Name: transplantation of schwann cells inside pvdf-trfe conduits to bridge transected rat spinal cord stumps to promote axon regeneration across the gap
Uploaded: 2017-11-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap at JoVE.com

Wij wil bedanken de virale Vector en dier Cores bij het Project van de Miami tot verlamming van de remedie voor produceren de lenti-GFP-virus en bieden dierenverzorgers, respectievelijk, de histologie en Imaging Cores voor het gebruik van de cryostaat, confocal microscoop, en fluorescente microscoop met Stereo-Detective. Financiering werd verstrekt door NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) en NSF (DMR-1006510). M.B. Bunge is de Christine E Lynn Distinguished Professor of Neuroscience.

vrouwelijke volwassen Fischer ratten (180-200 g lichaamsgewicht) volgens de NIH en USDA richtlijnen zijn ondergebracht. De institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Miami alle dierlijke procedures afgekeurd.
 1. pre transplantatie voorbereiding <ol><li>Conduit voorbereiding.
	<ol><li>Gesneden de leiding tot 5 mm in lengte met een #10 mes onder een Microscoop ontleden. 
		Opmerking: De inwendige diameter van de leiding is tussen 2.4-2...

De meest kritische stap in het creëren van een effectieve transect model is het doorsnijden van het ruggenmerg in één of twee delen. Een 2-2.5 mm kloof tussen de rostraal en caudal ruggenmerg stompen moet aanwezig zijn op de site van transect. De drie meest waarschijnlijke redenen voor dergelijke een kloof niet weergegeven zijn (1) de dorsale/ventrale wortels niet correct verwijderd, (2) de ventrale dura niet adequaat is verwijderd, en/of (3) het dier was niet goed gepositioneerd op de rol geplaatst onder haar.
<p...

