Name: determination of the glycogen content in cyanobacteria
Uploaded: 2017-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria at JoVE.com

Författarna erkänner Nordic Energy Research (AquaFEED, projekt nr 24), Innovationfonden Danmark (Pant Power, projekt nr 12-131844) och Villum Fonden (projekt nr 13363)

1. Framställning <ol><li> Cyanobakteriella kulturer <ol><li> Växa Synechocystis sp. PCC 6803 vid 30 ° C i flytande BG11 mediet 8, med en konstant tillförsel av luft med tillsats av 1% (volym / volym) CO2. Upplys kulturerna kontinuerligt med ljus vid en fotosyntetisk fotonflödesdensitet på 50 μmol foton / m 2 / s. </li><li> Växa Synechococcus sp. PCC 7002 i flytande A + medium 23 (BG11 medium kan också anv?...

<ol>
	<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Entner-Doudoroff+pathway+is+an+overlooked+glycolytic+route+in+cyanobacteria+and+plants.">The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).</li><li>Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+flux+analysis+in+Synechocystis+using+isotope+distribution+from+C-13-labeled+glucose.">Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose.</a> Metab Eng. 4 (3), 202-216 (2002).</li><li>Pelroy, R. A., Levine, G. A., Bassham, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+light-dark+CO2+fixation+and+glucose+assimilation+by+Aphanocapsa+6714.">Kinetics of light-dark CO2 fixation and glucose assimilation by Aphanocapsa 6714.</a> J Bacteriol. 128, 633-643 (1976).</li><li>You, L., Berla, B., He, L., Pakrasi, H. B., Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C-MFA+delineates+the+photomixotrophic+metabolism+of+Synechocystis.+sp.+PCC+6803+under+light-+and+carbon-sufficient+conditions.">13C-MFA delineates the photomixotrophic metabolism of Synechocystis. sp. PCC 6803 under light- and carbon-sufficient conditions.</a> Biotechnol J. 9, 684-692 (2014).</li><li>Jacobsen, J. H., Frigaard, N. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+photosynthetic+mannitol+biosynthesis+from+CO2+in+a+cyanobacterium.">Engineering of photosynthetic mannitol biosynthesis from CO2 in a cyanobacterium.</a> Metab Eng. 21, 60-70 (2014).</li><li>M&#246;llers, K. B., Cannella, D., J&#248;rgensen, H., Frigaard, N. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+biomass+as+carbohydrate+and+nutrient+feedstock+for+bioethanol+production+by+yeast+fermentation.">Cyanobacterial biomass as carbohydrate and nutrient feedstock for bioethanol production by yeast fermentation.</a> Biotechnol Biofuels. 7, 64 (2014).</li><li>Angermayr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+Synechocystis.+sp.+strain+PCC+6803+with+N2+and+CO+2+in+a+diel+regime+reveals+multiphase+glycogen+dynamics+with+low+maintenance+costs.">Culturing Synechocystis. sp. strain PCC 6803 with N2 and CO 2 in a diel regime reveals multiphase glycogen dynamics with low maintenance costs.</a> Appl Environ Microbiol. 82, 4180-4189 (2016).</li><li>de Porcellinis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Non-coding+RNA+Ncr0700/PmgR1+is+required+for+photomixotrophic+growth+and+the+regulation+of+glycogen+accumulation+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The Non-coding RNA Ncr0700/PmgR1 is required for photomixotrophic growth and the regulation of glycogen accumulation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Plant Cell Physiol. 57 (10), 2091-2103 (2016).</li><li>Sakuragi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Tocopherol+plays+a+role+in+photosynthesis+and+macronutrient+homeostasis+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+that+is+independent+of+its+antioxidant+function.">alpha-Tocopherol plays a role in photosynthesis and macronutrient homeostasis of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 that is independent of its antioxidant function.</a> Plant Physiol. 141, 508-521 (2006).</li><li>Osanai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+regulation+of+sugar+catabolic+pathways+in+the+cyanobacterium+Synechocystis.+sp.+PCC+6803+by+the+group+2+sigma+factor+sigE.">Positive regulation of sugar catabolic pathways in the cyanobacterium Synechocystis. sp. PCC 6803 by the group 2 sigma factor sigE.</a> J Biol Chem. 280, 30653-30659 (2005).</li><li>Yamauchi, Y., Kaniya, Y., Kaneko, Y., Hihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+of+the+cyAbrB+transcriptional+regulator+pair+Sll0822+and+Sll0359+in+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803.">Physiological roles of the cyAbrB transcriptional regulator pair Sll0822 and Sll0359 in Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> J Bacteriol. 193, 3702-3709 (2011).</li><li>Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, J., Rebers, P., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances.">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Anal Chem. 28, 350-356 (1956).</li><li>Osanai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+group+2+{sigma}+factor+SigE+widely+activates+expressions+of+sugar+catabolic+genes+in+Synechocystis+species+PCC+6803.">Genetic engineering of group 2 {sigma} factor SigE widely activates expressions of sugar catabolic genes in Synechocystis species PCC 6803.</a> J Biol Chem. 286, 30962-30971 (2011).