять до 60% от сухой массы клетки во время голодания азота 6 . Наше понимание метаболизма и регуляции гликогена также расширилось за последние годы. Хотя известно, что гликоген накапливается в свете и катаболизируется в темноте, детальная кинетика метаболизма гликогена во время цикла диэлей была недавно обнаружена только в Synechocystis sp. PCC 6803 7 . Кроме того, было выявлено несколько генов, влияющих на накопление гликогена. Примечательным примером является открытие, что предполагаемая гистидинкиназа PmgA и некодирующая РНК PmgR1 образуют регуляторный каскад и контролируют накопление гликогена. Интересно, что мутанты делеции pmgA и pmgR1 накапливают в два раза больше гликогена, чем штамм дикого типа Synechocystis sp. PCC 68038 , 9 . Известно, что другие регуляторные элементы влияют на накопление гликогена, включая альтернативный сигма-фактор E и транскрипционный фактор CyAbrB2 10 , 11 . По мере роста интереса к регуляции гликогена и метаболизма необходим подробный протокол, описывающий определение содержания гликогена. В литературе используются несколько методов. Кислотный гидролиз с последующим определением содержания моносахарида посредством анионообменной жидкостной хроматографии под высоким давлением в сочетании с импульсным амперометрическим детектором или спектрометрическим определением после обработки кислотой и фенолом являются широко используемыми методами для аппроксимации содержания гликогена 9 , 10 , 12 , 13 . Однако анион-обменный жидкостной хроматограф высокого давленияC является очень дорогостоящим и не выделяет глюкозу, полученную из гликогена, по сравнению с другими глюкозосодержащими гликоконъюгатами, такими как сахароза 14 , глюкозилглицерин 15 и целлюлоза 16 , 17 , 18 , которые, как известно, накапливаются у некоторых видов цианобактерий. Кислотно-фенольный метод может быть выполнен с использованием стандартного лабораторного оборудования. Тем не менее, он использует высоко токсичные реагенты и не различает глюкозу , полученную из различных гликоконъюгатов, а также не различают глюкозы из других моносахаридов , которые представляют собой клеточные материалы, такие как гликолипиды, липополисахариды и внеклеточные матрицы 12. В частности, анализ горячей кислоты-фенола часто используется для определения общего содержания углеводов, а не для конкретного определения содержания глюкозы 12 . ФерментативныйДролиз гликогена до глюкозы посредством α-амилоглюкозидазы с последующим детектированием глюкозы через фермент-связанный анализ генерирует колориметрическое считывание, которое является высокочувствительным и специфичным для глюкозы, полученной из гликогена. Специфичность может быть дополнительно улучшена с предпочтительным осаждением гликогена из клеточных лизатов с помощью этанола 5 , 8 , 19 . Здесь мы опишем подробный протокол для анализа содержания гликогена на основе фермента на двух наиболее широко изученных цианобактериальных видах Synechocystis sp. PCC 6803 и Synechococcus sp. PCC 7002, в штаммах дикого типа и мутантов. Для обеспечения эффективного гидролиза используется коктейль α-амилазы и α-амилоглюкозидазы 8 . Эндо-действующая α-амилаза гидролизует α-1,4-связи в различных глюканах в декстрины, которые далее гидролизуются tO глюкозой экзо-действующей α-амилоглюкозидазой 20 . Синергические эффекты этих ферментов хорошо известны, и эти ферменты обычно используются для селективного гидролиза крахмала, который является α-связанным глюканоподобным гликогеном, не влияя на другие гликоконъюганты, такие как целлюлоза, в биомассе растений 21 . Выделенная глюкоза количественно обнаруживается после анализа, связанного с ферментом, состоящего из глюкозооксидазы, которая катализирует восстановление кислорода до перекиси водорода и окисление глюкозы до лактона и пероксидазы, которая продуцирует хинонимин-краситель розового цвета из перекиси водорода, Фенольное соединение и 4-аминоантипирин 22 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="784">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">QSonica Sonicators Q700</td>
			<td style="width:219px;">Qsonica, LLC</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">QSonica</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax 190 Microplate Reader&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Eliza plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bullet Blender Storm</td>
			<td style="width:219px;">Next Advance</td>
			<td style="width:119px;">BBY24M-CE</td>
			<td>Beads beater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer</td>
			<td style="width:219px;">Amersham Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">HCl</td>
			<td style="width:219px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1-00317</td>
			<td>pH adjutment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32319</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amyloglycosidase (Rhizopus sp.)</td>
			<td style="width:219px;">Megazyme</td>
			<td style="width:119px;">E-AMGPU</td>
			<td>Enzyme for glycogen depolymerization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis)</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3176</td>
			<td>Enzyme for glycogen depolymerization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:219px;">Merch</td>
			<td style="width:119px;">8337</td>
			<td>Standard for the glucose assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pierce BCA Protein assay kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">23225</td>
			<td>For determination of protein concentrations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Aluminum drying trays, disposable</td>
			<td style="width:219px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">611-1362</td>
			<td>For determination of cell dry weights</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">D-Glucose assay kit (GODPOD format)</td>
			<td style="width:219px;">Megazyme</td>
			<td style="width:119px;">K-GLUC</td>
			<td>For determination of glucose concentrations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Zirconium oxide breads, 0.15 mm</td>
			<td style="width:219px;">Next Advance</td>
			<td style="width:119px;">ZrOB015</td>
			<td>Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">RINO tubes</td>
			<td style="width:219px;">Next Advance</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of the glycogen content in cyanobacteria

