Name: determination of the glycogen content in cyanobacteria
Uploaded: 2017-07-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria at JoVE.com

Yazarlar, Nordic Energy Research (AquaFEED, proje no. 24), Danimarka Yenilikçiliği (Pant Gücü, proje No: 12-131844) ve Villum Fonden (proje no: 13363)

1. Hazırlık <ol><li> Siyanobakteri kültürleri <ol><li> Synechocystis sp. PCC 6803,% 1 (v / v) CO 2 ile takviye edilmiş sabit bir hava kaynağı ile 30 ° C&#39;de sıvı BG11 ortamı 8&#39;de karıştırılır . Kültürleri 50 umol foton / m 2 / s&#39;lik bir fotosentetik foton akı yoğunluğunda sürekli olarak ışıkla aydınlatın. </li><li> Synechococcus sp. % 1 (v / v) CO 2 ile takviye edilmiş sabit bir hava kayna...

<ol>
	<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Entner-Doudoroff+pathway+is+an+overlooked+glycolytic+route+in+cyanobacteria+and+plants.">The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).</li><li>Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+flux+analysis+in+Synechocystis+using+isotope+distribution+from+C-13-labeled+glucose.">Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose.</a> Metab Eng. 4 (3), 202-216 (2002).</li><li>Pelroy, R. A., Levine, G. A., Bassham, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+light-dark+CO2+fixation+and+glucose+assimilation+by+Aphanocapsa+6714.">Kinetics of light-dark CO2 fixation and glucose assimilation by Aphanocapsa 6714.</a> J Bacteriol. 128, 633-643 (1976).</li><li>You, L., Berla, B., He, L., Pakrasi, H. B., Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C-MFA+delineates+the+photomixotrophic+metabolism+of+Synechocystis.+sp.+PCC+6803+under+light-+and+carbon-sufficient+conditions.">13C-MFA delineates the photomixotrophic metabolism of Synechocystis. sp. PCC 6803 under light- and carbon-sufficient conditions.</a> Biotechnol J. 9, 684-692 (2014).</li><li>Jacobsen, J. H., Frigaard, N. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+photosynthetic+mannitol+biosynthesis+from+CO2+in+a+cyanobacterium.">Engineering of photosynthetic mannitol biosynthesis from CO2 in a cyanobacterium.</a> Metab Eng. 21, 60-70 (2014).</li><li>M&#246;llers, K. B., Cannella, D., J&#248;rgensen, H., Frigaard, N. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyanobacterial+biomass+as+carbohydrate+and+nutrient+feedstock+for+bioethanol+production+by+yeast+fermentation.">Cyanobacterial biomass as carbohydrate and nutrient feedstock for bioethanol production by yeast fermentation.</a> Biotechnol Biofuels. 7, 64 (2014).</li><li>Angermayr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+Synechocystis.+sp.+strain+PCC+6803+with+N2+and+CO+2+in+a+diel+regime+reveals+multiphase+glycogen+dynamics+with+low+maintenance+costs.">Culturing Synechocystis. sp. strain PCC 6803 with N2 and CO 2 in a diel regime reveals multiphase glycogen dynamics with low maintenance costs.</a> Appl Environ Microbiol. 82, 4180-4189 (2016).</li><li>de Porcellinis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Non-coding+RNA+Ncr0700/PmgR1+is+required+for+photomixotrophic+growth+and+the+regulation+of+glycogen+accumulation+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">The Non-coding RNA Ncr0700/PmgR1 is required for photomixotrophic growth and the regulation of glycogen accumulation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Plant Cell Physiol. 57 (10), 2091-2103 (2016).</li><li>Sakuragi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Tocopherol+plays+a+role+in+photosynthesis+and+macronutrient+homeostasis+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+that+is+independent+of+its+antioxidant+function.">alpha-Tocopherol plays a role in photosynthesis and macronutrient homeostasis of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 that is independent of its antioxidant function.</a> Plant Physiol. 141, 508-521 (2006).</li><li>Osanai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+regulation+of+sugar+catabolic+pathways+in+the+cyanobacterium+Synechocystis.+sp.+PCC+6803+by+the+group+2+sigma+factor+sigE.">Positive regulation of sugar catabolic pathways in the cyanobacterium Synechocystis. sp. PCC 6803 by the group 2 sigma factor sigE.</a> J Biol Chem. 280, 30653-30659 (2005).</li><li>Yamauchi, Y., Kaniya, Y., Kaneko, Y., Hihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+roles+of+the+cyAbrB+transcriptional+regulator+pair+Sll0822+and+Sll0359+in+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803.">Physiological roles of the cyAbrB transcriptional regulator pair Sll0822 and Sll0359 in Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> J Bacteriol. 193, 3702-3709 (2011).</li><li>Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, J., Rebers, P., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances.">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Anal Chem. 28, 350-356 (1956).</li><li>Osanai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+group+2+{sigma}+factor+SigE+widely+activates+expressions+of+sugar+catabolic+genes+in+Synechocystis+species+PCC+6803.">Genetic engineering of group 2 {sigma} factor SigE widely activates expressions of sugar catabolic genes in Synechocystis species PCC 6803.</a> J Biol Chem. 286, 30962-30971 (2011).