Name: high-resolution episcopic microscopy (hrem) - simple and robust protocols for processing and visualizing organic materials
Uploaded: 2017-07-07T13:00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials at JoVE.com

Yazarlar, örnek sunmak için HREM ve Petra Heffeter&#39;in gelişmekte olan invalubale katkıları nedeniyle Tim Mohun&#39;a teşekkür ediyorlar.

Bütün işlemler, Viyana Tıp Üniversitesi&#39;nde etik kurallara uygun olarak gerçekleştirildi. 1. Örnek Hazırlama <ol><li> Embriyoların ve embriyo dokularının hazırlanması (5 x 5 x 5 mm 3&#39;e kadar ) <ol><li> Embriyoları veya embriyoların parçalarını 4 ° C PFA / PBS&#39;de veya Bouin&#39;s fiksatifinde 4 ° C&#39;de en az 16 - 24 saat boyunca sabit dalgalanma altında sabitleyin. NOT: Burada kullanılan 48 saat zebra balığı, 19 saat civciv ve bıldırcın ve ayrıca prenatal fare embriyoları gibi çeşitli türlerin ve çeşitli gelişim evrelerinin embriyoları kullanılabilir (bkz. Temsilci Sonuçlar ). Numuneler hasat edildi ve fiksatif hale getirilmeden evreleme için oda sıcaklığında PBS&#39;ye aktarıldı. Gerekirse, gömme kalıplarına uyması için sabitlemeden önce numuneleri mikro makas veya bisturi ile kesin. </li><li> Sabitleştirici çıkarın ve sabit taş altında 4 ° C&#39;de PBS içinde embriyo dokusu yıkayınG 24 saat (2-3 değişiklik). </li><li> Numuneleri% 70,% 80,% 90,% 96 etanolde 4 ° C&#39;de 2 - 3 saat boyunca kurutun. Numuneleri içeren tüpleri bir rotatöre yerleştirin. NOT: Küçük numuneler (&lt;2 x 2 x 2 mm 3 ) için, bir numunenin her etanolde durduğu süre 60 dakikaya düşebilir. Büyük örnekler (&gt; 5 x 5 x 5 mm 3 ) için, 4 saate kadar uzatılabilir. </li><li> Koruyucu eldiven giymiş bir tüp kapağının altına sızma adımlarını uygulayın. <ol><li> 1.25 g benzoil peroksit (plastikleştirilmiş katalizör) ve 0.4 mL eozini 100 mL A solüsyonuna ekleyerek sızıntı solüsyonunu hazırlayın (daha ayrıntılı bilgi için, Malzeme Tablosuna bakın). Bunu eozin ve katalizör tamamen eriyene kadar (2 - 3 saat) 4 ° C&#39;de bir manyetik karıştırma plakasında bir beher içerisinde karıştırın. </li><li> Numuneleri 12 - 24 saat boyunca sızma çözümüne yerleştirin. Sürekli sallama veya döndürme altında 4 ° C&#39;de tutun. Sızıntı solüsyonunu 3 ve 12 saat sonra taze solüsyonla değiştirinh. NOT: Büyük embriyolar için infiltrasyon süresini 48 saate çıkarın (&gt; 1 cm taç / kıç uzunluğu). </li></ol></li></ol></li><li> Yetişkin doku örnekleri hazırlama (5 x 5 x 7 mm 3 e kadar ) <ol><li> 4 ° C&#39;de en az 3 gün% 4 karbolik asit içeren% 2 PFA / PBS içinde dokuları düzeltin. NOT: Bu solüsyonda birkaç yenidoğan ve erişkin insan, kemirgen, domuz, meyve sinekleri ve zebra balıklarının deri, karaciğer, pankreas, böbrek, tiroit, kalp, çizgili kas, beyin, sinirler ve tümör modellerinden kaynaklanan doku örneği tespit edilebilir Ve daha sonra HREM görüntüleme için işlendi (örneklerin sabitlenmesini gösterdik, Temsilcilik Sonuçlarına bakınız). Doku numunelerini neşterler, makaslar veya biyopsi zımbalarla ayırın ve doğrudan fiksatif maddeye aktarın. Sinir dokusunun fiksasyonu için% 4 PFA / PBS kullanın. </li><li> Sabitleyiciyi çıkarın ve dokuyu akan musluk suyu altında 3-6 saat boyunca yıkayın. </li><li> Daha sonra plac ile numuneleri kurutun% 70,% 80,% 90,% 96 etanol, 100 mL (her biri 2-3 saat) için 0.4 g eosin ile karıştırılmışlardır. Çözeltileri 4 ° C&#39;de sabit sallanan veya rotator üzerinde tutun. NOT: Küçük numuneler (&lt;2 x 2 x 2 mm 3 ) için, bir numunenin her etanolde durduğu süre 60 dakikaya düşebilir. Büyük örnekler (&gt; 5 x 5 x 5 mm 3 ) için 4-8 saate kadar uzatılabilir. </li><li> Koruyucu eldiven giymiş bir tüp kapağının altındaki aşağıdaki sızma adımlarını gerçekleştirin. <ol><li> 1.25 g benzoil peroksit (plastikleştirilmiş katalizör) ve 100 mL A solüsyonuna 0.4 g eozin ekleyerek sızıntı solüsyonunu hazırlayın (daha ayrıntılı bilgi için Malzeme Tablosuna bakın). Eozin ve katalizör tamamen çözünene kadar (2 - 3 saat) manyetik bir karıştırma plakasındaki bir beherde 4 ° C&#39;de karıştırın. </li><li> Numuneleri 24 ila 36 saat boyunca sızıntı solüsyonuna yerleştirin. Sürekli sallama veya döndürme altında 4 ° C&#39;de tutun. 