Name: high-resolution episcopic microscopy (hrem) - simple and robust protocols for processing and visualizing organic materials
Uploaded: 2017-07-07T13:00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials at JoVE.com

Författarna tackar Tim Mohun för sina invalubala bidrag till att utveckla HREM och Petra Heffeter för att ge prov.

Alla procedurer utfördes i enlighet med etiska riktlinjer vid Medicinska Universiteten i Wien. 1. Provberedning <ol><li> Förberedelse av embryon och embryonvävnader (upp till 5 x 5 x 5 mm 3 ) <ol><li> Festa embryon eller delar av embryon i 4% PFA / PBS eller Bouins fixativ vid 4 ° C under minst 16-24 timmar under konstant rockning. ANMÄRKNING: Embryon av flera arter och olika utvecklingsstadier kan användas, såsom 48-h zebrafisk, 19-timmars chick och vaktel, och även prenatala musembryon, som användes här (se representativa resultat ). Proverna skördades och överfördes till PBS vid rumstemperatur för staging innan de sattes i fixativ. Om nödvändigt, trimma proverna med mikro-sax eller skalpeller före fixering för att passa in i inbäddningsformarna. </li><li> Ta bort fixativet och tvätta embryovävnaden i PBS vid 4 ° C under konstant rockinG i 24 h (2-3 ändringar). </li><li> Dehydrera proverna i 70%, 80%, 90%, 96% etanol vid 4 ° C i 2-3 timmar vardera. Placera rör som innehåller proven på en rotator. OBS! För små prov (&lt;2 x 2 x 2 mm 3 ) kan tiden som ett prov vilar i varje etanol reduceras till 60 minuter. För stora prov (&gt; 5 x 5 x 5 mm 3 ) kan det förlängas till 4 h. </li><li> Utför följande infiltreringssteg under en avluftningsdragning med skyddshandskar. <ol><li> Förbered infiltreringslösningen genom att tillsätta 1,25 g bensoylperoxid (mjukad katalysator) och 0,4 g eosin till 100 ml lösning A (för mer detaljer, se tabell över material ). Rör om detta i en bägare på en magnetisk omröringsplatta vid 4 ° C tills eosin och katalysator är helt upplösta (2 - 3 h). </li><li> Placera proverna i 12 - 24 timmar i infiltreringslösningen. Håll det vid 4 ° C under kontinuerlig gungning eller rotation. Byt infiltreringslösning med ny lösning efter 3 och 12h. OBS: Förläng infiltrationstiden till 48 timmar för stora embryon (&gt; 1 cm krona / rump längd). </li></ol></li></ol></li><li> Förberedelse av vuxna vävnadsprover (upp till 5 x 5 x 7 mm 3 ) <ol><li> Fixa vävnaderna i 2% PFA / PBS innehållande 4% karbonsyra vid 4 ° C under minst 3 dagar. ANMÄRKNING: Vävnadsprovet som härrör från hud-, lever-, bukspottkörtel-, njure-, sköldkörtel-, hjärt-, ryggradsmuskeln, hjärnan, nerverna och tumörmodellerna hos flera neonatala och vuxna människor, gnagare, grisar, fruktflugor och zebrafiskar kan lösas i denna lösning Och sedan bearbetas för HREM-bildbehandling (vi demonstrerar fixeringen av proven, se representativa resultat ). Punkta vävnadsproverna med skalpeller, saxar eller biopsi-slag och direkt överföra dem till fixativ. För fixering av nervvävnad använd 4% PFA / PBS. </li><li> Ta bort fixativet och tvätta vävnaden under rinnande kranvatten i 3-6 h. </li><li> Dehydrera proverna med senare placeringIngående i 70%, 80%, 90%, 96% etanol, blandad med 0,4 g eosin per 100 ml (2-3 timmar vardera). Håll lösningarna med prov vid 4 ° C under konstant rockning eller på rotatorn. OBS! För små prov (&lt;2 x 2 x 2 mm 3 ) kan tiden som ett prov vilar i varje etanol reduceras till 60 minuter. För stora prov (&gt; 5 x 5 x 5 mm 3 ) kan det förlängas till 4-8 h. </li><li> Utför alla följande infiltreringssteg under en avluftningsdragning med skyddshandskar. <ol><li> Förbered