Name: high-resolution episcopic microscopy (hrem) - simple and robust protocols for processing and visualizing organic materials
Uploaded: 2017-07-07T13:00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials at JoVE.com

Forfatterne takker Tim Mohun for sine invalubale bidrag til udvikling af HREM og Petra Heffeter for at give prøver.

Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med etiske retningslinjer ved det medicinske universitet i Wien. 1. Prøveforberedelse <ol><li> Forberedelse af embryoner og embryonvæv (op til 5 x 5 x 5 mm 3 ) <ol><li> Fiks embryoner eller dele af embryoerne i 4% PFA / PBS eller Bouins fixativ ved 4 ° C i mindst 16-24 timer under konstant rocking. BEMÆRK: Embryoner af flere arter og forskellige udviklingsstadier kan anvendes, såsom 48-h zebrafisk, 19 h kylling og vagtel, og også prenatale musembryoer, som blev anvendt her (se repræsentative resultater ). Prøverne blev høstet og overført til PBS ved stuetemperatur til scanning, inden de blev sat i fikseringsmiddel. Om nødvendigt, trim prøverne med mikro-saks eller skalpeller forud for fiksering for at passe ind i indlejringsformene. </li><li> Fjern fiksativet og vask embryovævet i PBS ved 4 ° C under konstant rockinG i 24 timer (2-3 ændringer). </li><li> Dehydrere prøverne i 70%, 80%, 90%, 96% ethanol ved 4 ° C i 2 - 3 timer hver. Placer rør, der indeholder prøverne på en rotator. BEMÆRK: For små prøver (&lt;2 x 2 x 2 mm 3 ) kan den tid, en prøve hviler i hver ethanol, reduceres til 60 minutter. For store prøver (&gt; 5 x 5 x 5 mm 3 ) kan den forlænges til 4 timer. </li><li> Udfør følgende infiltrationstrin under en gashætte med beskyttelseshandsker. <ol><li> Forbered infiltreringsopløsningen ved at tilsætte 1,25 g benzoylperoxid (blødgjort katalysator) og 0,4 g eosin til 100 ml opløsning A (for mere detaljer, se Materialebeskrivelse ). Rør dette i et bægerglas på en magnetisk omrøringsplade ved 4 ° C, indtil eosin og katalysator er fuldt opløst (2 - 3 timer). </li><li> Placer prøverne i 12 - 24 timer i infiltrationsopløsningen. Opbevar den ved 4 ° C under kontinuerlig rocking eller rotation. Udskift infiltreringsopløsning med frisk opløsning efter 3 og 12h. BEMÆRK: Forlæng infiltrationstiden til 48 timer for store embryoner (&gt; 1 cm kron / rump længde). </li></ol></li></ol></li><li> Klargøring af vævsprover (op til 5 x 5 x 7 mm 3 ) <ol><li> Fix vævene i 2% PFA / PBS indeholdende 4% carbolsyre ved 4 ° C i mindst 3 dage. BEMÆRK: Vævsprøve som følge af hud-, lever-, bugspytkirtlen, nyren, skjoldbruskkirtlen, hjerte-, striated muskel-, hjerne-, nerver- og tumormodeller fra flere neonatale og voksne mennesker, gnavere, svin, frugtfly og zebrafisk kan fastgøres i denne opløsning Og derefter behandlet til HREM billedbehandling (vi demonstrerer fastsættelse af prøverne, se repræsentative resultater ). Punk de vævsprøver med skalpeller, saks eller biopsi slag og direkte overføre dem til fikserende. Til fastgørelse af nervesvæv bruger 4% PFA / PBS. </li><li> Fjern fiksativet og vask vævet under rindende vand i 3-6 timer. </li><li> Dehydrere prøverne ved senere placeringIndgiv dem i 70%, 80%, 90%, 96% ethanol, blandet med 0,4 g eosin pr. 100 ml (2-3 h hver). Opbevar opløsningerne med prøver ved 4 ° C under konstant rocking eller på rotator. BEMÆRK: For små prøver (&lt;2 x 2 x 2 mm 3 ) kan den tid, en prøve hviler i hver ethanol, reduceres til 60 minutter. For store prøver (&gt; 5 x 5 x 5 mm 3 ) kan den forlænges til 4-8 timer. </li><li> Udfør alle følgende infiltrationstrin under en gashætte med beskyttelseshandsker. <ol><li> Forbered infiltreringsopløsningen ved