3 ve sonra sızıntı solüsyonunu taze solüsyonla değiştirin.12 saat. NOT: Büyük örnekler (&gt; 5 x 5 x 5 mm 3 ) için sızma süresini 48 saate çıkarın. </li></ol></li></ol></li><li> Diğer organik maddelerin hazırlanması NOT: Cildin yerini alan maddeleri ve kağıtları sıradan bir makasla istenen ebatta kesin. Düzeltme gerekmiyor. <ol><li> Sabitleme, yıkama ve dehidrasyon adımlarını atlayın. </li><li> Koruyucu eldiven giymiş bir tüp kapağının altındaki aşağıdaki sızma adımlarını gerçekleştirin. <ol><li> 1.25 g benzoil peroksit (plastikleştirilmiş katalizör) ve 100 mL A solüsyonuna 0.4 g eozin ekleyerek sızıntı solüsyonunu hazırlayın (daha ayrıntılı bilgi için Malzeme Tablosuna bakın). Eozin ve katalizör tamamen eriyene kadar (2 - 3 saat) manyetik bir karıştırma plakasında 4 ° C&#39;de bir beherde karıştırın. </li><li> Örnekleri 3-12 saat boyunca sızıntı solüsyonuna yerleştirin. Sürekli sallama veya döndürme altında 4 ° C&#39;de tutun. 1 ve 2 ila 4 saat sonra infiltrasyon solüsyonunu yeni solüsyon ile değiştirin. </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol></li></ol> 2. Yerleştirme NOT: Koruyucu eldiven giymiş bir duman kaputunun altındaki tüm basamakları gerçekleştirin. <ol><li> Yukarıda açıklandığı gibi taze sızma çözümünü hazırlayın (adım 1.1.4.1). Gömme solüsyonunu hazırlamak için 100 mL sızma solüsyonuna 4 mL B çözeltisi (ayrıntılar için, Malzeme Tablosuna bakın) ilave edin. NOT: Gömme kalıplarındaki numunenin hassas yönlendirilmesi gerekiyorsa ve birkaç numunenin paralel olarak yerleştirilmesine izin vermek için, beheri bir buz banyosuna koyarak stok solüsyonunun polimerizasyonunu yavaşlatın. </li><li> Rutin bir hacim 6 x 8 x 5 mm 3 veya 13 x 19 x 5 mm 3 olan kalıplar ile kalıplama fincan tepsileri (ayrıntılar için, Malzeme Tablosuna bakın) veya 8 x 10 x 15 mm&#39;ye kadar hacimlere sahip özelleştirilmiş kalıplar kullanın 3 ( Şekil 2 ). </li><li> Kalıpları gömme çözeltisi ile doldurun ve numuneyi kullanarak kalıba aktarın.Bir kaşık. Aktarım sırasında, hava tutma özelliğini önlemek için numunenin gömme çözeltisi ile tamamen örtülmesini sağlayın. NOT: Örnekleri ve gömme çözeltisini buzdolabından topladıktan hemen sonra başlatılırsa, oda sıcaklığında gerçekleştirilebilir. <ol><li> İğneleri veya forsepsi kullanarak kalıp içindeki numuneyi yönlendirin. </li><li> Gömme çözeltisi yapışkan olmaya başladığında, kalıbın üzerine bir blok tutucu ( Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin ve blok tutacağının orta deliğinden gömme çözeltisini 1 - 2 Mm gömme çözümü. </li><li> Sıvı parafin mumu ile kaplayarak kalıplama kabının tepsisini kapatın ve sertleşene kadar bekleyin. Alternatif olarak, ikinci bir kalıplama fincan tepsisini örneklerle kalıp fincan tepsisine baş aşağı yerleştirin ve hava geçirmez hale getirmek için yapışkan bantla kapatın. </li></ol></li><li> Blokların polimerleşmeyi bitirmesine izin verin 1 -Oda sıcaklığında 2 gün. </li><li> Polimerizasyon sonrası işleme için, polimerize bloklar içeren kalıplama kabı tepsilerini standart bir laboratuar fırınına yerleştirin ve koyu kırmızıya gelene kadar 70 - 80 ° C&#39;de en az 1 - 2 gün pişirin. Tepsileri fırından toplamak ve kalıplardan blokları çıkarmak. NOT: Pişirme normal çevre koşullarında yapılabilir. Gömülmeden sonra ilk aşamada havaya dayanıklı sızdırmazlığı sağlayan kaplama kalıplama kabı tepsisi, 10 saat sonra reçinenin rengini kontrol edebilmek için çıkarılabilir. Fırınlamadan hemen sonra, reçine yumuşaktır ve bloklar kalıplama kabı tepsiden kolaylıkla çıkarılabilir. 