infiltreringslösningen genom att tillsätta 1,25 g bensoylperoxid (mjukad katalysator) och 0,4 g eosin till 100 ml lösning A (för mer detaljer, se tabell över material ). Rör i en bägare på en magnetisk omröringsplatta vid 4 ° C tills eosinet och katalysatorn är helt upplösta (2-3 timmar). </li><li> Placera prov i infiltrationslösningen i 24 - 36 h. Håll det vid 4 ° C under kontinuerlig gungning eller rotation. Byt infiltreringslösning med ny lösning efter 3 och12 h. OBS! För stora prov (&gt; 5 x 5 x 5 mm 3 ) förläng infiltrationstiden till 48 h. </li></ol></li></ol></li><li> Förbereder annat organiskt material OBS! Trim hudbyten och papper till önskad storlek med vanlig sax. Ingen fixering behövs. <ol><li> Hoppa över fixerings-, tvätt- och uttorkningssteg. </li><li> Utför alla följande infiltreringssteg under en avluftningsdragning med skyddshandskar. <ol><li> Förbered infiltreringslösningen genom att tillsätta 1,25 g bensoylperoxid (mjukad katalysator) och 0,4 g eosin till 100 ml lösning A (för mer detaljer, se tabell över material ). Rör i en bägare vid 4 ° C på en magnetisk omröringsplatta tills eosin och katalysator är helt upplösta (2 - 3 h). </li><li> Placera prov i infiltrationslösningen i 3 - 12 h. Håll det vid 4 ° C under kontinuerlig gungning eller rotation. Byt infiltreringslösning med ny lösning efter 1 och 2 - 4 timmar. </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol></li></ol> 2. Inbäddning OBS! Utför alla steg under en avluftningsdragning med skyddshandskar. <ol><li> Förbered ny infiltreringslösning enligt beskrivningen ovan (steg 1.1.4.1). Tillsätt 4 ml lösning B (för detaljer, se tabell över material ) till 100 ml infiltreringslösning för att förbereda inbäddningslösningen. OBS! Om det behövs exakt orientering av provet i inbäddningsformarna och för att möjliggöra inbäddning av flera prover parallellt, sakta ner polymerisationen av stamlösningen genom att sätta bägaren i ett isbad. </li><li> Använd formgjutningsbunkar (för detaljer, se Materialblock ) med formar som har en rutinvolym på 6 x 8 x 5 mm 3 eller 13 x 19 x 5 mm 3 eller skräddarsydda formar med volymer upp till 8 x 10 x 15 mm 3 ( figur 2 ). </li><li> Fyll i formarna med inbäddningslösning och överför provet till formen meden sked. Under överföringen säkerställs att provet är helt täckt med inbäddningslösning för att undvika luftfångning. OBS! Detta kan göras vid rumstemperatur, om det påbörjas omedelbart efter samling av proven och inbäddningslösningen från kylskåpet. <ol><li> Rikta provet inuti formen med hjälp av nålar eller tångar. </li><li> Så snart inbäddningslösningen börjar bli viskös, placera en blockhållare (se tabell över material ) ovanpå formen och tillsätt inbäddningslösning genom blockhållarens centrala hål tills blockhållarens botten är täckt med 1 - 2 Mm av inbäddningslösning. </li><li> Täta gjutskålen genom att täcka den med flytande paraffinvax och vänta tills det har härdat. Alternativt placera ett andra formskålskål upp och ner på gjutskålfacket med prov och täta det med tejp till lufttäthet. </li></ol></li><li> Tillåt blockering att slutföra polymerisationen genom att lagra de förseglade gjutskålen för 1 -2 dagar vid rumstemperatur. </li><li> För efterpolymeriseringsbehandling placerar du formningsskålen med polymeriserade block i en standard laboratorieugn och baka i 70 - 80 ° C i minst 1 till 2 dagar tills de blir mörktröda. Samla brickorna ur ugnen och ta bort blocken från formen. OBS: Bakning kan ske under normala miljöförhållanden. Den täckande formningsbägaren, som