</li><li>Miao, X., Wu, Q., Wu, G., Zhao, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sucrose+accumulation+in+salt-stressed+cells+of+agp+gene+deletion-mutant+in+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Sucrose accumulation in salt-stressed cells of agp gene deletion-mutant in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> FEMS Microbiol Letters. 218, 71-77 (2003).</li><li>Hagemann, M., Erdmann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+pathway+of+glucosylglycerol+synthesis+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803.">Activation and pathway of glucosylglycerol synthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Microbiology. 140, 1427-1431 (1994).</li><li>Nobles, D. R., Romanovicz, D. K., Brown, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+in+cyanobacteria.+Origin+of+vascular+plant+cellulose+synthase.">Cellulose in cyanobacteria. Origin of vascular plant cellulose synthase.</a> Plant Physiol. 127, 529-542 (2001).</li><li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+production+of+extracellular+type-I+cellulose+by+the+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+PCC+7002.">High-yield production of extracellular type-I cellulose by the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002.</a> Cell Discovery. 1, 15004 (2015).</li><li>Kawano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+accumulation+and+a+cellulose+synthase+gene+are+responsible+for+cell+aggregation+in+the+cyanobacterium+Thermosynechococcus+vulcanus+RKN.">Cellulose accumulation and a cellulose synthase gene are responsible for cell aggregation in the cyanobacterium Thermosynechococcus vulcanus RKN.</a> Plant Cell Physiol. 52, 957-966 (2011).</li><li>Angermayr, S. A., Gorchs Rovira, A., Hellingwerf, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+cyanobacteria+for+the+synthesis+of+commodity+products.">Metabolic engineering of cyanobacteria for the synthesis of commodity products.</a> Trends Biotechnol. 33, 352-361 (2015).</li><li>Zhang, B., Dhital, S., Gidley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+and+antagonistic+effects+of+&#945;-amylase+and+amyloglucosidase+on+starch+digestion.">Synergistic and antagonistic effects of &#945;-amylase and amyloglucosidase on starch digestion.</a> Biomacromolecules. 14, 1945-1954 (2013).</li><li>Harholt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARABINAN+DEFICIENT+1+is+a+putative+arabinosyltransferase+involved+in+biosynthesis+of+pectic+arabinan+in+Arabidopsis.">ARABINAN DEFICIENT 1 is a putative arabinosyltransferase involved in biosynthesis of pectic arabinan in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 140, 49-58 (2006).</li><li>Fernando, C. D., Soysa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+enzymatic+colorimetric+assay+for+determination+of+hydrogen+peroxide+(H2O2)+scavenging+activity+of+plant+extracts.">Optimized enzymatic colorimetric assay for determination of hydrogen peroxide (H2O2) scavenging activity of plant extracts.</a> MethodsX. 2, 283-291 (2015).</li><li>Jacobsen, J. H., Rosgaard, L., Sakuragi, Y., Frigaard, N. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+plasmid+construction+for+generation+of+knock-out+mutants+in+cyanobacteria:+studies+of+glycogen+metabolism+in+Synechococcus+sp+PCC+7002.">One-step plasmid construction for generation of knock-out mutants in cyanobacteria: studies of glycogen metabolism in Synechococcus sp PCC 7002.</a> Photosynth Res. 107 (2), 215-221 (2011).</li><li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlorophylls+and+carotenoids:+Pigments+of+photosynthetic+biomembranes.">Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes.</a> Methods Enzymol. 148, 350-382 (1987).</li><li>L&#243;pez, C. V. G., del Carmen Cer&#243;n Garc&#237;a, M., Fern&#225;ndez, F. G. A., Bustos, C. S., Chisti, Y., Sevilla, J. M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurements+of+microalgal+and+cyanobacterial+biomass.">Protein measurements of microalgal and cyanobacterial biomass.</a> Bioresource Technol. 101, 7587-7591 (2010).</li><li>Hasunuma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+metabolic+profiling+of+cyanobacterial+glycogen+biosynthesis+under+conditions+of+nitrate+depletion.">Dynamic metabolic profiling of cyanobacterial glycogen biosynthesis under conditions of nitrate depletion.</a> J Exp Bot. 64, 2943-2954 (2013).</li><li>D&#237;az-Troya, S., L&#243;pez-Maury, L., S&#225;nchez-Riego, A. M., Rold&#225;n, M., Florencio, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox+regulation+of+glycogen+biosynthesis+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803:+Analysis+of+the+AGP+and+glycogen+synthases.">Redox regulation of glycogen biosynthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: Analysis of the AGP and glycogen synthases.</a> Molecular Plant. 7, 87-100 (2014).</li><li>Parrott, L. M., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA,+RNA+and+protein+composition+of+the+cyanobacterium+Anacystis+nidulans+grown+in+light-+and+carbon+dioxide-limited+chemostats.">The DNA, RNA and protein composition of the cyanobacterium Anacystis nidulans grown in light- and carbon dioxide-limited chemostats.</a> Arch Microbiol. 127, 53-58 (1980).</li><li>Hihara, Y., Kamei, A., Kanehisa, M., Kaplan, A., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+microarray+analysis+of+cyanobacterial+gene+expression+during+acclimation+to+high+light.">DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light.</a> Plant Cell. 13, 793-806 (2001).</li></ol>

