Name: high-resolution episcopic microscopy (hrem) - simple and robust protocols for processing and visualizing organic materials
Uploaded: 2017-07-07T13:00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials at JoVE.com

المؤلفين أشكر تيم موهون لمساهماته إنفالوبال في تطوير هرم والبتراء هفيتر لتقديم العينات.

وقد أجريت جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية في جامعة فيينا الطبية. 1. إعداد العينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأجنة والأجنة الجنين (تصل إلى 5 × 5 × 5 مم 3 ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الأجنة أو أجزاء من الأجنة في 4٪ بفا / برنامج تلفزيوني أو تثبيتي بوين في 4 درجات مئوية لمدة 16-24 ساعة على الأقل تحت هزاز مستمر. ملاحظة: الأجنة من عدة أنواع ومراحل تنموية مختلفة يمكن استخدامها، مثل الزرد 48 ساعة، 19-h الفرخ والسمان، وكذلك الأجنة الماوس قبل الولادة، والتي استخدمت هنا (انظر ممثل النتائج ). تم حصاد العينات ونقلها إلى برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة للتدريج، قبل وضعها في تثبيتي. إذا لزم الأمر، وتقليم العينات مع مقص الصغيرة أو مشرط قبل التثبيت لتناسب قوالب التضمين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة تثبيتي وغسل الأنسجة الجنين في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية تحت روكين ثابتز لمدة 24 ساعة (2-3 تغييرات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجفف العينات في 70٪، 80٪، 90٪، 96٪ من الإيثانول في 4 درجات مئوية لمدة 2 - 3 ساعات لكل منهما. وضع أنابيب تحتوي على عينات على المدورة. ملاحظة: بالنسبة للعينات الصغيرة (&lt;2 × 2 × 2 مم 3 )، يمكن تقليل الوقت الذي تقع فيه العينة في كل إيثانول إلى 60 دقيقة. للعينات الكبيرة (&gt; 5 × 5 × 5 مم 3 )، يمكن تمديده إلى 4 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ الخطوات التالية تسلل تحت غطاء الدخان ارتداء قفازات واقية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حل تسلل بإضافة 1.25 غرام البنزويل بيروكسيد (المحفز الملدن) و 0.4 غرام يوزين إلى 100 مل من الحل A (لمزيد من التفاصيل، انظر جدول المواد ). تحريك هذا في كوب على لوحة التحريك المغناطيسي في 4 درجات مئوية حتى يوزين ومحفز يذوب تماما (2 - 3 ح). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العينات لمدة 12-24 ساعة في حل تسلل. يبقيه في 4 درجات مئوية تحت الهزاز المستمر أو التناوب. استبدال محلول تسلل مع حل جديد بعد 3 و 12ح. ملاحظة: تمديد وقت تسلل إلى 48 ساعة للأجنة الكبيرة (&gt; 1 سم تاج / طول رمي). </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد عينات الأنسجة الكبار (تصل إلى 5 × 5 × 7 مم 3 ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الأنسجة في 2٪ بفا / برنامج تلفزيوني يحتوي على 4٪ حمض الكربوليك في 4 درجات مئوية لمدة 3 أيام على الأقل. ملاحظة: عينة الأنسجة الناجمة عن الجلد والكبد والبنكرياس والكلى والغدة الدرقية والقلب والعضلات المخططة والدماغ والأعصاب ونماذج الورم من العديد من حديثي الولادة والبالغين البشر والقوارض والخنازير والذباب الفاكهة، وأسماك حمار وحشي يمكن أن تكون ثابتة في هذا الحل ومن ثم معالجتها للتصوير هرم (نحن إثبات تثبيت العينات؛ انظر ممثل النتائج ). استئصال عينات الأنسجة مع المباضع، مقص أو اللكمات الخزعة ونقلها مباشرة إلى تثبيتي. لتثبيت استخدام الأنسجة العصبية 4٪ بفا / برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة تثبيتي وغسل الأنسجة تحت تشغيل مياه الصنبور لمدة 3-6 ح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى العينات من قبل مكان لاحقفي 70٪، 80٪، 90٪، 96٪ من الإيثانول، مختلطة مع 0.4 غرام يوزين لكل 100 مل (2 - 3 ساعات لكل منهما). الحفاظ على الحلول مع العينات في 4 درجات مئوية تحت هزاز مستمر أو على المدورة. ملاحظة: بالنسبة للعينات الصغيرة (&lt;2 × 2 × 2 مم 3 )، يمكن تقليل الوقت الذي تقع فيه العينة في كل إيثانول إلى 60 دقيقة. لعينات كبيرة (&gt; 5 × 5 × 5 مم 3 )، ويمكن تمديدها إلى 4-8 ح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ جميع الخطوات التالية تسلل تحت غطاء الدخان ارتداء قفازات واقية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حل تسلل بإضافة 1.25 غرام البنزويل بيروكسيد (المحفز الملدن) و 0.4 غرام يوزين إلى 100 مل من الحل A (لمزيد من التفاصيل، انظر جدول المواد ). تحريك في كوب على لوحة التحريك المغناطيسي في 4 درجات مئوية حتى يوزين ومحفز يذوب تماما (2 - 3 ح). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع عينات في محلول تسلل لمدة 24 - 36 ساعة. يبقيه في 4 درجات مئوية تحت الهزاز المستمر أو التناوب. استبدال محلول تسلل مع حل جديد بعد 3 و12 ح. ملاحظة: للحصول على عينات كبيرة (&gt; 5 × 5 × 5 مم 3 ) تمديد وقت تسلل إلى 48 ساعة. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المواد العضوية الأخرى ملاحظة: تقليم بدائل الجلد والورق إلى الحجم المطلوب مع مقص العادية. لا حاجة إلى تثبيت. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخطي خطوات التثبيت والغسيل والجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ جميع الخطوات التالية تسلل تحت غطاء الدخان ارتداء قفازات واقية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حل تسلل بإضافة 1.25 غرام البنزويل بيروكسيد (المحفز الملدن) و 0.4 غرام يوزين إلى 100 مل من الحل A (لمزيد من التفاصيل، انظر جدول المواد ). تحريك في كوب في 4 درجات مئوية على لوحة التحريك المغناطيسي حتى يوزين ومحفز يتم حلها تماما (2 - 3 ح). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات مكان في حل تسلل لمدة 3-12 ساعة. يبقيه في 4 درجات مئوية تحت الهزاز المستمر أو التناوب. استبدال محلول تسلل مع حل جديد بعد 1 و 2 - 4 ح. </li></ol> &lt;/ لى&gt; </ol></li></ol> 2. التضمين ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات تحت غطاء الدخان ارتداء قفازات واقية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حل تسلل جديدة كما هو موضح أعلاه (الخطوة 1.1.4.1). إضافة 4 مل سولوتيون B (لمزيد من التفاصيل، انظر جدول المواد ) إلى 100 مل حل تسلل لإعداد الحل التضمين. ملاحظة: إذا كان التوجه الدقيق للعينة في قوالب التضمين مطلوب والسماح لتضمين عدة عينات في موازاة ذلك، وإبطاء البلمرة من الحل الأسهم عن طريق وضع الكأس في حمام الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام صواني كوب صب (لمزيد من التفاصيل، انظر جدول المواد ) مع قوالب وجود حجم روتيني من 6 × 8 × 5 مم 3 أو 13 × 19 × 5 مم 3 ، أو قوالب مخصصة مع وحدات تخزين تصل إلى 8 × 10 × 15 ملم 3 ( الشكل 2 ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء قوالب مع حل التضمين ونقل العينة في القالب باستخدامملعقة. أثناء النقل ضمان أن العينة مغطاة بالكامل مع تضمين الحل لتجنب محاصرة الهواء. ملاحظة: يمكن القيام بذلك في درجة حرارة الغرفة، إذا بدأت مباشرة بعد جمع العينات وحل التضمين من الثلاجة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توجيه العينة داخل القالب باستخدام الإبر أو ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حالما يبدأ الحل التضمين يصبح لزج، وضع حامل كتلة (انظر جدول المواد ) على رأس القالب وإضافة حل التضمين من خلال الثقب المركزي لحامل كتلة حتى يتم تغطية قاعدة حامل كتلة مع 1 - 2 مم من حل التضمين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم علبة صب صب من خلال تغطيتها مع السائل البارافين الشمع وانتظر حتى تصلب. بدلا من ذلك وضع علبة كوب صب الثانية رأسا على عقب على علبة كوب صب مع عينات وختم عليه مع شريط لاصق للهواء واقية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح كتل لإنهاء البلمرة عن طريق تخزين صواني كأس صب مختومة ل 1 -2 أيام في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالنسبة إلى معالجة ما بعد البلمرة، ضع صواني الكوب الصب مع الكتل المبلمرة في فرن مختبر معياري وقم بخبزها عند 70 - 80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن يوم واحد إلى يومين حتى تصبح حمراء داكنة. جمع الصواني من الفرن وإزالة الكتل من القالب. ملاحظة: يمكن أن يتم الخبز في ظل الظروف البيئية العادية. علبة كؤوس صب الصب، التي تضمن ختم الهواء في المرحلة الأولى بعد التضمين، يمكن إزالتها للسماح لفحص لون الراتنج بعد 10 