at tilsætte 1,25 g benzoylperoxid (blødgjort katalysator) og 0,4 g eosin til 100 ml opløsning A (for flere detaljer, se tabel over materialer ). Rør et bægerglas på en magnetisk omrøringsplade ved 4 ° C, indtil eosinet og katalysatoren er fuldt opløst (2 - 3 timer). </li><li> Anbring prøver i infiltrationsopløsning i 24 - 36 timer. Opbevar den ved 4 ° C under kontinuerlig rocking eller rotation. Udskift infiltreringsopløsning med frisk opløsning efter 3 og12 timer. BEMÆRK: For store prøver (&gt; 5 x 5 x 5 mm 3 ) forlænges infiltrationstiden til 48 timer. </li></ol></li></ol></li><li> Forberedelse af andet organisk materiale BEMÆRK: Trim hudsubstitutter og papir til den ønskede størrelse med almindelig sakse. Ingen fiksering er nødvendig. <ol><li> Spring over fiksering, vask og dehydreringstrin. </li><li> Udfør alle følgende infiltrationstrin under en gashætte med beskyttelseshandsker. <ol><li> Forbered infiltreringsopløsningen ved at tilsætte 1,25 g benzoylperoxid (blødgjort katalysator) og 0,4 g eosin til 100 ml opløsning A (for flere detaljer, se tabel over materialer ). Rør et bægerglas ved 4 ° C på en magnetisk omrøringsplade, indtil eosin og katalysator er fuldt opløst (2 - 3 timer). </li><li> Anbring prøver i infiltrationsopløsning i 3-12 timer. Opbevar den ved 4 ° C under kontinuerlig rocking eller rotation. Udskift infiltreringsopløsning med frisk opløsning efter 1 og 2 - 4 timer. </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol></li></ol> 2. Embedding BEMÆRK: Udfør alle trin under en kogeplade med beskyttelseshandsker. <ol><li> Forbered frisk infiltrationsopløsning som beskrevet ovenfor (trin 1.1.4.1). Tilsæt 4 ml opløsning B (for detaljer, se tabel over materialer ) til 100 ml infiltrationsopløsning for at forberede indlejringsopløsningen. BEMÆRK: Hvis der kræves præcis orientering af prøven i indlejringsformene, og for at indlejre flere prøver parallelt, sænk polymeriseringen af ​​stamopløsningen ved at sætte bægeret i et isbad. </li><li> Brug støbekopperbræt (for detaljer, se Materialebeskrivelse ) med forme, der har et rutinemængde på 6 x 8 x 5 mm 3 eller 13 x 19 x 5 mm 3 eller tilpassede forme med mængder på op til 8 x 10 x 15 mm 3 ( figur 2 ). </li><li> Fyld forme med indlejringsopløsning og overfør prøven ind i støbeformenen ske. Under overførslen skal du sikre, at prøven er fuldt dækket med indlejringsopløsning for at undgå luftindfangning. BEMÆRK: Dette kan gøres ved stuetemperatur, hvis det påbegyndes straks efter samling af prøverne og indlejringsopløsningen fra køleskabet. <ol><li> Orient prøven inde i formen ved hjælp af nåle eller tang. </li><li> Så snart indlejringsopløsningen begynder at blive viskøs, skal du placere en blokholder (se Tabel af Materialer ) oven på formen og tilsæt indlejringsopløsning gennem blokholderens centrale hul, indtil blokholderens bund er dækket med 1 - 2 Mm af indlejringsopløsning. </li><li> Tæt støbebeholderen ved at dække den med flydende paraffinvoks og vent til den er hærdet. Alternativt placeres en anden støbekopbakke opad på formstøbtbakken med prøver og forsegles den med tape til lufttæt. </li></ol></li><li> Lad blokke afslutte polymerisering ved at lagre de forseglede støbekopper bakker til 1 -2 dage ved stuetemperatur. </li><li> Til efterpolymeriseringsbehandling placeres støbeformbakken med de polymeriserede blokke i en standard laboratorieovn og bages ved 70 - 80 ° C i mindst 1 til 2 dage, indtil de bliver mørkerøde. Saml bakkerne fra ovnen og fjern blokken fra formen. BEMÆRK: Bagning kan ske under normale miljøforhold. Dækstøbeskålbakken, som sikrer lufttæt forsegling i