säkerställer lufttät tätning i den första fasen efter inbäddning, kan avlägsnas för att möjliggöra kontroll av hartsfärgen efter 10 h. Omedelbart efter bakning är hartset mjukt och blocken kan lätt avlägsnas från formningsbägaren. Inom 2-3 timmar är de svåra och kan förvaras vid rumstemperatur i flera månader. </li></ol> 3. Data Generation OBS! HREM-prototypen 18 , 25 som används här innefattar följande punkter: (i) Rotationsmikrotom med en blockhållareSom stannar efter varje snitt vid sin övre vändpunkt. (Ii) Standard, icke-disponibel mikrotomkniv, hårdmetall, profil D (för detaljer, se Materialförteckning ). (Iii) Huvud av fluorescensföreningsmikroskop med objektivrevolver och en GFP-filterkub (excitation 470/40; emissionsfilter 525/50) i sin optiska axel. Den optiska axeln är anordnad vinkelrätt mot den nyklippta ytan av ett block monterat på mikrotomen och hålls av en anordning som tillåter upp- och nedåtgående rörelse. (Iv) Motoriserat korsbord som bär mikrotomen. Bordet kan flyttas i den optiska axelns riktning och i sidled. (V) Digital videokamera ansluten till fluorescerande föreningsmikroskopet. (Vi) Monokrom ljuskälla (470 nm). (Vii) Dator ansluten till kameran, med datalagringsprogramvara (för detaljer, se Materialtabell ). <ol><li> Procedur <ol><li> Ange intresseområdet. <ol><li> Använd standard laboratorium liGht källa (se Materialblock ) för att rikta vitt ljus snett mot blockytan. </li><li> Identifiera konturerna av det inbäddade materialet som det projekterar till blockytan. Ange intresseområdet och senare synfält på blockytan med hjälp av en penna eller rakblad. OBS! Det här steget är obligatoriskt för att definiera omfattningen av synfältet före sektionen. </li></ol></li><li> Definiera visningsfältet. <ol><li> Montera hartsblocket med prov på mikrotomen. </li><li> Flytta blockhållaren till sitt stoppläge (övre vändpunkt för blockhållareutflykt). </li><li> Starta digitalkameran och datagenereringsprogrammet och skaffa en levande bild. </li><li> Välj en objektivlins, med en lämplig förstoring för att täcka det intresseområde som anges på blockytan. Obs! Objekt med förstoringar 2.5X, 5X, 10X, 20X och numeriska öppningar mellan 0,07 och 0,40 används vanligen. </li&gt; <li> Flytta optiken uppåt och nedåt och mikrotomen lateralt med hjälp av det motoriserade korsbordet tills intressanta regionen matchar visningsfältet som visas på datorskärmen. </li></ol></li><li> Fokus. <ol><li> Utför stegvis manuell snittning tills de första strukturerna i provet blir synliga. </li><li> Ordna blockytan i optikets fokusplan genom att flytta mikrotomen i den optiska axelns riktning. </li><li> Välj sektion tjocklek; Sektionstjocklekar från 0,5 till 5 μm rekommenderas. </li></ol></li></ol></li><li> Datagenerering och bearbetning <ol><li> Starta programvaru rutin som orkestrerar snittning och bildinspelning. Följ den dokumenterade instruktionen för bildhanteringsprogrammet. </li><li> Stoppa programvaru rutin och sätt ett skaleringsglas framför blockytan så snart provet är helt snittat. </li><li> Fånga en bild interaktivt för senare kalibreringtion. ANMÄRKNING: Detta måste göras varje gång ett mål används i en nyligen ordnad uppsättning. </li><li> Konvertera bildserien till 8 bitars gråskaliga bilder in.jpg-format. </li><li> Ladda bildserien i 3D-visualiseringsprogram och justera kontraster. OBS! Bildkonvertering och 3D-visualisering kan göras med olika kommersiellt eller fritt tillgängliga standardprogramvarupaket, enligt instruktionerna för respektive programvara. </li></ol></li></ol>