Protokolün kritik adımları glikojen çökmesi ve yeniden süspansiyon. Etanol çökeltisini takiben santrifüjden sonra, glikojen, gevşek şekilde mikrosantrifüj tüplerinin duvarlarına yapışan yarı saydam bir pelet oluşturur. Bu nedenle, yüzer maddenin çıkarılması sırasında, pelletin çıkarılmaması için özel dikkat gösterilmelidir. Glikojen pelleti yapışkandır ve kuruyorsa çözündürme zor olabilir. Glikojen pelletinin tamamen çözündürülmesinin önem taşıdığına dikkat edin, çünk?...

Siyanobakteriler, fotosentez yoluyla ışığa sabitlenmiş CO 2&#39;den gelen karbonun başlıca karbonhidrat deposu olarak glikojen biriktirir. Glikojen, α-1,6-bağlantılı glukosil bağlantıları ile yaratılan dalları olan doğrusal α-1,4-bağlı glukandan oluşan bir glıkan. Siyanobakterlerdeki glikojen biyosentezi, fosfoglukomütaz ve ADP-glikoz pirofosforilazın ardışık eylemi yoluyla glikoz-6-fosfatın ADP-glükoza dönüştürülmesiyle başlar. ADP-glikozdaki glukoz kısmı, bir veya daha fazla glikojen sentezleyicisi (GlgA) ile glikojen α-1,4-glukan omurgasının indirgeyici olmayan ucuna aktarılır. Daha sonra, dallanmış bir enzim, glikojen parçacığını üretmek için daha da genişletilen α-1,6-bağlantılı glukosil bağlantısını getirir. Karanlıkta, glikojen, glikojen fosforilaz, glikojen debranjivasyon enzimleri, α-glukanotransferaz ve malto-dekstrin fosforilazın fosforile glikoza ve serbest glikoza indirgenmesi ile parçalanır. Bu besleme intOksidatif pentoz fosfat yolu, Embden-Meyerhof-Parnas yolu (glikoliz) ve Entner-Doudoroff yolu 1 , 2 , 3 , 4 de dahil olmak üzere katabolik yolaklar. Siyanobakterlerdeki glikojen metabolizması, son yıllarda cyanobacteria&#39;nın, kimyasallar ve yakıtlar üretmek için güneş ışığı altında çalışan mikrobiyal hücre fabrikalarına dönüşmesi potansiyelinden dolayı artan bir ilgi topladı. Glikojen metabolizması, ürünlerin verimini artıracak şekilde modifiye edilebilir, çünkü glikojen bu bakterilerdeki en büyük esnek karbon havuzudur. Bunun bir örneği siyanobakteriyum Synechococcus sp. Mannitol üretmek için genetik olarak tasarlanmış PCC 7002; glikojen sentezinin genetik bozulma manitol verimi, 3-kat 5 artar. Bir başka örnek, biyoetanolün glikojen yüklü vahşi türevlerindenYpe Synechococcus sp. PCC 7002 6 . Vahşi hücre glikojen içeriği azot açlığı sırasında hücrenin kuru ağırlığının% 60&#39;ına kadar olabilir 6 . Glikojen metabolizması ve düzenlenmesi konusundaki anlayışımız son yıllarda da genişlemiştir. Glikojenin ışığa birikmesi ve karanlıkta katabolize olması bilinmesine rağmen, diel döngüsü boyunca glikojen metabolizmasının ayrıntılı kinetiği, Synechocystis sp. PCC 6803 7 . Dahası, glikojen birikimini etkileyen birkaç gen tespit edilmiştir. Dikkate değer bir örnek, varsayılan histidin kinaz PmgA&#39;nın ve kodlamayan RNA PmgRl&#39;in bir düzenleyici kaskad oluşturması ve glikojenin birikimini kontrol ettiği bulgudur. İlginç olarak, pmgA ve pmgR1 silme mutantları, Synechocystis sp. &#39; Un vahşi türü suşu kadar iki kat daha fazla glikojen birikir. PCC 68038 , 9 . Diğer düzenleyici elementlerin alternatif sigma faktörü E ve transkripsiyon faktörü CyAbrB2 10 , 11 de dahil olmak üzere glikojenin birikimini etkilediği bilinmektedir. Glikojen düzenlenmesi ve metabolizması ilgi arttıkça, glikojen içeriğinin tayinini açıklayan ayrıntılı bir protokol gereklidir. Literatürde çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Asit hidrolizi, ardından yüksek basınçlı anyon değişimli sıvı kromatografisi ile monosakkarit içeriğinin saptanması, ardından atımlı amperometrik bir detektör veya asit ve fenille yapılan muameleler sonrası spektrometrik tayin , 9 , 10 , 12 , 13 glikojen içeriğini yaklaştırmak için yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir. Bununla birlikte, yüksek basınçlı bir anyon değişimi sıvı kromatografisiC enstrümanı çok pahalıdır ve bazı siyanobakteriyel türlerde biriken bilinen sukroz 14 , glikosilgliserol 15 ve selüloz 16 , 17 , 18 gibi diğer glikoz içeren glikon konjugatlardan türetilen glikojeden türetilmiş glikozu ayırt etmez. Asit-fenol yöntemi, standart laboratuar ekipmanı kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, oldukça toksik reaktifler kullanır ve farklı gliko-konjügatlardan türeyen glikozu ayırt etmediği gibi glikoziti, glikolipidleri, lipopolisakaridleri ve hücre dışı matrisleri 12 gibi hücresel malzemeleri oluşturan diğer monosakaritlerden ayırt