den første fase efter indlejring, kan fjernes for at muliggøre kontrol af farven af ​​harpiksen efter 10 timer. Umiddelbart efter bagning er harpiksen blød og blokkerne kan let fjernes fra støbebeholderen. Inden for 2 - 3 timer er de hårde og kan opbevares ved stuetemperatur i flere måneder. </li></ol> 3. Data Generation BEMÆRK: HREM prototypen 18 , 25, der anvendes her, omfatter følgende elementer: (i) Roterende mikrotom med en blokholderDer stopper efter hver snit ved dens øverste vendepunkt. (Ii) Standard, ikke-disponibel mikrotomkniv, hårdmetal, profil D (for detaljer, se Materialebeskrivelse ). (Iii) Hoved af fluorescensforbindelsesmikroskop med objektivrevolver og en GFP-filterkube (excitation 470/40; emissionsfilter 525/50) i sin optiske akse. Den optiske akse er anbragt vinkelret på den friskskårne overflade af en blok monteret på mikrotomet og holdes af en indretning, der tillader op- og nedadgående bevægelse. (Iv) Motoriseret tværbord med mikrotome. Bordet kan forskydes i retning af den optiske akse og sideværts. (V) Digitalt videokamera fastgjort til fluorescerende forbindelsesmikroskop. (Vi) Monokrom lyskilde (470 nm). (Vii) Computer tilsluttet kameraet, med data generation software (for detaljer, se Materialebeskrivelse ). <ol><li> Procedure <ol><li> Angiv region af interesse. <ol><li> Brug standard laboratorium liGht kilde (se Tabel af materialer ) til at rette hvidt lys skråt til blokoverfladen. </li><li> Identificer konturerne af det indlejrede materiale, som det projekterer til blokoverfladen. Angiv region af interesse og senere synsfelt på blokoverfladen ved hjælp af en pen eller knivblad. BEMÆRK: Dette trin er obligatorisk til at definere omfanget af synsfeltet inden sektionering. </li></ol></li><li> Definer synsfeltet. <ol><li> Monter harpiksblokken med prøve på mikrotomen. </li><li> Flyt blokholderen til stoppositionen (øverste vendepunkt for blokholderens udflugt). </li><li> Start digitalkameraet og data generation software, og erhverve et levende billede. </li><li> Vælg en objektiv linse med en passende forstørrelse for at dække det område af interesse, der er angivet på blokoverfladen. BEMÆRK: Mål med forstørrelser 2.5X, 5X, 10X, 20X og numeriske aperturer mellem 0,07 og 0,40 bruges almindeligt. </li&gt; <li> Flyt optikken opad og nedad og mikrotomen sideværts ved hjælp af det motoriserede tværbord, indtil interessepunktet matcher synsfeltet, der vises på computerskærmen. </li></ol></li><li> Fokus. <ol><li> Udfør trinvis trin manuel sektion, indtil de første strukturer i prøven bliver synlige. </li><li> Arranger blokoverfladen i optikets fokusplan ved at flytte mikrotomet i retning af den optiske akse. </li><li> Vælg sektionstykkelse; Snittykkelser fra 0,5 til 5 μm anbefales. </li></ol></li></ol></li><li> Datagenerering og -behandling <ol><li> Start software rutine, der orkestrerer snitning og billedoptagelse. Følg den dokumenterede vejledning til billedoptagelsesprogrammet. </li><li> Stop software rutine og sæt et skalereglid foran blokoverfladen, så snart prøven er fuldstændigt snittet. </li><li> Optag et billede interaktivt for senere kalibreringtion. BEMÆRK: Dette skal gøres hver gang et mål anvendes i en nyligt arrangeret opsætning. </li><li> Konverter billedserien til 8 bit gråskala billeder in.jpg format. </li><li> Indlæs billedserien i 3D visualiseringssoftware og juster kontraster. BEMÆRK: Billedkonvertering og 3D-visualisering kan udføres med forskellige kommercielt eller frit tilgængelige standardpakker, som følger med den respektive software. </li></ol></li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