Författarna har ingenting att avslöja.

HREM är en mycket robust mikroskopisk metod som är idealisk för visualisering av ett brett spektrum av organiska material som används inom biomedicin och industri 18 , 21 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 . Det kan användas som en exklusiv bildhanteringsmodalitet, som för närvarande används av programmen för utvecklingsstörningar (DMDD) 41 , 42 <suP&gt;, 43 , 44 eller som en integrerande del av multimodala avbildningsrörledningar 45 . En fullt fungerande HREM-datagenereringsapparat kan monteras från konventionella laboratoriekomponenter och innefattar ett motoriserat mikrotom, mikroskop, motoriserat korsbord och en dator med lämplig mjukvara 25 . Det är kritiskt att använda en mikrotom utrustad med en blockhållare som reproducerbart stannar efter varje sektion vid en bestämd position och GFP-filterbitar i den optiska vägen. Dock kan helt fungerande allomfattande lösningar köpas från företag som Indigo Scientific. HREM står inför samma begränsningar som alla histologiska tekniker, förutom att inga artefakter införs under sektion eller sektionsmontering. Det finns emellertid begränsningar som beror på nödvändigheten att fläcka prover före snittning ochFrån inbyggnadsmaterialets egenskaper. Penetration av eosin genom hela provet krävs för att erhålla tillräckliga vävnadskontraster; Väldigt tätt material, fettvävnader och oorganiska ämnen hindrar effektivt penetration av eosin och detta resulterar i obestämda vävnader i mitten av föremålen. Att använda speciella fixeringsmedel hjälper fläckhalsprover, men det finns fortfarande ingen riktig metod för att fullt ut övervinna problemet. En annan begränsning är att hartser som blockerar mer än 2 cm tenderar att bryta under snittning. Detta kan delvis undvikas genom att klippa prov och bearbeta delar separat. Korrekt placering av små prov eller prov med oregelbundna ytor i formarna under inbäddning är ofta problematisk. Omproverna med agaros och bearbetning av agarosblocket som beskrivs i protokollet löser vanligtvis detta problem 19 . Ett alternativt tillvägagångssätt, som också hjälper till om blocken bryts under sektionenPå att ta bort det redan härdade blocket från hållaren och bädda in det igen, efter det beskrivna inbäddningsproceduren. En typisk HREM dataset omfattar 500 till 3 000 enstaka bilder. Dess numeriska upplösning bestäms av avståndet mellan de efterföljande bilderna ( dvs. av sektionstjocklek), karaktäristiken för kameramålet och egenskaperna hos den använda optiken. Vi använde snittjocklekar mellan 1 μm och 5 μm och uppnådde bra resultat, även om de presenterade protokollen inte helt eliminerar sken från artefakterna 20 , 46 . Dessa artefakter orsakas av intensivt färgade vävnader belägna djupt inuti blocket, vilket resulterar i suddning av vävnadsinformation på blockytorna med. Kamerorna hade måldimensioner på 2.560 x 1.920 pixlar 2 , 2.048 x 2.048 pixlar 2 och 4.096 x 4.096 pixlar 2 och var combiNed med objektiv linser med 1.25X, 2.5X, 5X, 10X och 20X. Detta resulterade i numeriska pixelstorlekar mellan 0,18 x 0,18 μm 2 och 5,92 x 5,92 μm 2 , vilket visade sig vara tillräckliga för 3D-analys av vävnadsarkitektur och cellformer, och även för visualisering av kärnor. Med tanke på den höga numeriska upplösningen bör andra cellorganeller också vara synliga. Otillräckliga kontraster på grund av enkel eosinfärgning, och de optiska egenskaperna hos målen minskar dramatiskt möjligheten att diskriminera strukturer. Den maximala sanna rymdupplösningen för HREM-data, som tar hänsyn till den numeriska bländaren, är ungefär 1 x 1 x 1 μm 3 , och tillåter därför en effektiv diskriminering av strukturer större än ungefär 3 x 3 x 3 μm 3 . Ett vanligt problem för alla digitala bildtekniker är avvägningen mellan storleken på synfältet, som definierar den del av provet som kan visasD på kameramålet och den numeriska upplösningen av bilden. Ju större synfältet är, desto lägre är den maximala möjliga numeriska upplösningen 46 . Den här HREM-inställningen möjliggör generering av HREM-data med ett synfält mellan 0,74 x 0,74 mm 2 (20X objektiv) som visas i en numerisk upplösning av 0,18 x 0,18 μm 2 och 12,12 x 12,12 mm 2 (1,25X objektiv) som visas i En numerisk upplösning på 2,96 x 2,96 μm 2 . Alternativa, kommersialiserade set-ups kan ge större synfält men på bekostnad av sann upplösning. Ändå ger de utmärkt resultat, så uppenbart från de data som visas på DMDD-programmets hemsida 47 .