Spinal cord injury reparatie is een complex en uitdagend probleem dat een strategie van de combinatorische behandeling met betrekking tot vergt, bijvoorbeeld, het gebruik van cellen en een biomaterial te voorzien van een gunstige communicatie voor getransplanteerde cel functie en axon herstel op de site van letsel. Hemisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 en volledige transect10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 modellen worden vaak gebruikt om te beoordelen van de effecten van de biomaterial gebaseerde "passerelle" therapieën. Het voordeel van het gebruik van een hemisection model is dat het meer stabiliteit voor de "passerelle" constructie in vergelijking met volledige transect biedt. In de hemisection modellen is het echter moeilijk te bewijzen van axon regeneratie als resultaat van de toegepaste therapeutische methode als gevolg van de aanwezigheid van bespaard weefsel. Het volledige transect model is de meest rigoureuze methode om aan te tonen van axon regeneratie.
Diverse natuurlijke en synthetische materialen zijn bestudeerd voor gebruik als een injecteerbare gel, een pre-gevormde gel in kneuzingen of hemisection modellen, of als een gestructureerde conduit in hemisection geplaatst of voltooien transect modellen (gedetailleerd in de beoordelingen23 , 24 , 25). in situ gelerend van een mengsel van injecteerbare matrix/SC maakt een meer tolerante interface tussen de transplantatie, het snoer van de gastheer voor axon kruising26,27 ten opzichte van vooraf gegeleerde matrix/SC implantaten 5 , 18 , 19 , 28. in situ gelerend de matrix contour rond de onregelmatige host-interfaces, overwegende dat een meer rigide en gestructureerde conduit of een minder vormbare pre-gevormde gel kon niet toegestaan. Een gestructureerde conduit biedt vaak contact begeleiding en implantaat stabiliteit in tegenstelling tot een injecteerbare matrix. De protocollen die hier gepresenteerd beschrijven een chirurgische ingreep die maakt gebruik van zowel een injecteerbare kelder membraan-matrix (bijvoorbeeld matrigel, zie die de Tabel van materialen, bedoeld als injecteerbare matrix hier) en een gestructureerde conduit te evalueren van axon regeneratie in de meest rigoureuze ruggenmerg letsel model.
Electrospun poly-vinylidenedifluoride-trifluoroethylene (PVDF-TrFE) uitgelijnd vezelig holle leidingen worden gebruikt in onze experimentele aanpak. PVDF-TrFE is een piëzo-elektrische polymeer dat genereert een voorbijgaande lading wanneer mechanisch vervormd en is aangetoond dat het bevorderen van de uitbreiding en de axon regeneratie van de neurite zowel in vitro29,30 en in vivo 31. Electrospinning is een gemeenschappelijk steiger fabricage methode die kan snel produceren betrouwbare vezelig steigers met behulp van een verscheidenheid van polymeren met controleerbare eigenschappen zoals uitlijning van de vezels, de diameter van de vezel en dikte van de steiger voor neurale en andere toepassingen32,33,34.
Talrijke studies van rat SCs getransplanteerd in ruggenmerg letsel sites hebben aangetoond dat behandeling werkzaamheid5,9,18,19,20,21 ,26. Deze transplantaties zijn neuroprotectieve voor weefsel rondom de laesie, laesie holte verkleinen, en bevorderen van axon regeneratie in de laesie/transplantatie site en de myelinisering van de geregenereerde axonen. Menselijke SCs autologously kunnen worden getransplanteerd, een voordeel in vergelijking met de meeste andere neurale-gerelateerde cellen24. Na een biopsie van de perifere zenuwen, SCs kunnen worden geïsoleerd en gezuiverd en zal verspreiden tot het gewenste bedrag voor transplantatie in mensen. Autologe transplantatie van de SC voor ruggenmerg gewonde patiënten is bewezen veilig in Iran35,36,,37,38, China39,40, en de Verenigde Staten41,42. SCs staan bekend om afscheiden van talrijke neurotrophic factoren en extracellulaire matrix eiwitten belangrijk voor de groei van de axon en een essentiële rol te spelen bij axon regeneratie na perifere zenuw verwonding. Ons doel hier is om te beschrijven van methoden die conduit ontwerpen onderzoeken kunnen ter verbetering van de resultaten van SC transplantatie in een volledige rat ruggenmerg transect model.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5000-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium: nutrient mixture F-12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11039-021</td>
			<td>&#34;DMEM/F12&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&#34;Pen/Strep&#34; in protcol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH300-70-03</td>
			<td>&#34;FBS&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pituitary extract</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>BT-215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>396-HB/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2636</td>
			<td>&#34;PLL&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>&#34;DMEM&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14170-112</td>
			<td>&#34;HBSS&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryspin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Fischer rat (160-180g)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor, straight</td>
			<td>FST</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Vedco Inc</td>
			<td>5098976106</td>
			<td>100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Lloyd Inc</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>20 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>APP Pharmaceuticals</td>
			<td>NDC 63323-010-02</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Spatula</td>
			<td>FST</td>
			<td>10089-11</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors with blunt end</td>
			<td>FST</td>
			<td>14017-18</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11006-12</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rongeur</td>
			<td>FST</td>
			<td>16121-14</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled spring scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15006-09</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorption triangles</td>
			<td>FST</td>
			<td>18105-03</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>9083300</td>
			<td>&#34;Compressed foam&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 blades</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>06-3010</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>&#34;Injectable matrix&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-green fluorescent protein antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB16901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse RT97 hybridoma antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>RT97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-neurofilament antibody</td>
			<td>Encor Biotechnology, Inc</td>
			<td>PRCA-NF-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z033401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>clsi</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transplantation of schwann cells inside pvdf-trfe conduits to bridge transected rat spinal cord stumps to promote axon regeneration across the gap

Onder de verschillende modellen voor dwarslaesie bij ratten, wordt de kneuzingen model het vaakst gebruikt omdat het is het meest voorkomende type van menselijke dwarslaesie. Het volledige transect model, is hoewel niet als klinisch relevant als het model van kneuzingen, de meest rigoureuze method to evaluate methode axon regeneratie. In het model van kneuzingen is het moeilijk te onderscheiden van geregenereerde van gekiemde of bespaard axonen als gevolg van de aanwezigheid van het resterende weefsel post schade. In het volledige transect model is een "passerelle" methode nodig om de leemte opvullen en continuïteit maken vanuit de rostraal de caudal stompen om te evalueren van de doeltreffendheid van de behandelingen. Een betrouwbare "passerelle" operatie is essentieel voor het testen van resultaat maatregelen door het verminderen van de variabiliteit als gevolg van de chirurgische methode. De hier beschreven protocollen worden gebruikt voor het bereiden van Schwann cellen (gcv) en leidingen voorafgaand aan de transplantatie, volledige transect van het ruggenmerg thoracale niveau 8 (T8), invoegen van de leiding en SCs transplantatie in de leiding. Deze aanpak maakt ook gebruik van in situ gelerend van een injecteerbare kelder membraan matrix met SC transplantatie waarmee verbeterde axon groei over de rostraal en caudal interfaces met het weefsel van de gastheer.