etmez. Özellikle, sıcak asit-fenol testi, glikoz içeriğinin spesifik belirlenmesi için değil, toplam karbonhidrat içeriğinin saptanması için sıklıkla kullanılır 12 . Enzimatik hyA-amiloglukozidaz ile glikozun glikoza droizlenmesi ve ardından bir enzim-eşlemeli analiz yoluyla glikozun saptanması, glıkojenden türetilmiş glukoza karşı oldukça hassas ve spesifik bir kolorimetrik okuma üretir. Özgüllük, hücre lizatlarından glikojenin etanol 5 , 8 , 19 tarafından tercihli olarak çökeltilmesi ile daha da geliştirilebilir. Burada, en yaygın olarak incelenen iki siyanobakteriyal türün, Synechocystis sp. &#39; Deki glikojen içeriğinin enzim bazlı tahlili için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. PCC 6803 ve Synechococcus sp. PCC 7002, yabani tip ve mutant suşlarda. Etkin hidrolizi sağlamak için, α-amilaz ve α-amiloglükosidaz&#39;dan oluşan bir kokteyl kullanılır 8 . Endo-etkili α-amilaz, çeşitli glukanlardaki α-1,4-bağlarını dekstrinlere hidrolize eder; bunlar, daha da hidrolize edilirler.O glukozun ekzo-etki eden α-amiloglükosidaz 20 ile sentezlenmesi. Bu enzimlerin sinerjistik etkileri çok iyi bilinmektedir ve bu enzimler, bitki biyokütle 21&#39;inde selüloz gibi diğer glikoconjugantları etkilemeden glikojen gibi α&#39;ya bağlı glukan olan nişastanın seçici hidrolizinde rutin olarak kullanılır. Serbest bırakılan glikoz, oksijenin hidrojen peroksite indirgenmesini katalize eden glikoz oksidaz ve glükozun bir laktona yükseltgenmesini katalizleyen bir enzim eşlenimli tahlilden sonra niceliksel olarak tespit edilir - ve peroksidaz hidrojen peroksitten pembe renkli bir kinonimin boyası üretir, Bir fenolik bileşik ve 4-aminoantipirin 22&#39;yi içerir .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="784">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">QSonica Sonicators Q700</td>
			<td style="width:219px;">Qsonica, LLC</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:167px;">QSonica</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SpectraMax 190 Microplate Reader&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Eliza plate reader</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bullet Blender Storm</td>
			<td style="width:219px;">Next Advance</td>
			<td style="width:119px;">BBY24M-CE</td>
			<td>Beads beater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer</td>
			<td style="width:219px;">Amersham Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">HCl</td>
			<td style="width:219px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">1-00317</td>
			<td>pH adjutment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">32319</td>
			<td>Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amyloglycosidase (Rhizopus sp.)</td>
			<td style="width:219px;">Megazyme</td>
			<td style="width:119px;">E-AMGPU</td>
			<td>Enzyme for glycogen depolymerization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#945;-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis)</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A3176</td>
			<td>Enzyme for glycogen depolymerization</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:219px;">Merch</td>
			<td style="width:119px;">8337</td>
			<td>Standard for the glucose assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pierce BCA Protein assay kit&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher scientific</td>
			<td style="width:119px;">23225</td>
			<td>For determination of protein concentrations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Aluminum drying trays, disposable</td>
			<td style="width:219px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">611-1362</td>
			<td>For determination of cell dry weights</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">D-Glucose assay kit (GODPOD format)</td>
			<td style="width:219px;">Megazyme</td>
			<td style="width:119px;">K-GLUC</td>
			<td>For determination of glucose concentrations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Zirconium oxide breads, 0.15 mm</td>
			<td style="width:219px;">Next Advance</td>
			<td style="width:119px;">ZrOB015</td>
			<td>Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">RINO tubes</td>
			<td style="width:219px;">Next Advance</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td>Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of the glycogen content in cyanobacteria