Strukturell analys av organiska och oorganiska material är det första steget i att förstå deras fysiska egenskaper och funktion. Grunden för en sådan analys är ofta tvådimensionell (2D) information som erhållits genom noggrann observation av histologiska sektioner, med en mängd enkla och sofistikerade avbildningsmetoder som extraherar detaljer om vävnadsarkitektur, cellmorfologi och topologi, molekylär sammansättning och biomekaniska egenskaper 1 , 2 , 3 . 2D-information är emellertid inte lämpad för att undersöka rumsligt komplexa arrangemang. Därför etablerades ett växande antal in vivo och ex vivo metoder som möjliggör generering av digitala volyldata under de senaste decennierna 4 och många fler är under utveckling. Den metodiska principen för mest volymdatagenereringsmetoder är genereringen av virtuella staplarAv digitala bilder som visar sektioner som erhållits genom virtuell eller fysisk sektion av ett objekt. Om sektionsbilderna är rätt inriktade skapas en volym, som kan snittas om i virtuella sektionsplan eller används för att skapa 3D-ytor och volymåterställda modeller. Populära tekniker för visualisering av människor och större biologiska prover är magnetisk resonanstomografi (MRT), computertomografi (CT), positronutsläppstomografi (PET) och single-photon emission computed tomography (SPECT). Små exemplar visualiseras vanligtvis genom användning av mikromagnetisk resonansbildning (μMRI), optisk projektionstomografi (OPT), optisk koherensomografi (OCT), fotoakustisk tomografi (PAT), histologiska sektionsbaserade metoder, konfokalmikroskopi och elektrontomografi 5 , 6 7 , 8 , 9 , 10 <sUpp&gt;, 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . En relativt ny volymdatagenereringsteknik som producerar digitala data för småprover och histologiska vävnadsprover är HREM-metoden, som utvecklades i nära samarbete med Tim Mohun 18 , 19 . Det är en enkel mikroskopbaserad teknik, som genererar digital volymdata från hartsinbäddat material som är snittat på en mikrotom. Uppgifterna underlättar detaljerad analys av vävnadsarkitektur och cellfördelningar såväl som metrisk analys av små funktioner på en mellanliggande ljusmikroskopisk nivå. HREM producerar staplar av iboende justerade digitala bilder som visas som om de tagits från eOsinfärgade histologiska sektioner. Vävnadskontrast och dataupplösning i förhållande till synfältet överstiger den för data som produceras med μCT, μMRI och OPT, men är lägre än vad som kan uppnås med konfokal, ljusark och elektronmikroskopi 20 . I motsats till det senare kan HREM dock visualisera prover med relativt stora volymer upp till 5 x 5 x 7 mm 3 i histologisk kvalitet. Ett antal nyligen genomförda studier ger detaljerade karaktäriseringar och jämförelser av fördelar och nackdelar med de enkla bildteknikerna och, för saklighets skull, hänvisar vi till dem för ytterligare information om deras begränsningar och potentiella användningsområden 4 , 21 , 22 , 23 , 24 . Denna studie fokuserar på HREM imaging-metoden och syftar till att tillhandahållaMycket enkla protokoll för att generera HREM data av ett brett spektrum av organiska material, liksom exempel på deras tillämpning. Arbetsflödet för att skapa HREM-data är enkelt och gäller alla material som kan bädda in i metakrylatharts ( Figur 1 ). Ändå finns det vävnadsspecifika skillnader i provberedning, som måste beaktas. Vi tillhandahåller därför tre standardprotokoll för att förbereda olika prover. Inbäddning och dataproduktion protokoll steg är identiska för dem alla.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672">
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:231px;">JB-4 Plus Embedding Kit</td>
			<td style="width:115px;">Polysciences Europe GmbH</td>
			<td style="width:161px;">18570-1</td>
			<td style="width:167px;">includes Benzoyl Peroxide, Plasticized (Catalyst) and Solution A+B</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Polyethylene Molding Cup Trays, 6x8x5mm hexagon (9 cavities)</td>
			<td style="width:115px;">Polysciences Europe GmbH</td>
			<td style="width:161px;">17177A-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Polyethylene Molding Cup Trays, 13x19x5mm (9 cavities)</td>
			<td style="width:115px;">Polysciences Europe GmbH</td>
			<td style="width:161px;">17177C-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">JB-4 Plastic Block Holders</td>
			<td style="width:115px;">Polysciences Europe GmbH</td>
			<td>15899-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">Eosin</td>
			<td style="width:115px;">Waldeck GmbH &#38; Co. KG, Division Chroma</td>
			<td style="width:161px;">1A-196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Microtec CUT 4060E</td>
			<td></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>rotary microtome</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:231px;">Leica DM LM, fluorescence compound microscope</td>
			<td style="width:115px;">Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:231px;">GFP filter set</td>
			<td style="width:115px;">Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td>
			<td style="width:161px;">11090937180000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:231px;">Motorised cross table</td>
			<td style="width:115px;">Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH &#38; CO. KG</td>
			<td style="width:161px;">KT5-LSMA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Digital video camera SPOT-FLEX</td>
			<td style="width:115px;">Visitron Systems GmbH.</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">precisExcite High-Power LED</td>
			<td style="width:115px;">Visitron Systems GmbH.</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>light source</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">VisiView 2.1.4</td>
			<td style="width:115px;">Visitron Systems GmbH.</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>Image capturing software</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:231px;">Hard metal knife (tungsten carbide), profile D</td>
			<td style="width:115px;">Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">KL 2500 LCD</td>
			<td style="width:115px;">Schott AG</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>light source </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution episcopic microscopy (hrem) - simple and robust protocols for processing and visualizing organic materials