Het doel van het gebruik van deze chirurgische techniek is om het gebruik van een gestructureerde conduit en injecteerbare matrix dat SC functie na transplantatie in voltooide verbeelde spinal koorden maximaliseert te evalueren. Drie weken na de transplantatie, de dieren zijn geperfundeerd met 4% paraformaldehyde en de spinale kolommen zijn grove ontleed en vastgesteld in de dezelfde fixeerspray voor een andere 24 h. Het ruggenmerg is vervolgens ontleed en de monsters voor de cryostaat Sa...

Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap at JoVE.com

Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap

Dit artikel beschrijft een techniek om het invoegen van een holle buis tussen de stronken van de ruggenmerg na volledige transect en vullen met cellen van Schwann (gcv) en injecteerbare kelder membraan matrix bevorderen van axon regeneratie over de kloof te overbruggen.

Transplantatie van Schwann cellen binnen PVDF-TrFE Conduits verbeelde Rat ruggenmerg stronken ter bevordering van de regeneratie van het Axon over de kloof overbruggen

Among various models for spinal cord injury in rats, the contusion model is the most often used because it is the most common type of human spinal cord ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Orthotope Aorta Transplantatie: Een Rat Model voor de ontwikkeling van chronische vasculopathie Study

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

Acute en chronische Tactile Sensory Testing na ruggenmergletsel bij ratten

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

De meting en behandeling van Onderdrukking in Amblyopie

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Gecontroleerde Corticale Impact Model voor traumatisch hersenletsel

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

Een radio-telemetrische systeem om de cardiovasculaire functie bij ratten met Spinal Cord doorsnijding en embryonale neurale stamcellen Enten Monitor

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

Neural Stem Cell Transplantation in Experimental Contusive Model of Spinal Cord Injury

Neurale stamceltransplantatie bij Experimentele Contusive Model van Spinal Cord Injury

Spinal cord injury is a devastating clinical condition, characterized by a complex of neurological dysfunctions. Animal models of spinal cord injury can ...

Reproducible Motor Deficit Following Aortic Occlusion in a Rat Model Of Spinal Cord Ischemia

Reproduceerbare motortekort na aorta-occlusie in een ratmodel van wervelkolom-ischemie

Spinal cord ischemia is a fatal complication following thoracoabdominal aortic aneurysm surgery. Researchers can investigate the strategies for preventing ...

A Clinical Trial Assessing the Safety, Efficacy, and Delivery of Olive-Oil-Based Three-Chamber Bags for Parenteral Nutrition

Een klinisch onderzoek waarin de veiligheid, werkzaamheid en levering van op olijfolie gebaseerde drie kamer zakken voor parenterale voeding worden geëvalueerd

Limited evidence exists to precisely estimate efficacy and safety differences between parenteral nutrition (PN) prepared using olive-oil-based ...

Modified Heterotopic Hindlimb Osteomyocutaneous Flap Model in the Rat for Translational Vascularized Composite Allotransplantation Research

Bewerkt Heterotopic achterpoten Osteomyocutaneous flap model in de rat voor translationele vasculaire composiet Allotransplantation onderzoek

Vascularized composite allotransplantation (VCA) is a relatively new field in the reconstructive surgery. Clinical achievements in human VCA include hand ...

A Rat Lung Transplantation Model of Warm Ischemia/Reperfusion Injury: Optimizations to Improve Outcomes

Een rattenlongtransplantatiemodel van warme ischemie / reperfusieletsel: optimalisaties om de resultaten te verbeteren

From our experience with rat lung transplantation, we have found several areas for improvement. Information in the existing literature regarding methods ...