2 - 3 saat içerisinde serttirler ve birkaç ay boyunca oda sıcaklığında saklanabilirler. </li></ol> 3. Veri Üretimi NOT: Burada kullanılan 18 , 25 numaralı HREM prototipi aşağıdaki maddeleri içermektedir: (i) Blok tutuculu döner mikrotomHer kesimden sonra üst dönüş noktasında durur. (Ii) Standart, tek kullanımlık olmayan mikrotom bıçak, sert metal, profil D (ayrıntılar için bkz . Malzeme Tablosu ). (Iii) Objektif revolver ve optik eksende bir GFP-filtre küpü (uyarılma 470/40; emisyon filtresi 525/50) ile floresan bileşik mikroskop başı. Optik eksen, mikrotom üzerine monte edilmiş bir bloğun yeni kesilen yüzeyine dik olarak düzenlenmiştir ve yukarı ve aşağı hareketi sağlayan bir cihaz tarafından tutulmaktadır. (Iv) Mikro topağı taşıyan motorlu çapraz masa. Masa, optik eksen yönünde ve yanal olarak kaydırılabilir. (V) Floresan bileşik mikroskopta takılı dijital video kamera. (Vi) Tek renkli ışık kaynağı (470 nm). (Vii) Bilgisayara bağlı bilgisayar, veri üretme yazılımı ile (ayrıntılar için bkz . Malzeme Listesi ). <ol><li> prosedür <ol><li> İlgi alanını belirtin. <ol><li> Standart laboratuvar li kullanınBeyaz ışığın blok yüzeyine eğik bir şekilde yönlendirilmesi için ght kaynağı ( Malzeme Tablosuna bakınız). </li><li> Gömülü malzemenin blok yüzeyine çıkarken çizgilerini belirleyin. Bir kalem veya tıraş bıçağıyla blok yüzeyindeki ilgi alanını ve daha sonra görme alanını belirtin. NOT: Bu adım, kesitlendirme öncesi alanın kapsamını tanımlamak için zorunludur. </li></ol></li><li> Görüş alanını tanımlayın. <ol><li> Reçine bloğunu örnekle mikrotom üzerine yerleştirin. </li><li> Blok tutucuyu durma konumuna (blok tutucu gezinin üst dönüş noktası) hareket ettirin. </li><li> Dijital fotoğraf makinesi ve veri oluşturma yazılımını başlatın ve canlı görüntü elde edin. </li><li> Blok yüzeyinde belirtilen ilgi bölgesini kapsayacak uygun bir büyütme ile bir objektif lens seçin. NOT: 2.5X, 5X, 10X, 20X büyütmeler ve 0.07 ile 0.40 arasında sayısal açıklıklar olan nesneler yaygın olarak kullanılır. </li&gt; <li> Optik yukarı ve aşağı hareket ettirin ve mikrotomu, ilgi alanının bilgisayar ekranında görüntülenen alanla eşleşene kadar motorlu çapraz tabloyu kullanarak yanal olarak hareket ettirin. </li></ol></li><li> Odaklanın. <ol><li> Numunenin ilk yapıları görünene kadar adım adım manuel kesit alma işlemini gerçekleştirin. </li><li> Mikro topuzu optik eksen yönünde hareket ettirerek blok yüzeyini optik odak düzleminde düzenleyin. </li><li> Kesit kalınlığını seçin; 0.5 ila 5 μm kesit kalınlıkları önerilir. </li></ol></li></ol></li><li> Veri üretimi ve işlenmesi <ol><li> Bölümleme ve resim yakalamayı düzenleyen yazılım rutini başlatın. Görüntü yakalama yazılımının belgelenmiş talimatlarını izleyin. </li><li> Yazılım rutini durdurun ve numune tamamen kesildiğinde blok yüzeyinin önüne ölçekleme slaydını yerleştirin. </li><li> Daha sonraki kalibrasyon için görüntüyü etkileşimli olarak yakalayınsiyon. NOT: Bu, yeni düzenlenmiş bir kurulumda bir objektif her kullanıldığında yapılmalıdır. </li><li> Görüntü serisini in.jpg formatında 8 bit gri ölçekli görüntülere dönüştürün. </li><li> Görüntü serisini 3D görselleştirme yazılımına yükleyin ve kontrastları ayarlayın. NOT: Görüntü dönüşümü ve 3D görselleştirme, ilgili yazılımın talimatlarını izleyerek, çeşitli ticari veya serbestçe temin edilebilir standart yazılım paketleri ile yapılabilir. </li></ol></li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