Vi tillhandahåller enkla protokoll för att generera digitala volyldata med den högupplösande episkopiska mikroskopi-metoden (HREM). HREM kan bilda organiska material med volymer upp till 5 x 5 x 7 mm 3 i typiska numeriska upplösningar mellan 1 x 1 x 1 och 5 x 5 x 5 μm 3 . Proverna är inbäddade i metakrylatharts och snittas på en mikrotom. Efter varje sektion fångas en bild av blockytan med en digital videokamera som sitter på fotobunken ansluten till det sammansatta mikroskophuvudet. Den optiska axeln passerar genom en grön fluorescerande protein (GFP) filterkub och är inriktad på en position, vid vilken bockhållarmen kommer vila efter varje sektion. På så sätt produceras en rad naturligt anpassade digitala bilder som visar efterföljande blockytor. Att ladda en sådan bildserie i tredimensionell (3D) visualiseringsprogramvara underlättar omedelbar konvertering till digital volymdata, vilket möjliggör virtuella sEktionering i olika ortogonala och snedställda plan och skapandet av volym och ytframställda datormodeller. Vi presenterar tre enkla, vävnadsspecifika protokoll för behandling av olika grupper av organiska exemplar, inklusive mus, kyckling, vaktel, groda och zebrafiskembryon, humant biopsimaterial, obestruket papper och hudbytesmaterial.