ساعة. مباشرة بعد الخبز، الراتنج لينة والكتل يمكن إزالتها بسهولة من علبة صب صب. في غضون 2 - 3 ساعات هم من الصعب ويمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر. </li></ol> 3. توليد البيانات ملاحظة: يتضمن النموذج هرم 18 ، 25 المستخدمة هنا العناصر التالية: (1) مشراح دوار مع حامل كتلةالذي يتوقف بعد كل قطع في نقطة تحول العليا. (2) القياسية، غير القابل للتصرف مشراح سكين، المعادن الصلبة، الشخصية D (لمزيد من التفاصيل، انظر جدول المواد ). (إي) رئيس المجهر مضان مجمع مع مسدس موضوعي و غفب مرشح مكعب (الإثارة 470/40، فلتر الانبعاثات 525/50) في محورها البصري. يتم ترتيب المحور البصري عمودي على سطح قطع حديثا من كتلة شنت على مشراح ويقف من قبل الجهاز الذي يسمح الحركة صعودا وهبوطا. (4) الجدول عبر الآلية بمحرك مشراح. يمكن تحويل الجدول في اتجاه المحور البصري وأفقيا. (v) كاميرا فيديو رقمية تعلق على المجهر المركب الفلورسنت. (6) مصدر الضوء أحادي اللون (470 نانومتر). &#39;7&#39; الحاسوب المتصل بالكاميرا، مع برمجيات لتوليد البيانات (للاطلاع على التفاصيل، انظر جدول المواد ). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد المنطقة التي تهمك. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مختبر القياسية لي(انظر جدول المواد ) لتوجيه الضوء الأبيض بشكل غير مباشر إلى سطح الكتلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الخطوط العريضة للمادة المضمنة كما أنها مشاريع لسطح الكتلة. تشير إلى المنطقة ذات الاهتمام ومجال الرؤية في وقت لاحق على سطح كتلة باستخدام القلم أو شفرة حلاقة. ملاحظة: هذه الخطوة إلزامية لتحديد مدى مجال الرؤية قبل التقسيم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد مجال الرؤية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل كتلة الراتنج مع عينة على مشراح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل حامل كتلة إلى موقف وقفها (نقطة تحول العليا من رحلة حامل كتلة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تشغيل الكاميرا الرقمية وبرامج توليد البيانات، والحصول على صورة حية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار عدسة موضوعية، مع التكبير المناسب لتغطية منطقة الاهتمام المشار إليها على سطح الكتلة. ملاحظة: الأهداف مع التكبير 2.5X، 5X، 10X، 20X والفتحات الرقمية بين 0.07 و 0.40 تستخدم عادة. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البصرية صعودا وهبوطا ومشراح أفقيا باستخدام الجدول الصليب الآلية حتى تتطابق المنطقة ذات الاهتمام مع مجال الرؤية المعروضة على شاشة الكمبيوتر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التركيز. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء خطوة بخطوة دليل سيكتيونينغ حتى الهياكل الأولى من العينة تصبح مرئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترتيب سطح كتلة في مستوى التركيز من البصرية، عن طريق تحريك مشراح في اتجاه المحور البصري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار سمك القسم. ويوصى سمك القسم من 0.5 إلى 5 ميكرون. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد البيانات ومعالجتها <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء البرنامج الروتيني الذي ينظم التقسيم والتقاط الصور. اتبع التعليمات الموثقة من برامج التقاط التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقف البرامج الروتينية ووضع شريحة التحجيم أمام سطح كتلة بمجرد أن مقطوع تماما العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صورة تفاعلية للحصول على معايرة في وقت لاحقنشوئها. ملاحظة: يجب أن يتم ذلك في كل مرة يتم استخدام الهدف في ترتيب رتبت حديثا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل سلسلة الصورة إلى 8 بت الصور الرمادي مقياس in.jpg. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل سلسلة صورة في برنامج التصور 3D وضبط التناقضات. ملاحظة: يمكن أن يتم تحويل الصورة والتصور 3D مع مختلف البرامج التجارية أو المتاحة بحرية حزم البرمجيات القياسية، وفقا للتعليمات من البرنامج المعني. </li></ol></li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