HREM, biyotıp ve endüstride kullanılan geniş bir organik materyal spektrumunu görselleştirmek için ideal olan oldukça sağlam mikroskopik bir yöntemdir. 18 , 21 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 . Şu anda Gelişimsel Bozuklukların Mekanizmaları (DMDD) programı 41 , 42 tarafından kullanılan özel görüntüleme modeli olarak kullanılabilir <suP&gt;, 43 , 44 ya da multimodal görüntüleme boru hatlarının bütünleyici bir parçası olarak 45 . Tamamıyla çalışan bir HREM veri oluşturma aparatı, klasik laboratuvar bileşenleri kullanılarak monte edilebilir ve motorlu mikrotom, mikroskop, motorlu çapraz tablo ve uygun yazılımlı bir bilgisayar içerir. Tanımlanmış bir konumda her bölümden sonra tekrarlanabilir şekilde duran bir blok tutucu ile donatılmış bir mikro-topun kullanılması ve optik yolun içindeki GFP filtre küplerinin kullanılması kritiktir. Bununla birlikte, tamamen işlev gören her şey dahil çözümleri Indigo Scientific gibi şirketlerden satın alabilirsiniz. HREM, tüm histolojik tekniklerle aynı kısıtlamalarla karşı karşıyadır, ancak bölümleme veya bölüm montajı esnasında herhangi bir artefakt gelmemiştir. Bununla birlikte, kesit alma öncesi numunelerin lekelenmesi gerekliliğinden kaynaklanan sınırlamalar vardır veGömme malzemesinin özelliklerinden. Yeterli doku kontrastının elde edilmesi için eosinin tüm numuneye nüfuz edilmesi gereklidir; Çok yoğun materyal, yağ dokuları ve anorganik maddeler, eozin penetrasyonunu etkili bir şekilde engeller ve bu, cisimlerin merkezinde lekelenmemiş dokulara neden olur. Özel fiksatif maddelerin kullanılması cilt örneklerinin lekelenmesine yardımcı olur, ancak sorunu tamamen çözmek için hala uygun bir yöntem yoktur. Bir diğer kısıtlama ise, 2 cm&#39;den daha yüksek bloklu reçinelerin, kesitlendirme sırasında kırılma eğiliminde olmasıdır. Bu, kısmen numunelerin kesilmesi ve parçaların ayrı ayrı işlenmesi ile önlenebilir. Gömme işlemi sırasında kalıplarda düzensiz yüzeylere sahip küçük numunelerin veya numunelerin doğru konumlandırılması sıklıkla sorun yaratmaktadır. Numuneleri agaroz ile örtmek ve protokolde açıklandığı gibi agaroz blokları işlemek genellikle bu sorunu çözer 19 . Bölümler sırasında blokların kırılmasına da yardımcı olan alternatif bir yaklaşımAçıklanan gömme prosedürünü takiben, zaten sertleştirilmiş bloğu tutucudan çıkarın ve yeniden katıştırın. Tipik bir HREM veri seti, 500 ila 3.000 tek görüntü içerir. Sayısal çözünürlüğü, ardışık görüntüler arasındaki uzaklık ( yani , kesit kalınlığına göre), kamera hedefinin karakteristiği ve kullanılan optiklerin özellikleri tarafından belirlenir. Sunulan protokoller eserler 20 , 46&#39;dan parlamayı tamamen ortadan kaldırmasa da, 1 μm ve 5 μm arasındaki kesit kalınlıklarını kullandık ve iyi sonuçlar elde ettik. Bu eserler, blok yüzeylerinin üstündeki doku bilgisinin bulanıklaşmasına neden olan, blokun derinlerinde bulunan yoğun şekilde lekelenmiş dokulardan kaynaklanır. Kameraların hedef boyutları 2,560 x 1,920 piksel 2 , 2,048 x 2,048 piksel 2 ve 4,096 x 4,096 piksel 2 idi ve kombine1.25X, 2.5X, 5X, 10X ve 20X nesnel objektiflerle donatılmıştır. Bu, 0.18 x 0.18 μm2 ile 5.92 x 5.92 μm2 arasındaki sayısal piksel boyutlarıyla sonuçlandı ve doku mimarisi ve hücre şekillerinin 3D analizi için ve hatta çekirdekleri görselleştirmek için bile yeterli olduğu kanıtlandı. Yüksek sayısal çözünürlük göz önüne alındığında, diğer hücre organelleri de görünür olmalıdır. Basit eozin boyama ve hedeflerin optik özellikleri nedeniyle kontrastlar yetersiz yapıları ayırt etme olasılığını önemli ölçüde azaltır. Sayısal diyaframı hesaba katan HREM verilerinin maksimum gerçek mekânsal çözünürlüğü yaklaşık olarak 1 x 1 x 1 μm 3&#39;tür ve bu nedenle yalnızca yaklaşık 3 x 3 x 3 μm 3&#39;den daha büyük yapıların etkin ayrımına izin verir. Tüm dijital görüntüleme tekniklerinde sık görülen bir problem, görüntüleme alanının büyüklüğü arasındaki tradeoff olup, bu da görüntülemenin yapılabileceği numunenin bölümünü tanımlamaktadırD ve kamera hedefinde sayısal çözünürlük. Görüş alanı büyüdükçe mümkün olan en üst düzeyde sayısal çözünürlüğü düşürür. Burada kullanılan HREM kurulumu, 0.18 x 0.18 μm2 ve 12.12 x 12.12 mm2 (1.25X objektif) sayısal çözünürlüklerde görüntülenen 0.74 x 0.74 mm2 (20X objektif) görüş alanı ile HREM verisinin oluşturulmasına izin verir. 2.96 x 2.96 μm 2&#39;lik sayısal bir çözünürlük. Alternatif, ticarileştirilmiş kurulumlar, daha geniş görüş alanları sağlayabilir ancak gerçek çözünürlük pahalıdır. Bununla birlikte, DMDD programının ana sayfasında gösterilen verilerden de anlaşılacağı üzere, mükemmel sonuçlar vermektedir 47 .

