Name: transplantation of schwann cells inside pvdf-trfe conduits to bridge transected rat spinal cord stumps to promote axon regeneration across the gap
Uploaded: 2017-11-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap at JoVE.com

Nous tenons à remercier le vecteur Viral et les noyaux de l’Animal au projet de Miami à la paralysie de la Cure pour produisant la lenti-GFP-virus et fournissant soins des animaux, respectivement et l’histologie et noyaux d’imagerie pour l’utilisation du cryostat, microscope confocal, et microscope à fluorescence avec stéréo enquêteur. Financement a été assuré par NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) et NSF (DMR-1006510). M.B. Bunge est le Christine E Lynn distingué professeur de neurosciences.

rats femelles adultes de Fischer (180-200 g de poids corporel) sont logés conformément aux directives NIH et USDA. L’utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Miami et un animalier institutionnel approuvé toutes les procédures animaux.
 1. préparation avant Transplantation <ol><li>préparation Conduit.
	<ol><li>Coupe le conduit à 5 mm de longueur à l’aide d’une lame #10 sous un microscope à dissection. 
		NOTE : Le diamètre intérieur du conduit...

L’étape la plus importante dans la création d’un modèle efficace de transection est sectionnant la moelle épinière dans une ou deux coupes. Un écart de 2 à 2,5 mm entre les souches médullaires rostral et caudale devrait être présent sur le site de transection. Les trois raisons très probables de tel un fossé n’apparaissant ne pas sont (1) les racines dorsales/ventrale n’étaient pas correctement supprimés, (2) la dure-mère ventrale n’a pas été éliminée adéquatement et/ou (3) l’animal n’é...

Réparation de lésions de la moelle épinière est un problème complex et difficile qui nécessitera une stratégie de traitement combinatoire impliquant, par exemple, l’utilisation de cellules et un biomatériau pour fournir un micro-environnement favorable pour la fonction des cellules transplantées et axon régénération sur le site de lésion. Hémisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 et transection complète10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 modèles sont fréquemment utilisés pour évaluer les effets des thérapies ponts à base de biomatériaux. L’avantage d’utiliser un modèle hémisection est qu’il offre plus de stabilité pour la construction de pontage par rapport à la résection complète. Toutefois, dans les modèles hémisection, il est difficile de prouver la régénération axonale à l’issue de la méthode thérapeutique appliquée en raison de la présence de tissu épargné. Le modèle de transection complète est la méthode la plus rigoureuse de démontrer la régénération axonale.
Divers matériaux naturels et synthétiques ont été étudiés pour une utilisation comme un gel injectable, un gel pré-formé placé dans une contusion ou hémisection modèles, ou comme un conduit structuré dans hémisection ou toutes les modèles de transection (détaillés dans les commentaires23 , 24 , 25). in situ gélifiant d’un mélange de matrice/SC injectable crée une interface plus permissive entre la greffe et le cordon de l’hôte pour axon passage26,27 par rapport aux implants pré gélifié matrice/SC 5 , 18 , 19 , 28. in situ gélifiant a permis la matrice au contour autour des interfaces hôte irrégulière, alors qu’une conduite plus rigide et plus structurée ou un gel moins malléable préformé ne pouvait pas. Une conduite structurée offre souvent une stabilité orientation et implant contact contrairement à une matrice injectable. Les protocoles présentés ici décrivent une procédure chirurgicale qui profite des fois une matrice injectable membrane basale (p. ex., matrigel, voir la Table des matières, dénommé comme matrice injectable ici) et un tuyau structuré en vue de évaluer la régénération axonale dans le modèle de blessure de la moelle épinière plus rigoureux.
Électrofilées poly-vinylidenedifluoride-trifluoroéthylène (PVDF-TrFE) alignées fibreux conduites creux sont utilisés dans notre approche expérimentale. PVDF-TrFE est un polymère piézoélectrique qui génère une charge transitoire lorsque déformée mécaniquement et a été montré pour favoriser la régénération d’extension et axon neurites fois in vitro29,30 et in vivo 31. électrofilage est une méthode de fabrication échafaudage commune capable de produire rapidement des échafaudages fibreux fiables en utilisant une variété de polymères ayant des propriétés contrôlables telles que l’alignement de fibre, fibre de diamètre et l’épaisseur de l’échafaud pour neural et d’autres applications32,33,34.
De nombreuses études sur le rat SCs repiquées dans des sites de lésion de la moelle épinière ont démontré traitement efficacité5,9,18,19,20,21 ,26. Ces greffes sont neuroprotecteurs pour tissu qui entoure la lésion, de réduire la taille de cavité de lésion et promouvoir la régénération axonale dans le site de la lésion/transplantation et la myélinisation des axones régénérés. SCs humaines peuvent être transplantées autologously, un avantage par rapport à la plupart des autres neurones liés cellules24. Après une biopsie de nerf périphérique, SCs peuvent être isolées et purifiées et va proliférer à la quantité désirée pour la transplantation dans les humains. Autogreffe de SC pour les patients de la moelle épinière blessée a été prouvé pour être sûr en Iran35,36,37,38, Chine39,40et la United States41,42. SCs sont connus pour sécréter des nombreux facteurs neurotrophiques et les protéines de la matrice extracellulaire importants pour la croissance de l’axone et à jouer un rôle essentiel dans la régénération axonale après une lésion des nerfs périphériques. Notre objectif ici est de décrire les méthodes qui peuvent enquêter sur des conceptions de conduit pour améliorer les résultats de la transplantation de SC dans un modèle de transection de moelle épinière de rat complet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5000-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium: nutrient mixture F-12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11039-021</td>
			<td>&#34;DMEM/F12&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&#34;Pen/Strep&#34; in protcol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH300-70-03</td>
			<td>&#34;FBS&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pituitary extract</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>BT-215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>396-HB/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2636</td>
			<td>&#34;PLL&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>&#34;DMEM&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14170-112</td>
			<td>&#34;HBSS&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryspin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Fischer rat (160-180g)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor, straight</td>
			<td>FST</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Vedco Inc</td>
			<td>5098976106</td>
			<td>100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Lloyd Inc</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>20 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>APP Pharmaceuticals</td>
			<td>NDC 63323-010-02</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Spatula</td>
			<td>FST</td>
			<td>10089-11</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors with blunt end</td>
			<td>FST</td>
			<td>14017-18</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11006-12</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rongeur</td>
			<td>FST</td>
			<td>16121-14</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled spring scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15006-09</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorption triangles</td>
			<td>FST</td>
			<td>18105-03</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>9083300</td>
			<td>&#34;Compressed foam&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 blades</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>06-3010</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>&#34;Injectable matrix&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-green fluorescent protein antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB16901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse RT97 hybridoma antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>RT97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-neurofilament antibody</td>
			<td>Encor Biotechnology, Inc</td>
			<td>PRCA-NF-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z033401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>clsi</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transplantation of schwann cells inside pvdf-trfe conduits to bridge transected rat spinal cord stumps to promote axon regeneration across the gap