</li><li>Miao, X., Wu, Q., Wu, G., Zhao, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sucrose+accumulation+in+salt-stressed+cells+of+agp+gene+deletion-mutant+in+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Sucrose accumulation in salt-stressed cells of agp gene deletion-mutant in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> FEMS Microbiol Letters. 218, 71-77 (2003).</li><li>Hagemann, M., Erdmann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+pathway+of+glucosylglycerol+synthesis+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Activation and pathway of glucosylglycerol synthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Microbiology. 140, 1427-1431 (1994).</li><li>Nobles, D. R., Romanovicz, D. K., Brown, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+in+cyanobacteria.+Origin+of+vascular+plant+cellulose+synthase.">Cellulose in cyanobacteria. Origin of vascular plant cellulose synthase.</a> Plant Physiol. 127, 529-542 (2001).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+production+of+extracellular+type-I+cellulose+by+the+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+PCC+7002.">High-yield production of extracellular type-I cellulose by the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002.</a> Cell Discovery. 1, 15004 (2015).</li><li>Kawano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+accumulation+and+a+cellulose+synthase+gene+are+responsible+for+cell+aggregation+in+the+cyanobacterium+Thermosynechococcus+vulcanus+RKN.">Cellulose accumulation and a cellulose synthase gene are responsible for cell aggregation in the cyanobacterium Thermosynechococcus vulcanus RKN.</a> Plant Cell Physiol. 52, 957-966 (2011).</li><li>Angermayr, S. A., Gorchs Rovira, A., Hellingwerf, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+cyanobacteria+for+the+synthesis+of+commodity+products.">Metabolic engineering of cyanobacteria for the synthesis of commodity products.</a> Trends Biotechnol. 33, 352-361 (2015).</li><li>Zhang, B., Dhital, S., Gidley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+and+antagonistic+effects+of+&#945;-amylase+and+amyloglucosidase+on+starch+digestion.">Synergistic and antagonistic effects of &#945;-amylase and amyloglucosidase on starch digestion.</a> Biomacromolecules. 14, 1945-1954 (2013).</li><li>Harholt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARABINAN+DEFICIENT+1+is+a+putative+arabinosyltransferase+involved+in+biosynthesis+of+pectic+arabinan+in+Arabidopsis.">ARABINAN DEFICIENT 1 is a putative arabinosyltransferase involved in biosynthesis of pectic arabinan in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 140, 49-58 (2006).</li><li>Fernando, C. D., Soysa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+enzymatic+colorimetric+assay+for+determination+of+hydrogen+peroxide+(H2O2)+scavenging+activity+of+plant+extracts.">Optimized enzymatic colorimetric assay for determination of hydrogen peroxide (H2O2) scavenging activity of plant extracts.</a> MethodsX. 2, 283-291 (2015).</li><li>Jacobsen, J. H., Rosgaard, L., Sakuragi, Y., Frigaard, N. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+plasmid+construction+for+generation+of+knock-out+mutants+in+cyanobacteria:+studies+of+glycogen+metabolism+in+Synechococcus+sp+PCC+7002.">One-step plasmid construction for generation of knock-out mutants in cyanobacteria: studies of glycogen metabolism in Synechococcus sp PCC 7002.</a> Photosynth Res. 107 (2), 215-221 (2011).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophylls+and+carotenoids:+Pigments+of+photosynthetic+biomembranes.">Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes.</a> Methods Enzymol. 148, 350-382 (1987).</li><li>L&#243;pez, C. V. G., del Carmen Cer&#243;n Garc&#237;a, M., Fern&#225;ndez, F. G. A., Bustos, C. S., Chisti, Y., Sevilla, J. M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurements+of+microalgal+and+cyanobacterial+biomass.">Protein measurements of microalgal and cyanobacterial biomass.</a> Bioresource Technol. 101, 7587-7591 (2010).</li><li>Hasunuma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+metabolic+profiling+of+cyanobacterial+glycogen+biosynthesis+under+conditions+of+nitrate+depletion.">Dynamic metabolic profiling of cyanobacterial glycogen biosynthesis under conditions of nitrate depletion.</a> J Exp Bot. 64, 2943-2954 (2013).</li><li>D&#237;az-Troya, S., L&#243;pez-Maury, L., S&#225;nchez-Riego, A. M., Rold&#225;n, M., Florencio, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+glycogen+biosynthesis+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803:+Analysis+of+the+AGP+and+glycogen+synthases.">Redox regulation of glycogen biosynthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: Analysis of the AGP and glycogen synthases.</a> Molecular Plant. 7, 87-100 (2014).</li><li>Parrott, L. M., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA,+RNA+and+protein+composition+of+the+cyanobacterium+Anacystis+nidulans+grown+in+light-+and+carbon+dioxide-limited+chemostats.">The DNA, RNA and protein composition of the cyanobacterium Anacystis nidulans grown in light- and carbon dioxide-limited chemostats.</a> Arch Microbiol. 127, 53-58 (1980).</li><li>Hihara, Y., Kamei, A., Kanehisa, M., Kaplan, A., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+microarray+analysis+of+cyanobacterial+gene+expression+during+acclimation+to+high+light.">DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light.</a> Plant Cell. 13, 793-806 (2001).</li></ol>