Organik ve anorganik materyallerin yapısal analizi, fiziksel özelliklerini ve fonksiyonlarını anlamak için ilk adımdır. Bu analizin temelleri, doku mimarisi, hücre morfolojisi ve topoloji, moleküler kompozisyon ve biyomekanik özellikler 1 , 2 , 3 ve 4&#39;ün detaylarını çıkaran basit ve sofistike görüntüleme yöntemleri ile histolojik bölümlerin dikkatle gözlemlenmesiyle kazanılan iki boyutlu (2D) 2 , 3 . Bununla birlikte, 2D bilgi, mekansal olarak karmaşık düzenlemeleri araştırmak için uygun değildir. Dolayısıyla sayısal hacim verilerinin üretilmesine izin veren artan sayıdaki canlı ve eks vivo yöntemler son on yılda kurulmuştur ve daha birçoğu gelişme halindedir. En hacimli veri üretme yöntemlerinin metodik ilkesi sanal yığınların üretilmesidirBir nesnenin sanal veya fiziksel kesitlemesiyle elde edilen bölümleri görüntüleyen dijital görüntüler. Kesit görüntüleri düzgün şekilde hizalandıysa, bu sanal kesit düzlemlerinde yeniden kesitlendirilebilen veya 3D yüzey ve hacim oluşturulan modeller oluşturmak için kullanılan bir hacim oluşturur. Manyetik rezonans tomografi (MRT), bilgisayarlı tomografi (BT), pozitron emisyon tomografisi (PET) ve tek foton emisyonlu bilgisayarlı tomografi (SPECT) insan ve daha büyük biyolojik örneklerin görüntülenmesine yönelik popüler tekniklerdir. Küçük numuneler genellikle mikro-manyetik rezonans görüntüleme (μMRI), optik projeksiyon tomografisi (OPT), optik koherens tomografi (OCT), fotoakustiksel tomografi (PAT), histolojik kesit alma esaslı yöntemler, konfokal mikroskopi ve elektron tomografi kullanılarak görüntülenir 5 , 6 , 7,8,9,10 <s11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Küçük numunelerin ve histolojik doku örneklerinin dijital verilerini üreten nispeten yeni bir hacim veri oluşturma tekniği, Tim Mohun 18 , 19 ile yakın işbirliği içinde geliştirilen HREM yöntemidir. Bir mikrotom üzerinde kesilen reçine gömülü malzemeden dijital ses verileri üreten basit bir mikroskop tabanlı tekniktir. Veriler, doku mimarisi ve hücre dağılımlarının detaylı analizinin yanı sıra orta ışık mikroskopik düzeyde küçük özelliklerin metrik analizi de kolaylaştırıyor. HREM, özünde hizalanan dijital görüntü yığınlarını üretir; sanki eOsin lekeli histolojik kesitler. Görme alanına göre doku kontrastı ve veri çözünürlüğü, μCT, μMRI ve OPT ile üretilen verilerinkini aşar, ancak konfokal, ışık saçılımı ve elektron mikroskobu ile elde edilenden daha düşüktür. Bununla birlikte, HREM, sonuncunun aksine, histolojik kalitede, 5 x 5 x 7 mm 3&#39;e kadar göreli büyük hacimlerde örnekleri görselleştirebilir. Yakın tarihli bir dizi araştırma, tek görüntüleme tekniklerinin avantajlarının ve dezavantajlarının ayrıntılı karakterizasyonu ve karşılaştırmalarını sağlar ve objektiflik uğruna, sınırlamaları ve potansiyel uygulama alanları 4 , 21 , 22 , 23 , 24 . Bu çalışmada HREM görüntüleme yöntemi üzerinde durulmaktadır.Geniş bir organik materyal yelpazesinin HREM verilerini üretmek için çok basit protokoller ve bunların uygulama örnekleri. HREM verilerini oluşturmak için iş akışı basittir ve metakrilat reçinesine yerleştirebilen tüm malzemeler için geçerlidir ( Şekil 1 ). Ancak, numune hazırlamada dikkate alınması gereken doku spesifik farklılıklar vardır. Bu nedenle, çeşitli numuneleri hazırlamak için üç standart protokol öneriyoruz. Katıştırma ve veri oluşturma protokol adımları hepsi için aynıdır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672">
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:231px;">JB-4 Plus Embedding Kit</td>
			<td style="width:115px;">Polysciences Europe GmbH</td>
			<td style="width:161px;">18570-1</td>
			<td style="width:167px;">includes Benzoyl Peroxide, Plasticized (Catalyst) and Solution A+B</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Polyethylene Molding Cup Trays, 6x8x5mm hexagon (9 cavities)</td>
			<td style="width:115px;">Polysciences Europe GmbH</td>
			<td style="width:161px;">17177A-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Polyethylene Molding Cup Trays, 13x19x5mm (9 cavities)</td>
			<td style="width:115px;">Polysciences Europe GmbH</td>
			<td style="width:161px;">17177C-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">JB-4 Plastic Block Holders</td>
			<td style="width:115px;">Polysciences Europe GmbH</td>
			<td>15899-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:231px;">Eosin</td>
			<td style="width:115px;">Waldeck GmbH &#38; Co. KG, Division Chroma</td>
			<td style="width:161px;">1A-196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Microtec CUT 4060E</td>
			<td></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>rotary microtome</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:231px;">Leica DM LM, fluorescence compound microscope</td>
			<td style="width:115px;">Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:231px;">GFP filter set</td>
			<td style="width:115px;">Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td>
			<td style="width:161px;">11090937180000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:231px;">Motorised cross table</td>
			<td style="width:115px;">Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH &#38; CO. KG</td>
			<td style="width:161px;">KT5-LSMA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">Digital video camera SPOT-FLEX</td>
			<td style="width:115px;">Visitron Systems GmbH.</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">precisExcite High-Power LED</td>
			<td style="width:115px;">Visitron Systems GmbH.</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>light source</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:231px;">VisiView 2.1.4</td>
			<td style="width:115px;">Visitron Systems GmbH.</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>Image capturing software</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:231px;">Hard metal knife (tungsten carbide), profile D</td>
			<td style="width:115px;">Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">KL 2500 LCD</td>
			<td style="width:115px;">Schott AG</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td>light source </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-resolution episcopic microscopy (hrem) - simple and robust protocols for processing and visualizing organic materials