هريم هو طريقة مجهرية قوية للغاية التي هي مثالية لتصور مجموعة واسعة من المواد العضوية المستخدمة في الطب الحيوي والصناعة 18 و 21 و 26 و 27 و 28 و 29 و 30 و 31 و 32 و 33 و 34 و 35 و 36 و 37 ، 38 ، 39 ، 40 . ويمكن استخدامه كطريقة تصوير حصرية، كما تستخدم حاليا من قبل آليات اضطرابات النمو (دمد) برنامج 41 ، 42 <sup&gt;، 43 ، 44 ، أو كجزء تكاملي من خطوط الأنابيب التصوير المتعدد الوسائط 45 . ويمكن تجميع جهاز توليد البيانات هرم يعمل بشكل كامل من مكونات المختبر التقليدية ويضم مشراح الآلية، المجهر، طاولة الصليب الآلية، وجهاز كمبيوتر مع البرامج المناسبة 25 . فمن الأهمية بمكان لاستخدام مشراح مجهزة حامل كتلة التي تتكاثر بشكل متكرر بعد كل قسم في موقف محدد ومكعبات مرشح غفب داخل المسار البصري. ومع ذلك، يمكن شراء حلول شاملة تماما من شركات مثل إنديجو سسينتيفيك. يواجه هرم نفس القيود مثل جميع التقنيات النسيجية، إلا أنه لا يتم إدخال أي القطع الأثرية أثناء التقسيم أو قسم التركيب. ومع ذلك، هناك قيود، والتي تنتج عن ضرورة وصمة عار العينات قبل التقسيم ومن خصائص مادة التضمين. مطلوب اختراق يوزين من خلال العينة بأكملها للحصول على تناقضات الأنسجة كافية. مواد كثيفة جدا، والأنسجة الدهنية والمواد غير العضوية تعيق بشكل فعال يوزين الاختراق وهذا يؤدي إلى الأنسجة غير ملوثين في وسط الكائنات. باستخدام مثبتات خاصة يساعد على وصمة عار عينات الجلد، ولكن لا يزال هناك أي طريقة مناسبة للتغلب على المشكلة تماما. هناك قيود أخرى هي أن الراتنجات التي تمنع أعلى من 2 سم تميل إلى كسر أثناء التقسيم. ويمكن تجنب ذلك جزئيا عن طريق قطع العينات وأجزاء المعالجة بشكل منفصل. تحديد المواقع الصحيحة من العينات الصغيرة أو العينات مع الأسطح غير النظامية في القوالب أثناء التضمين غالبا ما يكون إشكالية. تغطي العينات مع الاغاروز وتجهيز كتل الاغاروز كما هو موضح في البروتوكول عادة ما يحل هذه المسألة 19 . نهج بديل، الذي يساعد أيضا إذا كتل كسر خلال سكتيعلى إزالة كتلة صلبة بالفعل من حاملها وتضمينها من جديد، بعد إجراء التضمين وصفها. وتتألف مجموعة بيانات نموذجية هرم من 500 إلى 3000 صورة مفردة. يتم تحديد قرارها العددي عن طريق المسافة بين الصور المتعاقبة ( أي ، من خلال سمك القسم)، وخاصية الهدف الكاميرا، وخصائص البصريات المستخدمة. استخدمنا سمك القسم بين 1 ميكرون و 5 ميكرون وحققت نتائج جيدة، على الرغم من أن البروتوكولات المقدمة لا القضاء تماما مشرقة من التحف 20 ، 46 . وتنتج هذه التحف عن طريق الأنسجة الملطخة بشكل مكثف تقع في عمق كتلة، مما أدى إلى طمس معلومات الأنسجة على أسطح كتلة من قبل. كانت الكاميرات تستهدف أبعاد 2،560 × 1،920 بكسل 2 ، 2،048 × 2،048 بكسل 2 ، و 4،096 × 4،096 بكسل 2 وكانت كومبينيد مع 1.25X، 2.5X، 5X، 10X، و 20X العدسات الموضوعية. وأدى هذا إلى أحجام بكسل رقمية بين 0.18 × 0.18 ميكرون 2 و 5.92 × 5.92 ميكرون 2 ، والتي أثبتت أنها كافية لتحليل 3D من بنية الأنسجة والأشكال الخلية، وحتى لتصور نوى. ونظرا لارتفاع القرار الرقمي، يجب أن تكون عضيات الخلايا الأخرى مرئية كذلك. تناقضات غير كافية بسبب تلطيخ يوسين بسيطة، والخصائص البصرية للأهداف يقلل بشكل كبير من إمكانية التمييز الهياكل. القرار المكاني الحقيقي الأقصى للبيانات هرم، الذي يأخذ في الاعتبار الفتحة الرقمية، هو تقريبا 1 × 1 × 1 ميكرون 3 ، وبالتالي يسمح فقط التمييز الفعال للهياكل أكبر من حوالي 3 × 3 × 3 ميكرون 3 . وهناك مشكلة مشتركة لجميع تقنيات التصوير الرقمي هو التبادل بين حجم مجال الرؤية، والذي يحدد جزء من العينة التي يمكن عرضهاd على هدف الكاميرا، والقرار الرقمي للصورة. وكلما كان مجال الرؤية أكبر، كلما انخفض القرار الرقمي الأقصى 46 . يسمح الإعداد هرم المستخدمة هنا توليد بيانات هرم مع مجال الرؤية بين 0.74 × 0.74 مم 2 (20X الهدف) عرضها في قرار رقمي 0.18 × 0.18 ميكرون 2 و 12.12 × 12.12 مم 2 (1.25X الهدف) المعروضة في وهو قرار رقمي 2.96 × 2.96 ميكرون 2 . يمكن للمجموعات البديلة والمتجانسة أن توفر مجالات أوسع من وجهات النظر، ولكن على حساب الحل الحقيقي. ومع ذلك، فإنها توفر نتائج ممتازة، كما يتضح من البيانات المعروضة على الصفحة الرئيسية لبرنامج دمد 47 .