HREM er en meget robust mikroskopisk metode, der er ideel til visualisering af et bredt spektrum af organiske materialer anvendt i biomedicin og industri 18 , 21 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 38 , 39 , 40 . Det kan anvendes som en eksklusiv billeddannelsesmodalitet, som i øjeblikket anvendes af DMDD-programmets mekanismer 41 , 42 <suP&gt;, 43 , 44 eller som en integrerende del af multimodale billeddannelsesrørledninger 45 . Et fuldt fungerende HREM-datagenereringsapparat kan samles fra konventionelle laboratoriekomponenter og omfatter et motoriseret mikrotom, mikroskop, motoriseret tværsnit og en computer med passende software 25 . Det er kritisk at bruge et mikrotome udstyret med en blokholder, der reproducerbart stopper efter hver sektion i en bestemt position og GFP filterkuber inde i den optiske vej. Imidlertid kan fuldt fungerende all inclusive-løsninger købes hos virksomheder som Indigo Scientific. HREM står over for de samme begrænsninger som alle histologiske teknikker, bortset fra at ingen artefakter introduceres under sektion eller sektionsmontering. Der er imidlertid begrænsninger, som skyldes nødvendigheden af ​​at plette prøver før snitning ogFra embeddedmaterialets egenskaber. Penetration af eosin gennem hele prøven er påkrævet for at opnå tilstrækkelige vævskontraster; Meget tæt materiale, fedtvæv og anorganiske stoffer hindrer effektivt eosinindtrængning, og dette resulterer i ufarvet væv i midten af ​​genstandene. Brug af specielle fixativer hjælper pletter hudprøver, men der er stadig ingen ordentlig metode til fuldt ud at overvinde problemet. En anden begrænsning er, at harpikser, der blokerer højere end 2 cm, har tendens til at bryde under snitning. Dette kan delvist undgås ved at skære prøverne og behandle dele separat. Korrekt positionering af små prøver eller prøver med uregelmæssige overflader i forme under indlejring er ofte problematisk. Omsætning af prøverne med agarose og behandling af agaroseblokkene som beskrevet i protokollen løser normalt dette problem 19 . En alternativ tilgang, som også hjælper, hvis blokke brydes under sektionenAt fjerne den allerede hærdede blok fra holderen og indlejre den på ny efter den beskrevne indlejringsprocedure. Et typisk HREM datasæt omfatter 500 til 3.000 enkeltbilleder. Dens numeriske opløsning bestemmes af afstanden mellem de successive billeder ( dvs. af sektionstykkelse), karakteristikken for kameraets mål og egenskaberne af den anvendte optik. Vi anvendte snittykkelser mellem 1 μm og 5 μm og opnåede gode resultater, selv om de præsenterede protokoller ikke fuldstændigt eliminerer skinner fra artefakter 20 , 46 . Disse artefakter er forårsaget af intenstfarvede væv placeret dybt inde i blokken, hvilket resulterer i uskarphed af vævsinformation på blokfladerne ved. Kameraerne havde måldimensioner på 2.560 x 1.920 pixels 2 , 2.048 x 2.048 pixels 2 og 4.096 x 4.096 pixels 2 og var combiNed med objektiver med 1.25X, 2.5X, 5X, 10X og 20X. Dette resulterede i numeriske pixelstørrelser mellem 0,18 x 0,18 μm 2 og 5,92 x 5,92 μm 2 , hvilket viste sig at være tilstrækkeligt til 3D analyse af vævarkitektur og celleformer og endog til visualisering af kerner. I betragtning af den høje numeriske opløsning skal andre cellelegemer også være synlige. Utilstrækkelige kontraster på grund af simpel eosinfarvning, og de optiske egenskaber af målene reducerer dramatisk muligheden for at diskriminere strukturer. Den maksimale sande rumlige opløsning af HREM-dataene, der tager højde for den numeriske blænde, er ca. 1 x 1 x 1 μm 3 og tillader derfor kun effektiv diskrimination af strukturer større end ca. 3 x 3 x 3 μm 3 . Et fælles problem for alle digitale billedteknikker er afvejningen mellem størrelsen af ​​synsfeltet, som definerer den del af prøven, der kan visesD på kameraets mål og den numeriske opløsning af billedet. Jo større synsfelt, jo lavere er den maksimale mulige numeriske opløsning 46 . HREM-opsætningen, der anvendes her, tillader generering af HREM-data med et synsfelt mellem 0,74 x 0,74 mm 2 (20X objektiv) vist i en numerisk opløsning på 0,18 x 0,18 μm 2 og 12,12 x 12,12 mm 2 (1,25 x objektiv) vist i En numerisk opløsning på 2,96 x 2,96 μm 2 . Alternative, kommercielle opsætninger kan give større synsfelter, men på bekostning af ægte opløsning. Ikke desto mindre giver de fremragende resultater, som det fremgår af de data, der vises på DMDD-programmets hjemmeside 47 .