Yüksek çözünürlüklü episkopik mikroskopi (HREM) yöntemiyle dijital ses verileri üretmek için basit protokoller sunuyoruz. HREM, 1 x 1 x 1 ve 5 x 5 x 5 μm 3 arasında tipik sayısal çözünürlüklerde 5 x 5 x 7 mm 3 hacimdeki organik malzemeleri görüntüleme kapasitesindedir. Numuneler, metakrilat reçinesine gömülmüş ve bir mikrotom üzerinde kesitlenmiştir. Her bölümden sonra blok yüzeyinin bir görüntüsü bileşik mikroskop başlığına bağlı fototüp üzerinde bulunan bir dijital video kamera ile yakalanır. Optik eksen bir yeşil flüoresan proteini (GFP) filtre küpünü geçer ve her bölümden sonra tutma yeri tutma kolunun durduğu bir konuma hizalanır. Bu şekilde, daha sonraki blok yüzeyleri gösteren doğal olarak hizalanan dijital görüntü dizisi üretilir. Böyle bir görüntü serisini üç boyutlu (3D) görselleştirme yazılımına yüklemek sanal hacimlere izin veren dijital hacim verilerine derhal dönüştürmeyi kolaylaştırırÇeşitli dik ve eğik düzlemlerde hareket etme ve hacim ve yüzey oluşturan bilgisayar modelleri oluşturma. Fare, civciv, bıldırcın, kurbağa ve zebra balık embriyoları, insan biyopsisi materyali, kaplanmamış kağıt ve cilt yenileme materyali dahil olmak üzere organik numunelerin çeşitli gruplarını işlemek için üç basit, doku spesifik protokolü sunuyoruz.