التحليل الهيكلي للمواد العضوية وغير العضوية هو الخطوة الأولى في فهم الخواص الفيزيائية والوظيفة. أساس هذا التحليل في كثير من الأحيان هو ثنائي الأبعاد المعلومات (2D) المكتسبة من قبل مراقبة دقيقة من الأقسام النسيجية، مع مجموعة متنوعة من أساليب التصوير بسيطة ومتطورة التي تستخرج تفاصيل بنية الأنسجة، مورفولوجيا الخلية والطوبولوجيا والتكوين الجزيئي والخصائص الميكانيكية الحيوية 1 ، 2 ، 3 . ومع ذلك، فإن المعلومات 2D غير مناسبة للبحث الترتيبات المعقدة مكانيا. وبالتالي فإن عددا متزايدا من في الجسم الحي والطرق خارج الجسم الحي التي تسمح بإنشاء بيانات حجم الرقمية في العقود الأخيرة 4 وغيرها الكثير قيد التطوير. المبدأ المنهجي لمعظم أساليب توليد البيانات حجم هو توليد مداخن الظاهريمن الصور الرقمية التي تعرض المقاطع المكتسبة عن طريق التقسيم الظاهري أو المادي للكائن. إذا تم محاذاة الصور القسم بشكل صحيح، وهذا يخلق وحدة تخزين، والتي يمكن إعادة المقطع في طائرات القسم الظاهري، أو استخدامها لخلق 3D سطح وحجم النماذج المقدمة. التقنيات الشائعة لتصور البشر وعينات بيولوجية أكبر هي التصوير المقطعي بالرنين المغناطيسي والتصوير المقطعي المحوسب والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (بيت) والتصوير المقطعي بالانبعاث أحادي الفوتون (سبيكت). وعادة ما تصور العينات الصغيرة باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي المغنطيسي (التصوير المقطعي بالرنين المغناطيسي) والتصوير المقطعي الضوئي البصري (أوبت) والتصوير المقطعي البصري التماسك (أوكت) والتصوير المقطعي الضوئي (بات) والطرق القائمة على التقطيع النسيجي والمجهر البؤري والتصوير المقطعي بالإلكترون 5 و 6 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 <sأوب&gt;، 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، 17 . وهناك طريقة جديدة نسبيا لتوليد البيانات الحجمية، والتي تنتج بيانات رقمية من العينات الصغيرة وعينات الأنسجة النسيجية هي طريقة هريم، الذي تم تطويره بالتعاون الوثيق مع تيم موهون 18 ، 19 . بل هو تقنية المجهر بسيطة تستند، الذي يولد البيانات حجم الرقمية من الراتنج جزءا لا يتجزأ من المواد التي مقطوع على مشراح. البيانات تسهيل تحليل مفصل لهندسة الأنسجة والتوزيعات الخلية وكذلك تحليل متري من الميزات الصغيرة على المستوى المجهري ضوء المتوسطة. تنتج هريم مجموعات من الصور الرقمية المحاذاة بطبيعتها والتي تظهر كما لو تم التقاطها من eأوسين أقسام نسيجية ملطخة. تباين الأنسجة ودقة البيانات فيما يتعلق مجال الرؤية تتجاوز تلك التي تنتجها مع μCT، μMRI، والأراضي الفلسطينية المحتلة، ولكن أقل من ذلك يمكن تحقيقه مع متحد البؤر، ورقة ضوء والمجهر الإلكتروني 20 . ومع ذلك، وعلى النقيض من هذا الأخير، هرم قادر على تصور العينات مع كميات كبيرة نسبيا تصل إلى 5 × 5 × 7 مم 3 في الجودة النسيجية. وهناك عدد من الدراسات الحديثة توفر خصائص مفصلة ومقارنات من مزايا وعيوب تقنيات التصوير واحد و، من أجل الموضوعية، نشير إلى تلك لمزيد من المعلومات بشأن القيود والمجالات المحتملة من التطبيقات 4 ، 21 ، 22 ، 23 ، 24 . وتركز هذه الدراسة على طريقة التصوير هرم ويهدف إلى توفيروبروتوكولات بسيطة جدا لتوليد البيانات هرم من مجموعة واسعة من المواد العضوية، فضلا عن أمثلة لتطبيقها. سير العمل لإنشاء بيانات هرم بسيطة ويسري على جميع المواد التي يمكن تضمينها في راتنج ميثاكريلات ( الشكل 1 ). ومع ذلك هناك اختلافات محددة الأنسجة في إعداد العينة، التي تحتاج إلى النظر فيها. ولذلك فإننا نقدم ثلاثة بروتوكولات القياسية لإعداد عينات مختلفة. التضمين وخطوات بروتوكول توليد البيانات متطابقة لكل منهم.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672">
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:231px;">JB-4 Plus Embedding Kit</td>
			<td style="width:115px;">Polysciences Europe GmbH</td>
			<td style="width:161px;">18570-1</td>
			<td style="width:167px;">includes Benzoyl Peroxide, Plasticized (Catalyst) and Solution A+B</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Polyethylene Molding Cup Trays, 6x8x5mm hexagon (9 cavities)</td>
			<td style="width:115px;">Polysciences Europe GmbH</td>
			<td style="width:161px;">17177A-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Polyethylene Molding Cup Trays, 13x19x5mm (9 cavities)</td>
			<td style="width:115px;">Polysciences Europe GmbH</td>
			<td style="width:161px;">17177C-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">JB-4 Plastic Block Holders</td>
			<td style="width:115px;">Polysciences Europe GmbH</td>
			<td>15899-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">Eosin</td>
			<td style="width:115px;">Waldeck GmbH &#38; Co. KG, Division Chroma</td>
			<td style="width:161px;">1A-196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Microtec CUT 4060E</td>
			<td></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>rotary microtome</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:231px;">Leica DM LM, fluorescence compound microscope</td>
			<td style="width:115px;">Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:231px;">GFP filter set</td>
			<td style="width:115px;">Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td>
			<td style="width:161px;">11090937180000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:231px;">Motorised cross table</td>
			<td style="width:115px;">Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH &#38; CO. KG</td>
			<td style="width:161px;">KT5-LSMA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Digital video camera SPOT-FLEX</td>
			<td style="width:115px;">Visitron Systems GmbH.</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">precisExcite High-Power LED</td>
			<td style="width:115px;">Visitron Systems GmbH.</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>light source</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">VisiView 2.1.4</td>
			<td style="width:115px;">Visitron Systems GmbH.</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>Image capturing software</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:231px;">Hard metal knife (tungsten carbide), profile D</td>
			<td style="width:115px;">Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">KL 2500 LCD</td>
			<td style="width:115px;">Schott AG</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>light source </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution episcopic microscopy (hrem) - simple and robust protocols for processing and visualizing organic materials