Kritiska steg inom protokollet är glykogenutfällning och resuspendering. Efter centrifugering efter etanolutfällning bildar glykogen en genomskinlig pellet som löst fastnar vid väggarna i mikrocentrifugrören. När supernatanten avlägsnas måste därför särskild uppmärksamhet ges för att inte avlägsna pelleten. Glykogenpelleten är klibbig och solubilisering kan vara svårt om den torkar ut. Observera att fullständig solubilisering av glykogenpelleten är viktig eftersom ofullständig solubilisering leder ti...

Cyanobakterier ackumulerar glykogen som den största kolhydratlagret av kol från CO 2 fixerad i ljus genom fotosyntes. Glykogen är en glykan bestående av linjär a-1,4-kopplad glukan med grenar skapade av a-1,6-länkade glukosylbindningar. Glykogenbiosyntes i cyanobakterier börjar med omvandlingen av glukos-6-fosfat till ADP-glukos genom sekventiell verkan av fosfoglukomutas och ADP-glukospyrofosforylas. Glukosdelen i ADP-glukos överförs till den icke-reducerande änden av a-1,4-glukan-ryggraden av glykogen med en eller flera glykogensyntaser (GlgA). Därefter introducerar en förgreningsenzymer den a-1,6-bundna glukosylbindningen, vilken vidare förlängs för att generera glykogenpartikeln. I mörkret bryts ned glykogen av glykogenfosforylas, glykogenförgreningsenzymer, a-glukanotransferas och maltodextrinfosforylas i fosforylerad glukos och fri glukos. Dessa foder intO kataboliska vägar, inklusive oxidativ pentosfosfatvägen, Embden-Meyerhof-Parnas-vägen (glykolys) och Entner-Doudoroff-vägen 1 , 2 , 3 , 4 . Glykogenmetabolism i cyanobakterier har ökat intresse för de senaste åren på grund av att cyanobakterierna kan utvecklas till mikrobiella cellfabriker drivna av solljus för att producera kemikalier och bränslen. Glykogenmetabolism kan modifieras för att öka utbytet av produkterna, eftersom glykogen är den största flexibla kolpumpen i dessa bakterier. Ett exempel är cyanobakteriet Synechococcus sp. PCC 7002, som har blivit genetiskt konstruerad för att producera mannitol; Den genetiska störningen av glykogensyntes ökar mannitolutbytet 3 gånger 5 . Ett annat exempel är produktionen av bioetanol från glykogenbelastad vildYpe Synechococcus sp. PCC 7002 6 . Glykogenhalten av vildtypscell kan vara upp till 60% av cellens torrvikt under kvävehushållning 6 . Vår förståelse av glykogenmetabolism och reglering har också ökat de senaste åren. Medan glykogen är känd för att ackumuleras i ljuset och kataboliseras i mörker, avslöts detaljerad kinetik av glykogenmetabolism under dielcykeln först nyligen i Synechocystis sp. PCC 6803 7 . Dessutom har flera gener som påverkar ackumuleringen av glykogen identifierats. Ett anmärkningsvärt exempel är upptäckten att det förmodade histidinkinaset PmgA och det icke-kodande RNA PmgRl bildar en regulatorisk kaskad och kontrollerar ackumuleringen av glykogen. Intressant ackumulerar pmgA- och pmgRl- deletionsmutanterna dubbelt så mycket glykogen som vildtypstammen av Synechocystis sp. PCC 68038 , 9 . Andra regleringselement är också kända för att påverka ackumulationen av glykogen, inkluderande den alternativa sigmafaktorn E och transkriptionsfaktorn CyAbrB2 10 , 11 . Eftersom intresset för glykogenreglering och metabolism växer, är ett detaljerat protokoll som beskriver bestämningen av glykogeninnehållet motiverat. Flera metoder används i litteraturen. Syrahydrolys följt av bestämning av monosackaridhalten genom högtrycksanjonbytningsvätskekromatografi kopplad med en pulserad amperometrisk detektor eller spektrometrisk bestämning efter behandlingar med syra och fenol är allmänt använda metoder för att approximera glykogenhalten 9 , 10 , 12 , 13 . Emellertid en högtrycksanjonbyte vätskekromatografiC-instrumentet är mycket dyrt och diskriminerar inte glukos härledd från glykogen från det som härrör från andra glukosinnehållande glykokonjugat, såsom sackaros 14 , glukosylglycerol 15 och cellulosa 16 , 17 , 18 , vilka är kända att ackumulera i vissa cyanobakteriella arter. Syra-fenolmetoden kan utföras med standard laboratorieutrustning. Det använder emellertid högtoxiska reagens och skiljer inte glukos härledd från olika glykokonjugat, och skiljer inte heller glukos från andra monosackarider som utgör cellulära material, såsom glykolipider, lipopolysackarider och extracellulära matriser 12 . Speciellt används den heta syren-fenolanalysen ofta för bestämning av total kolhydrathalt i stället för för bestämning av glukoshalt 12 . Enzymatisk hyDrolys av glykogen till glukos genom a-amyloglukosidas följt av detektering av glukos genom en enzymkopplad analys alstrar en kolorimetrisk avläsning som är mycket känslig och specifik för glukos härledd från glykogen. Specificiteten kan förbättras ytterligare med preferentiell utfällning av glykogen från celllysat med etanol 5 , 8 , 19 . Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för en enzymbaserad analys av glykogenhalten i två av de mest studerade cyanobakteriella arterna, Synechocystis sp. PCC 6803 och Synechococcus sp. PCC 7002, i vildtyp och mutantstammar. För att säkerställa effektiv hydrolys användes en cocktail av a-amylas och a-amyloglukosidas 8 . Det endo-verkande a-amylaset hydrolyserar a-1,4-bindningarna i olika glukaner i dextrin, som vidare hydrolyseras tO glukos genom exo-verkande a-amyloglukosidas 20 . De synergistiska effekterna av dessa enzymer är välkända, och dessa enzymer används rutinmässigt för selektiv hydrolys av stärkelse, som är en a-bunden glukanliknande glykogen, utan att påverka andra glykokonjuganter, såsom cellulosa, i växtbiomassan 21 . Den frisatta glukosen detekteras kvantitativt efter en enzymkopplad analys bestående av glukosoxidas som katalyserar reduktionen av syre till väteperoxid och oxidationen av glukos till en lakton- och peroxidas-som ger ett rosa färgat kinoniminfärg från väteperoxid, En fenolförening och 4-aminoantipyrin 22 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="784">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">QSonica Sonicators Q700</td>
			<td style="width:219px;">Qsonica, LLC</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">QSonica</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax 190 Microplate Reader&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Eliza plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bullet Blender Storm</td>
			<td style="width:219px;">Next Advance</td>
			<td style="width:119px;">BBY24M-CE</td>
			<td>Beads beater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer</td>
			<td style="width:219px;">Amersham Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">HCl</td>
			<td style="width:219px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1-00317</td>
			<td>pH adjutment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32319</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amyloglycosidase (Rhizopus sp.)</td>
			<td style="width:219px;">Megazyme</td>
			<td style="width:119px;">E-AMGPU</td>
			<td>Enzyme for glycogen depolymerization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis)</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3176</td>
			<td>Enzyme for glycogen depolymerization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:219px;">Merch</td>
			<td style="width:119px;">8337</td>
			<td>Standard for the glucose assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pierce BCA Protein assay kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">23225</td>
			<td>For determination of protein concentrations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Aluminum drying trays, disposable</td>
			<td style="width:219px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">611-1362</td>
			<td>For determination of cell dry weights</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">D-Glucose assay kit (GODPOD format)</td>
			<td style="width:219px;">Megazyme</td>
			<td style="width:119px;">K-GLUC</td>
			<td>For determination of glucose concentrations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Zirconium oxide breads, 0.15 mm</td>
			<td style="width:219px;">Next Advance</td>
			<td style="width:119px;">ZrOB015</td>
			<td>Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">RINO tubes</td>
			<td style="width:219px;">Next Advance</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of the glycogen content in cyanobacteria