HREM, hematoksilen / eozin boyalı histolojik bölümlerin görüntülerine benzeyen kontrastlı, özünde hizalanmış dijital görüntü dizisi üretir. 2D kesit görüntülerin aksine, HREM görüntü yığınları, 3D organik materyallerin çok çeşitli doku mimarisi, morfolojisi ve topolojisinin görselleştirilmesi ve analizi için olanak tanır. Yüksek kontrast, genellikle, hacim oluşturulan bilgisayar modellerinin hızlı ve basit bir şekilde görselleştirilmesini ve yüzey render modellerin üretilmesi için yarı otomatik kontur bulgularını kolaylaştırır. HREM verilerinin boyutu, kamera hedefinin boyutuna, görüntü yakalama moduna (8, 12, 16 bit, gri tonlama, renk) ve tek blok yüz görüntülerinin sayısına göre değişir. 2,048 piksel x 2,048 piksel boyutundaki 1.000 8 bit.jpg gri tonlama görüntüsü için daha küçük veri setleri yaklaşık 900 MB&#39;lık bir boyuta sahiptir. 3.000 8-bit.jpg gri ölçekli 4,096 p&#39;lik daha büyük veri setleriIxel x 4.096 piksel, yaklaşık 20 GB hacimde. Sağlanan protokoller basit ve sağlamdır ve son on yılda birçok farklı numunenin HREM verilerini üretmek için istihdam edildi. Protokol 1.1 bölümü, 1 cm&#39;ye kadar bir uzunluktaki biyomedikal model organizmaların bütün embriyolarını ve 5 x 5 x 5 mm3&#39;e kadar bir boyuta sahip embriyo dokusu örneklerinin işlenmesi için optimize edilmiştir; Fare ( Mus musculus) , civciv ( Gallus gallus ), zebra balığı ( Danio rerio ), bıldırcın ( Coturnix coturnix) , Afrika pençe kurbağa ( Xenopus laevis ), at ( Equus ferus caballus ), süt tohumu böceği ( Oncopeltus fasciatus ), timsah ( Crocodylia ) ve ahtapot ( Ahtapot vulgaris ). Tüm türlerin verileri mükemmel kalitede idi ( örn . Şekil 3 ) 3 e kadar boyutlara sahip genç ve yetişkin doku numunelerinin işlenmesi için optimize edildi ve doku numunelerinin görüntülenmesi için kullanıldı. Insanlardan ( Homo sapiens ), farelerden ( Mus musculus ), sıçanlardan ( Rattus norvegicus ), domuzlardan ( Sus scrofa domestica ) ferreti ( Mustela&#39;dan ) alınan karaciğer, pankreas, böbrek, tiroit, kalp, çizgili kas, beyin, sinirler ve tümör modelleri Furo ), meyve sineği ( Drosophila melanogaster ) ve zebra balığı ( Danio rerio ). Sonuçlar en örneklerle ( Tablo 4 , Animasyon 1 ) mükemmel iken (epidermisli) cildin merkez kısımları ve beyin örnekleri 3 x 3 x 3 mm 3&#39;den daha büyük eozinin penetrasyon yetersizliğinden dolayı lekelenmemiş olarak kaldı Bu dokular. Protokol sEction 1.3, elyaflı organik materyallerin işlenmesi için optimize edildi ve kaplanmış kağıt, kaplanmamış kağıt, yerli dermal yerine geçen materyal ve kök hücresi tohumlanmış dermal yerine geçen materyalin elyaf mimarisini görselleştirmek için kullanıldı. Bu örneklerin işlenmesi kolay ve hızlıydı. Kaplamasız kağıt ve çoğu cilt kullananların verileri iyi kalitede idi ( Şekil 5 , Animasyon 2 ). Anorganik madde eozinin nüfuz etmesini engellediğinde kaplamalı kağıdın işlenmesinde sorunlar oluştu. Bir başka sorun, agar temelinde cilt ikame işleminde ortaya çıktı, çünkü kısmen sızma çözeltisi tarafından sindirildi. <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig1.jpg" /> Şekil 1: İş Akışı. Kırmızı kutularda gösterilen basamaklar örnek özelliklerine göre değişiklik gerektirir. Yeşil kutulardaki basamaklar,Tüm örneklerde benzerdir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/56071fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig2.jpg" /> Şekil 2: Özel kalıplar. Kalıplar orijinal kalıba bir delik açarak, bir Pasteur pipetinin ampulünü yerleştirerek ve model materyaliyle sızdırmaz şekilde uyarlanabilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/56071fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig3.jpg" /> Şekil 3: Örneklem Görsel Embriyolar. (A, B) Embriyonik günde hasat edilen fare embriyo E = 9.5. HREM kesit görüntüsü, (A) </strong&gt;. Cildi oluşturan hacim gösteren 3D model (B) &#39; de gösterilmiştir. (C) E15.5 fare embriyo boynu hacim render model vasıtasıyla Sanal sagital kesit. (D) Gelişimsel Hamburger Hamilton (HH) evresindeki civciv embriyo 18. Kardiyovasküler bileşenlerin lümeninin yüzey modeli, tüm embriyo dokularının hacim oluşturma ile kombine edilmiştir. Ölçek çubukları = 200 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/56071fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig4.jpg" /> Şekil 4: Örnek Görülen Yetişkin Doku Örnekleri. (A) HREM bölümünün bir parçası bir insan siniri vasıtasıyla imge. Yerleştirme, görüntünün bir bölümünü daha ayrıntılı gösterir. (B) Domuz karaciğeri yoluyla HREM bölümünün bir parçası. N&#39;yi not edinuclei. (C) İnsan lenfatik dokusunun bir HREM bölüm görüntüsünün bir parçası. (D, E) Bir insan parmak başlığının kalın cildi. Hacim tüm biyopsinin 3D modelini oluşturdu. (D) HREM verileri (E) yoluyla sanal rezeksiyonun önündeki damar, damar ve sinir modellerini yüzey oluşturdu. (F) Yetişkin fare dokusunda deneysel tümör. Hacim, HREM verileri aracılığıyla üç sanal bölümün önünde 3D model oluşturdu. Nekrotik parçaları not edin (ok uçları). Ölçek çubukları = 200 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/56071fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56071/56071fig5.jpg" /> Şekil 5: Örnek Olarak Görselleştirilen Lifli Materyal. (A, B) Kaplanmamış kahverengi kağıdın HREM kesit görüntüsü. (B) </sTrong&gt;, (A) &#39; nın bir bölümünü gösterir. Lifleri ve lümenlerini not edin. (C) kaplanmış kağıt HREM bölümü. Elyafların lekesiz kaldığını unutmayın. (D) Yerli deri yerine kullanılan materyalin hacim oluşturan modeli. Liflerin farklı kalibrelerine ve biçimlerine dikkat edin. Ölçek çubukları = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/56071fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/56071/56071mov1.jpg" /> Animasyon 1: Bir İnsan Kılavuzluğunun Kalın Cildinin Hacim Üzerinde Oluşturulan Modeli. Doku bloğunun boyutu yaklaşık 4.2 x 2.7 x 2.7 mm 3&#39;tür . Voksel boyut 1.07 x 1.07 x 2 μm3&#39;tür. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/animation1.mp4" target="_blank">Bu videoyu izlemek için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)</a> <pClass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-sayfa = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Film 2" src="/files/ftp_upload/56071/56071mov2.jpg" /> Animasyon 2: Native Dermal Substitute Malzemenin Hacim Arttırılmış Modeli. Numunenin boyutu yaklaşık 1.2 x 0.85 x 0.4 mm 3&#39;tür . Voksel büyüklüğü 0.54 x 0.54 x 2 μm3&#39;tür. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56071/animation2.mp4" target="_blank">Bu videoyu izlemek için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials at JoVE.com