Strukturel analyse af organiske og uorganiske materialer er det første skridt i at forstå deres fysiske egenskaber og funktion. Grundlaget for en sådan analyse er ofte todimensionale (2D) informationer opnået ved omhyggelig observation af histologiske sektioner med en række simple og sofistikerede billeddannelsesmetoder, der ekstraherer detaljer af vævarkitektur, cellemorfologi og topologi, molekylær sammensætning og biomekaniske egenskaber 1 , 2 , 3 . 2D-information er imidlertid ikke egnet til at undersøge rumligt komplekse arrangementer. Derfor er et stigende antal in vivo og ex vivo metoder, der tillader dannelsen af ​​digitale volumedata, etableret i de sidste årtier 4 og mange flere er under udvikling. Det metodiske princip for de fleste volumedatagenereringsmetoder er dannelsen af ​​virtuelle stablerAf digitale billeder, der viser sektioner opnået ved virtuel eller fysisk sektion af et objekt. Hvis sektionsbillederne er korrekt justeret, skaber dette et volumen, der kan genopdeles i virtuelle sektionsplaner eller bruges til at oprette 3D overflade- og volumengengiverede modeller. Populære teknikker til visualisering af mennesker og større biologiske prøver er magnetisk resonanstomografi (MRT), computertomografi (CT), positronemissionstomografi (PET) og single-photon emission computed tomography (SPECT). Små eksemplarer visualiseres som regel ved hjælp af mikromagnetisk resonansbilleddannelse (μMRI), optisk projektionstomografi (OPT), optisk koherensomografi (OCT), fotoakustisk tomografi (PAT), histologiske sektionsbaserede metoder, konfokalmikroskopi og elektrontomografi 5 , 6 7 , 8 , 9 , 10 <sUp&gt;, 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . En relativt ny volumen datagenereringsteknik, der producerer digitale data fra små prøver og histologiske vævsprøver, er HREM-metoden, som blev udviklet i tæt samarbejde med Tim Mohun 18 , 19 . Det er en simpel mikroskopbaseret teknik, der genererer digitale volumedata fra harpiksindlejret materiale, der er snittet på en mikrotome. Dataene lette detaljeret analyse af vævsarkitektur og celledistribution samt metrisk analyse af små funktioner på et mellemliggende lysmikroskopisk niveau. HREM producerer stabler af iboende justerede digitale billeder, der vises som om optaget fra eOsinfarvede histologiske sektioner. Vævskontrast og dataopløsning i forhold til synsfeltet overstiger dataene produceret med μCT, μMRI og OPT, men er lavere end det, der kan opnås med konfokal, lysark og elektronmikroskopi 20 . I modsætning til sidstnævnte er HREM imidlertid i stand til at visualisere prøver med relativt store volumener på op til 5 x 5 x 7 mm 3 i histologisk kvalitet. En række nyere undersøgelser giver detaljerede karakteriseringer og sammenligninger af fordele og ulemper ved de enkelte billeddannelsesteknikker, og vi henviser af hensyn til objektivitet til dem for yderligere information om deres begrænsninger og potentielle anvendelsesområder 4 , 21 , 22 , 23 , 24 . Denne undersøgelse fokuserer på HREM billeddannelsesmetoden og sigter mod at giveMeget enkle protokoller til generering af HREM data fra et bredt spektrum af organiske materialer samt eksempler på deres anvendelse. Arbejdsstrømmen til oprettelse af HREM-data er enkel og gælder for alle materialer, der kan indlejres i methacrylatharpiks ( figur 1 ). Der er dog vævsspecifikke forskelle i prøvepræparation, der skal overvejes. Vi leverer derfor tre standardprotokoller til fremstilling af forskellige prøver. Indlejrings- og dataproduktionsprotokolstrin er ens for dem alle.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672">
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:231px;">JB-4 Plus Embedding Kit</td>
			<td style="width:115px;">Polysciences Europe GmbH</td>
			<td style="width:161px;">18570-1</td>
			<td style="width:167px;">includes Benzoyl Peroxide, Plasticized (Catalyst) and Solution A+B</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Polyethylene Molding Cup Trays, 6x8x5mm hexagon (9 cavities)</td>
			<td style="width:115px;">Polysciences Europe GmbH</td>
			<td style="width:161px;">17177A-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Polyethylene Molding Cup Trays, 13x19x5mm (9 cavities)</td>
			<td style="width:115px;">Polysciences Europe GmbH</td>
			<td style="width:161px;">17177C-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">JB-4 Plastic Block Holders</td>
			<td style="width:115px;">Polysciences Europe GmbH</td>
			<td>15899-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">Eosin</td>
			<td style="width:115px;">Waldeck GmbH &#38; Co. KG, Division Chroma</td>
			<td style="width:161px;">1A-196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Microtec CUT 4060E</td>
			<td></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>rotary microtome</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:231px;">Leica DM LM, fluorescence compound microscope</td>
			<td style="width:115px;">Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:231px;">GFP filter set</td>
			<td style="width:115px;">Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td>
			<td style="width:161px;">11090937180000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:231px;">Motorised cross table</td>
			<td style="width:115px;">Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH &#38; CO. KG</td>
			<td style="width:161px;">KT5-LSMA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Digital video camera SPOT-FLEX</td>
			<td style="width:115px;">Visitron Systems GmbH.</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">precisExcite High-Power LED</td>
			<td style="width:115px;">Visitron Systems GmbH.</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>light source</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">VisiView 2.1.4</td>
			<td style="width:115px;">Visitron Systems GmbH.</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>Image capturing software</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:231px;">Hard metal knife (tungsten carbide), profile D</td>
			<td style="width:115px;">Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">KL 2500 LCD</td>
			<td style="width:115px;">Schott AG</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>light source </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution episcopic microscopy (hrem) - simple and robust protocols for processing and visualizing organic materials