Cyanobakterier ackumulerar glykogen som ett stort intracellulärt kol- och energilagring under fotosyntesen. Den senaste utvecklingen inom forskning har framhävt komplexa mekanismer för glykogenmetabolism, inklusive dielcykeln för biosyntes och katabolism, redoxreglering och involvering av icke-kodande RNA. Samtidigt görs ansträngningar för att omdirigera kol från glykogen till önskvärda produkter i genetiskt manipulerade cyanobakterier för att förbättra produktutbytet. Flera metoder används för att bestämma glykogeninnehållet i cyanobakterier, med varierande noggrannhet och tekniska komplexiteter. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för pålitlig bestämning av glykogenhalten i cyanobakterier som kan utföras i ett standardvetenskapligt laboratorium. Protokollet innefattar selektiv utfällning av glykogen från celllysatet och den enzymatiska depolymerisationen av glykogen för att alstra glukosmonomerer som detekteras av en glukosoxIdase-peroxidas (GOD-POD) enzymkopplad analys. Metoden har applicerats på Synechocystis sp. PCC 6803 och Synechococcus sp. PCC 7002, två modeller cyanobakteriella arter som används i stor utsträckning inom ämnesmetodik. Vidare visade metoden framgångsrikt skillnader i glykogeninnehållet mellan vildtypen och mutanterna defekta i regulatoriska element eller glykogenbiosyntetiska gener.

10 ml vildtyp Synechocystis sp. PCC 6803 odlades under fotoautotrofa betingelser tills OD 730nm- värdet nådde approximativt 0,8. Cellerna skördades och resuspenderades i 50 mM Tris-HCl, pH 8. OD 730 nm- värdet justerades till 2-3. Glykogenhalten analyserades enligt protokollet som beskrivits ovan. Glykogenhalten per OD 730 nm var 13 ± 1,8 ug / ml / OD 730 nm ( N = 12). Den glykogeninnehåll i förhållande till proteinhal...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria at JoVE.com

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Här presenterar vi en pålitlig och enkel analys för att mäta glykogeninnehållet i cyanobakteriella celler. Förfarandet medför utfällning, selekterbar depolymerisation och detektering av glukosrester. Denna metod är lämplig för både vildtyp och genetiskt manipulerade stammar och kan underlätta den metaboliska verkningen av cyanobakterier.

Bestämning av glykogeninnehållet i cyanobakterier

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatiserad Acoustic Utlämning för serieutspädning av peptidagonister i Styrka Fastställande Analyser

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Fastställande av hög affinitet antikropp-antigenbindning Kinetics med fyra Biosensor Platforms

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Hög genomströmning, absolut bestämning av halten av ett Protein som är valda på vävnad nivåer med hjälp av kvantitativa Dot Blot analys (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

Lipid Index bestämning av flytande fluorescens återhämtning i den svamp patogener Ustilago Maydis

The article shows how to implement the LD index assay, which is a sensitive microplate assay to determine the accumulation of triacylglycerols (TAGs) in ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

En kolorimetrisk metod för att mäta järnhalten i växter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spektrofotometrisk bestämning av Phycobiliprotein innehåll i Cyanobakterien Synechocystis

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Med hög halt Imaging att kvantifiera mål engagemang i vidhäftande celler

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

Anrikning av Native Lipoproteinpartiklar med mikroRNA och efterföljande bestämning av deras absoluta/relativa mikroRNA innehåll och deras cellulära överföringshastigheten

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

Produktion, kristallisering och strukturbestämning av IKK-bindande domän för NEMO

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

Aktivera Realtidskompensation i Snabb Fotokemiska oxidationer av proteiner för bestämning av Protein Topografi Förändringar

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...