نحن نقدم بروتوكولات بسيطة لتوليد البيانات حجم الرقمية مع عالية الدقة ابيسكوبي المجهري (هريم) الأسلوب. هريم قادر على تصوير المواد العضوية مع وحدات التخزين تصل إلى 5 × 5 × 7 مم 3 في قرارات رقمية نموذجية بين 1 × 1 × 1 و 5 × 5 × 5 ميكرون 3 . يتم تضمين العينات في راتنج ميثاكريلات ومقسم على مشراح. بعد كل قسم يتم التقاط صورة من سطح كتلة مع كاميرا الفيديو الرقمية التي يجلس على فوتوتوب متصلا رئيس المجهر المركب. المحور البصري يمر عبر بروتين الفلورسنت الأخضر (غفب) مرشح مكعب ويتماشى مع الموقف، الذي الذراع بوك حامل يأتي للراحة بعد كل قسم. وبهذه الطريقة، يتم إنتاج سلسلة من الصور الرقمية الانحياز بطبيعتها، وعرض الأسطح كتلة لاحقة. تحميل مثل هذه السلسلة صورة في ثلاثي الأبعاد (3D) برنامج التصور يسهل التحويل الفوري إلى البيانات حجم الرقمية، والتي تسمح الظاهرية قإكتينغ في مختلف الطائرات المتعامدة والمائلة وإنشاء حجم والسطحية نماذج الكمبيوتر المقدمة. نقدم ثلاثة بروتوكولات محددة، الأنسجة محددة لمعالجة مجموعات مختلفة من العينات العضوية، بما في ذلك الماوس والفرخ والسمان والضفدع والأجنة زيبرا الأسماك، والمواد خزعة الإنسان، ورقة غير مصقول ومواد استبدال الجلد.