HREM genererar serie av iboende justerade digitala bilder med kontraster som liknar bilder av hematoxylin / eosinfärgade histologiska sektioner. Till skillnad från 2D-sektionsbilder möjliggör staplar av HREM-bilder visualisering och analys av vävnadsarkitekturen, morfologin och topologin av ett brett utbud av organiska material i 3D. Den höga kontrasten underlättar ofta snabb och enkel 3D-visualisering av volymåterställda datormodeller och semiautomatiska konturfyndigheter för generering av ytframställda modeller. HREM-dataens storlek varierar beroende på storleken på kameramålet, läget för bildinspelning (8, 12, 16 bit, gråskala, färg) och antalet enskilda blockbilder. Mindre datamängder med 1000 8-bit.jpg gråskaliga bilder på 2.048 pixlar x 2.048 pixlar har en storlek på cirka 900 MB. Större dataset med 3 000 8-bit.jpg gråskala bilder på 4.096 pIxel x 4.096 pixlar har volymer på ungefär 20 GB. De angivna protokollen är enkla och robusta, och under det senaste decenniet var de anställda för att generera HREM-data från många olika prover. Protokoll avsnitt 1.1 optimerades för behandling av hela embryon av biomedicinska modellorganismer med en längd på upp till 1 cm och embryonvävnadsprover med en dimension upp till 5 x 5 x 5 mm 3 ; Vi använde denna metod för att producera HREM-data av embryon av följande arter: mus ( Mus musculus) , kyckling ( Gallus gallus ), zebrafisk ( Danio rerio ), vaktel ( Coturnix coturnix) , afrikansk klodda groda ( Xenopus laevis ), häst Equus ferus caballus ), mjölkbullar ( Oncopeltus fasciatus ), krokodil ( Crocodylia ) och bläckfisk ( Octopus vulgaris ). Uppgifterna för alla arter var av utmärkt kvalitet ( t.ex. Figur 3 ) <p clAss = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Protokoll avsnitt 1.2 optimerades för behandling av juvenila och vuxna vävnadsprover med dimensioner upp till 5 x 5 x 7 mm 3 och användes för att visualisera vävnadsprover av Hud, lever, bukspottkörtel, njure, sköldkörtel, hjärta, strimmig muskel, hjärnan, nerver och tumörmodeller skördade från människor ( Homo sapiens ), mus ( Mus musculus ), råttor ( Rattus norvegicus ), svin ( Sus scrofa domestica ) Furo ), fruktfluga ( Drosophila melanogaster ) och zebrafisk ( Danio rerio ). Resultatet var utmärkt med de flesta exemplar ( t.ex. Figur 4 , Animation 1 ), men de mycket centrala delarna av huden (med epidermis) och hjärnproverna större än 3 x 3 x 3 mm 3 förblev ofta ofärgade på grund av otillräcklig penetration av eosin genom Dessa vävnader. Protokoll sEktion 1.3 optimerades för behandling av fibröst organiskt material och användes för att visualisera fiberarkitekturen hos bestruket papper, obestruket papper, nativt dermal substitutmaterial och stamcellsfrödat dermal substitutmaterial. Dessa prover var enkla och snabba att bearbeta. Uppgifterna i det obelagda pappret och de flesta hudutbyten var av god kvalitet ( Figur 5 , Animation 2 ). Problem uppstod vid bearbetning av det belagda papperet, när det oorganiska materialet hindrade penetration av eosin. En annan fråga uppstod vid bearbetning av hudutbytena på basis av agar eftersom de delades delvist av infiltreringslösningen. <img alt="Figur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig1.jpg" /> Figur 1: Arbetsflöde. Steg som visas i de röda rutorna kräver ändringar enligt provkännetecken. Steg i de gröna lådorna är de somÄr likartade i alla prover. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/56071fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig2.jpg" /> Figur 2: Anpassade formar. Mögel kan anpassas genom att skära ett hål i originalformen, sätta in en Pasteur-pipetts glödlampa och täta den med modelleringsmaterial. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/56071fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Figur 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig3.jpg" /> Figur 3: Exempelvis visuella embryon. (A, B) Musembryo skördat vid embryonisk dag, E = 9,5. HREM sektionsbilden visas i (A) </strong&gt;. Volym gjord 3D-modell som visar ytan visas i (B) . (C) Virtuell sagittal sektion genom en volym gjord modell av halsen på ett E15.5 mus embryo. (D) Chick embryo vid utveckling Hamburger Hamilton (HH) steg 18. Surface modell av armaturen hos de kardiovaskulära komponenterna kombinerat med volymen återgivning av alla embryonvävnader. Skalstänger = 200 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/56071fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Figur 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig4.jpg" /> Figur 4: Exempelvis visuella vuxnavävnadsprover. (A) Del av en HREM sektionsbild genom en mänsklig nerv. Inlägg visar en del av bilden mer detaljerat. (B) Del av en HREM sektionsbild genom grislever. Notera nuclei. (C) Del av en HREM-sektionsbild av mänsklig lymfatisk vävnad. (D, E) Tjock hud på en mänsklig tummuddosa. Volym gjord 3D-modell av hela biopsi. (D) Ytgjorda modeller av artärer, vener och nerver framför en virtuell resektion genom HREM-data (E) . (F) Experimentell tumör i vuxen musvävnad. Volym gjord 3D-modell framför tre virtuella sektioner genom HREM-data. Notera de nekrotiska delarna (arrowheads). Skalstänger = 200 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/56071fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Figur 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig5.jpg" /> Figur 5: Exempelvis visualiserat fibermaterial. (A, B) HREM sektionsbild av obelagt, brunt papper. (B) </sTrong&gt; visar en sektion av (A) . Notera fibrerna och deras lumen. (C) HREM-sektionen av belagt papper. Observera att fibrerna är ofärgade. (D) Volym gjord modell av nativt dermal substitutmaterial. Notera de olika kaliberna och formen av fibrerna. Skalstänger = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/56071fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/56071/56071mov1.jpg" /> Animation 1: Volym Rendered Modell av tjock hud av en mänsklig tummap. Storleken på vävnadsblocket är ungefär 4,2 x 2,7 x 2,7 mm 3 . Voxel-storleken är 1,07 x 1,07 x 2 um 3 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/animation1.mp4" target="_blank">Vänligen klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)</a> <pClass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Film 2" src="/files/ftp_upload/56071/56071mov2.jpg" /> Animation 2: Volym Rendered Modell av Native Dermal Substitute Material. Storleken på provet är ungefär 1,2 x 0,85 x 0,4 mm 3 . Voxel-storleken är 0,54 x 0,54 x 2 | im 3 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/animation2.mp4" target="_blank">Vänligen klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials at JoVE.com