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

Yüksek çözünürlüklü episkopik mikroskopi yöntemi ile sayısal hacim veri üretmesine izin vermek için, çeşitli türlerin biyopsi materyali, biyomedikal model organizmaların embriyoları ve diğer organik dokuların numunelerinin işlenmesi için basit ve sağlam protokoller sunuyoruz.

Yüksek Çözünürlüklü Episkopik Mikroskopi (HREM) - Organik Malzemelerin İşlenmesi ve Görselleştirilmesi için Basit ve Sağlam Protokoller

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Rapid Acquisition of 3D Images Using High-resolution Episcopic Microscopy

3D Görüntüleri Hızlı Toplama Yüksek çözünürlüklü Episcopic Mikroskopi kullanma

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Kök ve Hipokotil Gelişimin Uzun Süreli Konfokal Görüntülemesi için Basit Bir Oda

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

Sineği boyanmasına ile steroidogenik organları ve İnteraktif Organlar görselleştirme için Protokoller<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Bağdaşık süper çözünürlük ve elektron mikroskobu Zebra balığı Retina Protein yerelleşme gidermek için

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Geniş hacimli içinde belirli hücresel hedefleri bulmak için seri bölümlerin Multimodal hiyerarşik görüntüleme

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Kromozom segregasyon mitoz sırasında canlı hücre görüntüleme

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Thin Film Composite Silicon Elastomers for Cell Culture and Skin Applications: Manufacturing and Characterization

İnce Film kompozit silikon elastomer hücre kültürü ve cilt uygulamaları için: üretim ve karakterizasyonu

In this protocol, we present methods to fabricate thin elastomer composite films for advanced cell culture applications and for the development of skin ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...