هريم يولد سلسلة من الصور الرقمية الانحياز بطبيعتها مع تناقضات مماثلة لصور الهيماتوكسيلين / يوسين أقسام النسيجية الملون. على عكس الصور القسم 2D، مداخن من الصور هريم تسمح لتصور وتحليل بنية الأنسجة، التشكل، وطوبولوجيا مجموعة واسعة من المواد العضوية في 3D. التباين العالي في كثير من الأحيان يسهل التصور 3D سريعة وبسيطة من نماذج الكمبيوتر التي تم تقديمها حجم ونتائج كفاف شبه التلقائي لتوليد نماذج سطح المقدمة. يختلف حجم البيانات هرم وفقا لحجم الهدف الكاميرا، ووضع التقاط الصور (8، 12، 16 بت، مقياس الرمادية واللون) وعدد من الصور كتلة واحدة الوجه. مجموعات بيانات أصغر من 1000 8-bit.jpg صور مقياس رمادي من 2،048 بكسل × 2،048 بكسل حجمها حوالي 900 مب. مجموعات بيانات أكبر من 3000 8-bit.jpg الصور مقياس رمادي من 4،096 ص<html> بكسل × 4،096 بكسل لديها حجم ما يقرب من 20 غيغابايت. البروتوكولات المقدمة هي بسيطة وقوية، وخلال العقد الماضي، كانوا يعملون لتوليد بيانات هرم للعديد من العينات المختلفة. تم تحسين القسم بروتوكول 1.1 لمعالجة الأجنة كاملة من الكائنات الحية النموذجية الطبية مع طول يصل إلى 1 سم وعينات الأنسجة الجنين مع بعد تصل إلى 5 × 5 × 5 مم 3 ؛ استخدمنا هذه الطريقة لإنتاج بيانات هرم من الأجنة من الأنواع التالية: الفأر ( موس موسولوس) ، فرخ ( غالوس غالوس )، زيبرا فيش ( دانيو ريريو )، السمان ( كوترنيكس كوترنيكس) ، الضفدع الأفريقي المخلب ( زينوبوس ليفيس ) إكوس فيروس كابالوس )، علة اللبن ( أونكوبيلتوس فاسياتوس )، التمساح ( كروكوديليا )، والأخطبوط ( الأخطبوط فولغاريس ). وكانت بيانات جميع الأنواع ذات نوعية ممتازة (على سبيل المثال ، الشكل 3 ) أس = &quot;jove_content&quot; فو: كيب-together.within-بادج = &quot;1&quot;&gt; تم تحسين القسم بروتوكول 1.2 لمعالجة عينات الأنسجة والأنسجة البالغة بأبعاد تصل إلى 5 × 5 × 7 مم 3 ، وتستخدم لتصوير عينات الأنسجة من والجلد والكبد والبنكرياس والكلى والغدة الدرقية والقلب والعضلات المخططة والدماغ والأعصاب ونماذج الورم التي تحصد من البشر ( هومو سابينز ) والفئران ( موس موسولوس ) والجرذان ( راتوس نورفيجيكوس ) والخنازير ( سوس سكروفا دوميستيكا ) فيريت ( مستيلا فورو )، ذبابة الفاكهة ( ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر )، والأسماك زيبرا ( دانيو ريريو ). في حين كانت النتائج ممتازة مع معظم العينات (على سبيل المثال ، الشكل 4 ، الرسوم المتحركة 1 )، الأجزاء المركزية جدا من الجلد (مع البشرة) وعينات الدماغ أكبر من 3 × 3 × 3 مم 3 في كثير من الأحيان بقيت غير ملوثين بسبب عدم كفاية اختراق يوسين من خلال هذه الأنسجة. البروتوكول sوكان الأمثل 1.3 إكتيون لمعالجة المواد العضوية الليفية وتستخدم لتصور بنية الألياف من الورق المطلي، ورقة غير مصقول، المواد بديلا الجلد الأصلي والخلايا الجذعية المصنفة الجلد المواد بديلا. وكانت هذه العينات سهلة وسريعة لمعالجة. كانت البيانات من الورق غير المصقول ومعظم بدائل الجلد ذات نوعية جيدة ( الشكل 5 ، الرسوم المتحركة 2 ). حدثت مشاكل في معالجة الورق المطلي، عندما أعاقت المواد غير العضوية اختراق يوزين. حدثت مشكلة أخرى عند معالجة بدائل الجلد على أساس أجار لأنها هضمت جزئيا من قبل حل تسلل. <img alt="شكل 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig1.jpg" /> الشكل 1: سير العمل. الخطوات المعروضة في الصناديق الحمراء تتطلب تعديلات وفقا لخصائص العينة. الخطوات في الصناديق الخضراء هي تلك التيهي مماثلة في جميع العينات. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/56071fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig2.jpg" /> الشكل 2: قوالب مخصصة. قوالب يمكن تكييفها عن طريق قطع حفرة في القالب الأصلي، وإدراج لمبة من ماصة باستور وختم ذلك مع المواد النمذجة. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/56071fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig3.jpg" /> الشكل 3: الأجنة تصور بشكل غير عادي. (A، B) الجنين الماوس تحصد في يوم الجنينية، E = 9.5. تظهر صورة قسم هريم في (A) </قوية&gt;. يظهر حجم عرض نموذج 3D يظهر السطح في (B) . (C) قسم سهمي الظاهري من خلال حجم نموذج المقدمة من الرقبة من جنين الماوس E15.5. (D) الجنين الفرخ في هامبورجر التنموية هاميلتون (ه) المرحلة 18. نموذج السطح من لومينا من مكونات القلب والأوعية الدموية جنبا إلى جنب مع حجم تقديم جميع أنسجة الجنين. مقياس الحانات = 200 ميكرون. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/56071fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig4.jpg" /> الشكل 4: عينات الأنسجة الكبار تصور بشكل غير عادي. (A) جزء من صورة قسم هرم من خلال العصب البشري. ترصيع يظهر مقطع من الصورة بمزيد من التفصيل. (B) جزء من صورة قسم هرم من خلال الكبد الخنازير. لاحظ nuclei. (C) جزء من صورة قسم هرم من الأنسجة اللمفاوية البشرية. (D، E) جلد سميك من لوحة الإبهام الإنسان. حجم المقدمة نموذج 3D من الخزعة بأكملها. (D) نماذج سطح المقدمة من الشرايين والأوردة والأعصاب أمام استئصال الظاهري من خلال بيانات هرم (E) . (F) الورم التجريبي في الأنسجة الماوس الكبار. حجم تقديم نموذج 3D أمام ثلاثة أقسام افتراضية من خلال بيانات هريم. لاحظ أجزاء نخرية (السهام). مقياس الحانات = 200 ميكرون. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/56071fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig5.jpg" /> الشكل 5: المواد الليفية المرئية بشكل غير عادي. (A، B) هريم صورة القسم من غير مصقول، ورقة البني. (ب) </s<html> ترونغ&gt; يظهر قسم من (A) . لاحظ الألياف وتجويفها. (C) قسم هريم من الورق المطلي. لاحظ أن الألياف لا تزال غير ملوثين. (D) حجم تقديم نموذج من المواد البدلة الجلد الأصلي. لاحظ عيار مختلف وشكل من الألياف. الحانات مقياس = 100 ميكرون. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/56071fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="فيلم 1" src="/files/ftp_upload/56071/56071mov1.jpg" /> الرسوم المتحركة 1: حجم المقدمة نموذج من الجلد السميك من وسادة الإبهام الإنسان. حجم كتلة الأنسجة حوالي 4.2 × 2.7 × 2.7 مم 3 . حجم فوكسل هو 1.07 × 1.07 × 2 ميكرون 3 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/animation1.mp4" target="_blank">الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)</a> كلاس = &quot;jove_content&quot; فو: كيب-together.within-بادج = &quot;1&quot;&gt; <img alt="فيلم 2" src="/files/ftp_upload/56071/56071mov2.jpg" /> الرسوم المتحركة 2: حجم تقديم نموذج من المواد الأصلية الجلد البديل. حجم العينة حوالي 1.2 × 0.85 × 0.4 مم 3 . حجم فوكسل هو 0.54 × 0.54 × 2 ميكرون 3 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/animation2.mp4" target="_blank">الرجاء النقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials at JoVE.com