Siyanobakteriler, fotosentez sırasında ana hücre içi karbon ve enerji depolaması olarak glikojen biriktirir. Araştırmalardaki son gelişmeler, biyosentezin ve katabolizma döngüsü, redoks düzenlemesi ve kodlamayan RNA&#39;nın dahil edilmesi gibi kompleks mekanizmaları vurgulamıştır. Aynı zamanda, ürün verimi artırmak için, karbonu glikojenden genetik olarak tasarlanmış siyanobakterilerdeki istenen ürünlere yönlendirmek için çaba sarf edilmektedir. Değişken doğruluk ve teknik karmaşıklıkla, siyanobakterilerdeki glikojen içeriğini belirlemek için çeşitli yöntemler kullanılır. Burada, standart yaşam bilimi laboratuarında yapılabilen siyanobakterlerdeki glikojen içeriğini güvenilir şekilde belirlemek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Protokol, hücre lisatından glikojenin seçici olarak çökeltilmesini ve bir glikoz öküzü tarafından saptanan glikoz monomerlerinin üretilmesi için glikojenin enzimatik depololimerizasyonunu gerektirirIdase-peroksidaz (GOD-POD) enzim bağlı testi. Yöntem, Synechocystis sp. PCC 6803 ve Synechococcus sp. PCC 7002, metabolik mühendislikte yaygın olarak kullanılan iki model siyanobakteriyel tür. Üstelik, yöntem, düzenleyici elemanlarda veya glikojen biyosentetik genlerde bozuk olan vahşi tip ve mutantlar arasındaki glikojen içeriğinde başarılı bir şekilde farklılık sergiledi.