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

Vi tillhandahåller enkla och robusta protokoll för bearbetning av biopsiematerial av olika arter, embryon av biomedicinska modellorganismer och prover av andra organiska vävnader för att möjliggöra digital volymdatagenerering med den högupplösta episkopiska mikroskopi-metoden.

Högupplösande episkopisk mikroskopi (HREM) - Enkla och robusta protokoll för bearbetning och visualisering av organiska material

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analys av zebrafisk njure utveckling med Time-lapse avbildning med ett dissektionsmikroskop Utrustad för optisk Sektione

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy

Snabb Förvärv av 3D-bilder med hjälp av Högupplöst Episcopic Mikroskopi

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

En enkel kammare för långsiktig konfokalbildning av rot- och hypokotylutveckling

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protokoll för Visualisering steroidogena organ och deras interaktiva organ med immunfärgning i fruktflugan<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontell helmontering: Ett nytt bearbetnings- och bildprotokoll för tjocka, tredimensionella vävnads tvärsnitt av huden

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Korrelat super-upplösning och elektronmikroskopi för att lösa Protein lokalisering i zebrafiskar näthinna

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Multimodal hierarkiska avbildning av seriell avsnitt för att hitta specifika cellulära mål inom stora volymer

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levande cellen avbildning av kromosomsegregering under Mitos

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Thin Film Composite Silicon Elastomers for Cell Culture and Skin Applications: Manufacturing and Characterization

Thin Film sammansatta silikon elastomerer för cellodling och hud applikationer: tillverkning och karakterisering

In this protocol, we present methods to fabricate thin elastomer composite films for advanced cell culture applications and for the development of skin ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisera den noden och Notochordal plattan i Gastrulating musembryon som använder Scanning Electron Microscopy och hela Mount immunofluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...