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

نحن نقدم بروتوكولات بسيطة وقوية لمعالجة المواد خزعة من مختلف الأنواع والأجنة من الكائنات الحية الحيوية نموذج والعينات من الأنسجة العضوية الأخرى من أجل السماح الرقمية توليد البيانات حجم مع عالية الدقة المنهج المجهري إبيسكوبيك.

عالية الدقة مجهر ابيسكوبي (هريم) - بروتوكولات بسيطة وقوية لمعالجة وتصور المواد العضوية

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

تحليل التنمية الكلى الزرد مع الوقت الفاصل بين التصوير باستخدام مجهر تشريح مجهزة لباجتزاء البصري

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy

سرعة اقتناء الصور 3D باستخدام عالية الدقة Episcopic المجهر

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

غرفة بسيطة للتصوير متحد البؤر على المدى الطويل من تطوير الجذر والهيبوكوتيل

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

بروتوكولات لتصور الستيرويدي المنشأ أجهزة وهيئات التفاعلية مع المناعية في ذبابة الفاكهة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

أفقي جبل كامل: A معالجة الرواية والتصوير بروتوكول للثدي، ثلاثة-- الأبعاد الأنسجة عبر-- أقسام الجلد

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

القرار فائقة الارتباطية والميكروسكوب الإلكتروني لحل التعريب البروتين في الشبكية الزرد

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

تصوير هرمي متعدد الوسائط من مقاطع المسلسل للعثور على أهداف محددة الخلوية داخل كميات كبيرة

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

تصوير الخلايا الحية لفصل الكروموسومات أثناء الانقسام

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Thin Film Composite Silicon Elastomers for Cell Culture and Skin Applications: Manufacturing and Characterization

رقيقة اللدائن السيليكون المركبة الفيلم لخلية ثقافة وتطبيقات الجلد: التصنيع وتوصيف

In this protocol, we present methods to fabricate thin elastomer composite films for advanced cell culture applications and for the development of skin ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...