10 mL vahşi tipli Synechocystis sp. PCC 6803 , OD 730nm değeri yaklaşık 0.8&#39;e ulaşana kadar foto- ototrofik koşullar altında yetiştirildi. Hücreler hasat edilmiş ve 50 mM Tris-HC1, pH 8 içinde yeniden süspanse edilmiştir. OD 730 nm değeri 2-3&#39;e ayarlanmıştır. Glikojen içeriği, yukarıda tarif edilen protokolü izleyerek analiz edildi. OD 730nm başına glikojen içeriği 13 ± 1.8 μg / mL / OD <su...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria at JoVE.com

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Burada, siyanobakteriyel hücrelerdeki glikojen içeriğini ölçmek için güvenilir ve kolay bir test sunuyoruz. İşlem, çökeltme, seçilebilir depolimerizasyon ve glikoz artıklarının belirlenmesini gerektirir. Bu yöntem hem vahşi hem de genetik mühendisliği yapılmış suşlar için uygundur ve siyanobakterilerin metabolik mühendisliğini kolaylaştırabilir.

Siyanobakterlerde Glikojen İçeriğinin Belirlenmesi

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Etkili belirlenmesi tahlillerinde Peptit Agonistlerinin seri Seyreltme için Dağıtım Otomatik Akustik

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Dört Biyosensör Platformları kullanma Yüksek yakınlık Antikor-antijen Cilt Kinetiklerinin Belirlenmesi

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Yüksek işlem hacmi, mutlak nicel nokta kullanarak doku düzeyleri, seçili bir Protein içeriği tayini Blot Analizi (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis

Lipid dizin belirlenmesi mantar patojen Ustilago Maydis sıvı Floresans kurtarma tarafından

The article shows how to implement the LD index assay, which is a sensitive microplate assay to determine the accumulation of triacylglycerols (TAGs) in ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Demir içeriği tesislerinde ölçme kolorimetrik yöntemi

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis

Cyanobacterium Synechocystis Phycobiliprotein içeriğinde spektrofotometrik tayini

This is a simple protocol for the quantitative determination of phycobiliprotein content in the model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteins are ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Yüksek içeriği hedef nişan yapisan hücrelerdeki ölçmek için Imaging kullanarak

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Enrichment of Native Lipoprotein Particles with microRNA and Subsequent Determination of Their Absolute/Relative microRNA Content and Their Cellular Transfer Rate

MicroRNA ile yerli lipoprotein parçacıkları zenginleştirme ve onların mutlak/bağıl microRNA Içerik ve onların hücresel transfer hızı sonraki belirlenmesi

Lipoprotein particles are predominately transporters of lipids and cholesterol in the bloodstream. Furthermore, they contain small amounts of strands of ...

Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO

NEMO'nun IKK bağlayıcı alanının üretimi, kristalizasyonu ve Yapı Tayini

NEMO is a scaffolding protein which plays an essential role in the NF-&#954;B pathway by assembling the IKK-complex with the kinases IKK&#945; and ...

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

Protein Topografya Değişikliklerinin Belirlenmesinde Proteinlerin Hızlı Fotokimyasal Oksidasyonlarında Gerçek Zamanlı Telafinin Sağlanması

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...