Parmi les différents modèles pour la blessure de la moelle épinière chez le rat, le modèle de la contusion est le plus souvent utilisé parce que c’est le type le plus commun de la moelle épinière humaine. Le modèle de transection complète, bien que pas aussi cliniquement pertinente que le modèle de la contusion, est la méthode la plus rigoureuse pour évaluer la régénération axonale. Dans le modèle de la contusion, il est difficile de distinguer régénérée des axones germés ou épargnés en raison de la présence d’autres lésions post. Dans le modèle de transection complète, une méthode de raccordement est nécessaire pour combler le vide et de créer une continuité de la rostrale des caudales souches afin d’évaluer l’efficacité des traitements. Une chirurgie de pontage fiable est indispensable pour tester les mesures de résultats en réduisant la variabilité due à la méthode chirurgicale. Les protocoles décrits ici sont utilisées pour préparer Schwann, cellules (SCs) et conduits avant la greffe, une résection complète de la moelle épinière au niveau thoracique 8 (T8), insérer le tube et transplant SCs dans le conduit. Cette approche utilise également en situ gélifiant d’une matrice injectable membrane basale avec transplantation SC qui permet la croissance axonale améliorée via les interfaces rostrales et caudales avec les tissus de l’hôte.

L’objectif de l’utilisation de cette technique chirurgicale consiste à évaluer l’utilisation d’un conduit structuré et matrice injectable qui maximise la fonction SC après la transplantation en rempli sectionnées moelles épinières. Trois semaines après la transplantation, les animaux sont perfusés avec paraformaldéhyde à 4 % et les colonnes vertébrales sont grossièrement disséqués et fixe le même fixateur pour encore 24 h. La moelle épinière est ensuite disséqu?...

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Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap

Cet article décrit une technique pour insérer un tube creux entre les souches de la moelle épinière après transection complète et remplissez-le de cellules de Schwann (SCs) et matrice injectable membrane basale afin de combler et de promouvoir la régénération axonale dans le fossé.

Transplantation de Schwann des cellules à l’intérieur des Conduits de PVDF-TrFE pour combler les souches moelle épinière sectionnée Rat pour promouvoir la régénération axonale dans le fossé

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