Vi leverer enkle protokoller til generering af digitale volumedata med HREM-metoden med højopløsnings-episkopisk mikroskopi. HREM kan forestille organiske materialer med volumener op til 5 x 5 x 7 mm 3 i typiske numeriske opløsninger mellem 1 x 1 x 1 og 5 x 5 x 5 μm 3 . Prøverne er indlejret i methacrylatharpiks og snittet på et mikrotom. Efter hvert afsnit indfanges et billede af blokoverfladen med et digitalt videokamera, der sidder på fotobåndet, der er forbundet med det sammensatte mikroskophoved. Den optiske akse passerer gennem et grønt fluorescerende protein (GFP) filterkube og er justeret med en position, hvor bockholderarmen hviler efter hver sektion. På denne måde produceres en serie af iboende justerede digitale billeder, der viser efterfølgende blokoverflader. Indlæser en sådan billedserie i tredimensionel (3D) visualiseringssoftware muliggør den øjeblikkelige konvertering til digitale volumedata, hvilket tillader virtuelle sEctioning i forskellige ortogonale og skrå planer og oprettelsen af ​​volumen og overfladede computermodeller. Vi præsenterer tre enkle, vævsspecifikke protokoller til behandling af forskellige grupper af økologiske prøver, herunder mus, chick, vagtel, frø og zebrafiskembryoer, humant biopsiemateriale, ubestrøget papir og hududskiftningsmateriale.