Цианобактерии накапливают гликоген в качестве основного внутриклеточного углерода и энергии при фотосинтезе. Недавние разработки в области исследований выявили сложные механизмы метаболизма гликогена, в том числе цикл циклов биосинтеза и катаболизма, окислительно-восстановительную регуляцию и участие некодирующей РНК. В то же время предпринимаются усилия по перенаправлению углерода из гликогена в желаемые продукты в генно-инженерных цианобактериях для повышения выхода продукта. Для определения содержания гликогена в цианобактериях используются несколько методов с переменной точностью и техническими сложностями. Здесь мы приводим подробный протокол для надежного определения содержания гликогена в цианобактериях, который может быть выполнен в стандартной лабораторной лаборатории. Протокол влечет за собой селективное осаждение гликогена из клеточного лизата и ферментативную деполимеризацию гликогена с образованием глюкозных мономеров, которые обнаруживаются у глюкозыIdase-peroxidase (GOD-POD), связанный с ферментом. Этот метод применяется к Synechocystis sp. PCC 6803 и Synechococcus sp. PCC 7002, две модели цианобактериальных видов, которые широко используются в метаболической инженерии. Кроме того, метод успешно показал различия в содержании гликогена между диким типом и мутантами, дефектными в регуляторных элементах или генах биосинтеза гликогена.

10 мл дикого типа Synechocystis sp. PCC 6803 выращивали в фотоавтотрофных условиях до достижения значения OD 730 нм около 0,8. Клетки собирали и ресуспендировали в 50 мМ Трис-HCl, pH 8. Значение OD 730 нм было доведено до 2-3. Содержание гликогена анализировали в соответствии с ?...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria at JoVE.com

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Здесь мы представляем надежный и простой анализ для измерения содержания гликогена в клетках цианобактерий. Процедура влечет за собой осаждение, селективную деполимеризацию и обнаружение остатков глюкозы. Этот метод подходит как для дикого типа, так и для генетически модифицированных штаммов и может способствовать метаболической инженерии цианобактерий.

Определение содержания гликогена в цианобактериях

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Автоматизированная Акустическая дозирования для серийного разведения пептидные агонисты в Potency Определение Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Определение высокого сродства антитело-антиген-связывающий Kinetics с использованием четырех биосенсор платформы

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Высокая пропускная способность, абсолютное определение содержания выбранной белка на уровнях тканей, с использованием количественных Dot блот анализ (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

Определение липидов индекс путем восстановления жидкого флуоресценции в грибкового патогена Пузырчатая Maydis

The article shows how to implement the LD index assay, which is a sensitive microplate assay to determine the accumulation of triacylglycerols (TAGs) in ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Колориметрический метод измерения содержания железа в растениях

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Спектрофотометрические определение содержания Phycobiliprotein в цианобактерии Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Используя высокое содержание Imaging для количественного определения целевых участия в адэрентных клеток

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Обогащение частиц липопротеинов коренных народов с микроРНК и последующее определение их абсолютной/относительной микроРНК содержание и их сотовой скорость передачи

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Производство, кристаллизация и структурное определение мкножеского домена NEMO, имеющего обязательную силу IKK

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

Включение компенсации в режиме реального времени в быстрых фотохимических окислениях белков для определения изменений топографии белка

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...