HREM genererer serie af iboende justerede digitale billeder med kontraster, der ligner billeder af hæmatoxylin / eosinfarvede histologiske sektioner. I modsætning til 2D-sektionsbilleder tillader stabler af HREM-billeder visualisering og analyse af vævsarkitektur, morfologi og topologi af et bredt udvalg af organiske materialer i 3D. Den høje kontrast letter ofte hurtig og simpel 3D-visualisering af lydgengivne computermodeller og semiautomatiske konturfund til generering af overfladegengiverede modeller. HREM-dataens størrelse varierer afhængigt af kameraets mål, billedoptagelsestilstanden (8, 12, 16 bit, grå skala, farve) og antallet af enkeltbloksidebilleder. Mindre datasæt med 1.000 8-bit.jpg gråskala billeder på 2.048 pixels x 2.048 pixels har en størrelse på omkring 900 MB. Større datasæt med 3.000 8-bit.jpg gråskala billeder på 4.096 pIxel x 4.096 pixel har en mængde på ca. 20 GB. De fremlagte protokoller er enkle og robuste, og i det sidste årti var de ansat til at generere HREM-data fra mange forskellige enheder. Protokolafsnit 1.1 blev optimeret til behandling af hele embryoner af biomedicinske modelorganismer med en længde på op til 1 cm og embryonvævsprover med en dimension på op til 5 x 5 x 5 mm 3 ; Vi anvendte denne metode til fremstilling af HREM-data af embryoner af følgende arter: mus ( Mus musculus) , kylling ( Gallus gallus ), zebrafisk ( Danio rerio ), vagtel ( Coturnix coturnix) , afrikansk klovn ( Xenopus laevis ), hest Equus ferus caballus ), milkweed bug ( Oncopeltus fasciatus ), krokodille ( Crocodylia ) og blæksprutte ( Octopus vulgaris ). Dataene for alle arter var af fremragende kvalitet ( fx figur 3 ) <p clAss = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Protokolafsnit 1.2 blev optimeret til behandling af juvenile og voksne vævsprøver med dimensioner op til 5 x 5 x 7 mm 3 og anvendt til visualisering af vævsprøver af Hud, lever, bugspytkirtlen, nyren, skjoldbruskkirtel, hjerte, striated muskel, hjerne, nerver og tumormodeller høstet fra mennesker ( Homo sapiens ), mus ( Mus musculus ), rotter ( Rattus norvegicus ), svin ( Sus scrofa domestica ) ferret ( Mustela Furo ), frugtflyve ( Drosophila melanogaster ) og zebrafisk ( Danio rerio ). Mens resultaterne var fremragende med de fleste prøver ( fx Figur 4 , Animation 1 ) forblev de meget centrale dele af huden (med epidermier) og hjerneprøver større end 3 x 3 x 3 mm 3 ofte ufarvede på grund af utilstrækkelig penetration af eosin gennem Disse væv. Protokol sEktion 1.3 blev optimeret til behandling af fibrøst organisk materiale og anvendt til visualisering af fiberarkitekturen af ​​belagt papir, ikke-belagt papir, nativt dermal substitutionsmateriale og stamceller-frøet dermal substitutionsmateriale. Disse prøver var nemme og hurtige at behandle. Dataene på det ikke-coatede papir og de fleste hudsubstitutter var af god kvalitet ( Figur 5 , Animation 2 ). Der opstod problemer ved behandling af det coatede papir, da det uorganiske materiale hindrede indtrængning af eosin. Et andet problem opstod ved behandling af hudsubstitutterne på basis af agar, fordi de blev delvist fordøjet af infiltreringsopløsningen. <img alt="figur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig1.jpg" /> Figur 1: Workflow. Trin vist i de røde kasser kræver ændringer i overensstemmelse med stikprøveegenskaber. Trin i de grønne kasser er dem derEr ens i alle prøver. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/56071fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig2.jpg" /> Figur 2: Tilpassede former. Forme kan tilpasses ved at skære et hul i den originale form, indsætte pæren af ​​en Pasteur pipette og forsegle den med modelleringsmateriale. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/56071fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig3.jpg" /> Figur 3: Eksempelvis visualiserede embryoer. (A, B) Musembryo høstet på embryonisk dag, E = 9,5. HREM sektionsbillede er vist i (A) </strong&gt;. Lydgengivelse 3D-model, der viser overfladen, er vist i (B) . (C) Virtuel sagittal sektion gennem en volumengengivet model af halsen af ​​et E15.5 musembryo. (D) Chick embryo ved Hamburger Hamilton (HH) fase 18. Overflademodel af armaturen i de kardiovaskulære komponenter kombineret med volumengengivelse af alle embryonvæv. Skalestænger = 200 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/56071fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig4.jpg" /> Figur 4: Eksempelvis visualiserede Voksne Vævsprøver. (A) En del af et HREM sektionsbillede gennem en menneskelig nerve. Inlay viser en del af billedet mere detaljeret. (B) En del af en HREM sektion billede gennem svine leveren. Bemærk nuclei. (C) Del af et HREM sektionsbillede af humant lymfatisk væv. (D, E) Tykkelse af en menneskelig tommelplade. Volumen gengivet 3D-model af hele biopsien. (D) Overfladede modeller af arterier, vener og nerver foran en virtuel resektion gennem HREM data (E) . (F) Eksperimentel tumor i voksen musvæv. Volumen gengivet 3D-model foran tre virtuelle sektioner gennem HREM-data. Bemærk de nekrotiske dele (arrowheads). Skalestænger = 200 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/56071fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig5.jpg" /> Figur 5: Eksempelvis visualiseret fibermateriale. (A, B) HREM sektion billede af ubelagt, brunt papir. (B) </sTrong&gt; viser et afsnit af (A) . Bemærk fibrene og deres lumen. (C) HREM sektion af belagt papir. Bemærk, at fibrene forbliver ufarvede. (D) Volumengengivet model af indfødt dermal substitutionsmateriale. Bemærk de forskellige kaliber og form af fibrene. Skalestænger = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/56071fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/56071/56071mov1.jpg" /> Animation 1: Lydgengivelse af tykt hud af en menneskelig tommelstang. Størrelsen af ​​vævsblokken er ca. 4,2 x 2,7 x 2,7 mm 3 . Voxel størrelse er 1,07 x 1,07 x 2 um 3 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/animation1.mp4" target="_blank">Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)</a> <pClass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Film 2" src="/files/ftp_upload/56071/56071mov2.jpg" /> Animation 2: Volume Rendered Model af Native Dermal Substitute Material. Størrelsen af ​​prøven er ca. 1,2 x 0,85 x 0,4 mm 3 . Voxel størrelse er 0,54 x 0,54 x 2 μm 3 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/animation2.mp4" target="_blank">Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials at JoVE.com

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

Vi leverer enkle og robuste protokoller til behandling af biopsi materiale af forskellige arter, embryoner af biomedicinske modelorganismer og prøver af andre organiske væv for at muliggøre digital volumen data generation med den højopløselige episkopiske mikroskopi metode.

High-Resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple og robuste protokoller til behandling og visualisering af organiske materialer

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse af zebrafisk Kidney Udvikling med Time-lapse Imaging Ved hjælp af en dissektionsmikroskop Udstyret til Optical Sektionsinddeling

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy

Hurtig Erhvervelse af 3D-billeder Brug høj opløsning Episcopic Microscopy

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

En simpel afdeling til langvarig konfokal billeddannelse af rod- og hypokotyludvikling

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protokoller til visualisering steroidogeniske organer og deres interaktive organer med Immunfarvning i bananfluen<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontal Hel Mount: En Novel Processing and Imaging Protocol for Tykke, Tredimensionale Tissue Tværsnit af Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Korrelationsmaalinger super-opløsning og elektronmikroskopi at løse Protein lokalisering i zebrafisk nethinden

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Multimodal hierarkisk billeddannelse af serielle sektioner for at finde specifikke cellulære mål inden for store mængder

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levende celle billeddannelse af kromosom Segregation under mitosen

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Thin Film Composite Silicon Elastomers for Cell Culture and Skin Applications: Manufacturing and Characterization

Tynd Film sammensat silicium elastomerer for cellekultur og hud applikationer: fremstilling og karakterisering

In this protocol, we present methods to fabricate thin elastomer composite films for advanced cell culture applications and for the development of skin ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal plade i Gastrulating mus embryoner ved hjælp af Scanning elektronmikroskopi og hele Mount immunfluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...