Name: transplantation of schwann cells inside pvdf-trfe conduits to bridge transected rat spinal cord stumps to promote axon regeneration across the gap
Uploaded: 2017-11-03T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap at JoVE.com

Wir möchten der viralen Vektoren und Tier Kerne am Miami-Projekt zur Heilung Lähmung Herstellung von Lenti-GFP-Virus und die Tierpflege, Histologie und Imaging-Kerne für die Nutzung des Kryostaten, confocal Mikroskop danken und Fluoreszenz-Mikroskop mit Stereo-Ermittler. Finanzierung wurde von NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) und NSF (DMR-1006510) bereitgestellt. M.b. Bunge ist die Christine E Lynn Distinguished Professor of Neuroscience.

weiblichen Erwachsene Ratten Fischer (180-200 g Körpergewicht) nach NIH und USDA Richtlinien untergebracht sind. Die institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Miami genehmigt alle tierische Verfahren.
 1. vor Transplantation Vorbereitung <ol><li>Conduit Vorbereitung.
	<ol><li>Schneiden die Leitung bis zu 5 mm in der Länge mit einem #10 Klinge unter dem sezierenden Mikroskop. 
		Hinweis: Der Innendurchmesser des Rohres ist zwisch...

Der wichtigste Schritt bei der Schaffung einer effektiven Durchtrennung Modells ist das Rückenmark in ein oder zwei Schnitten durchtrennen. Eine 2-2,5 mm Lücke zwischen die Stümpfe rostral und kaudalen Rückenmark sollte am Durchtrennung Standort vorhanden sein. Die drei wahrscheinlichsten Gründe für solch eine Lücke, die nicht angezeigt werden (1) die dorsale/ventrale Wurzeln nicht richtig entfernt wurden, (2) die ventrale Dura wurde nicht ausreichend entfernt und/oder (3) das Tier war nicht richtig positioniert, ...

Rückenmark Verletzungen Reparatur ist eine komplexe und herausfordernde Problem, die erfordern eine kombinatorische Behandlungsstrategie einbeziehen, zum Beispiel, die Verwendung von Zellen und Biomaterial für Funktion der transplantierten Zellen und Axon zu einem günstigen Mikroumgebung Regeneration auf der Website von Verletzungen. Hemisektion1,2,3,4,5,6,7,8,9 und vollständige Durchtrennung10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 Modelle dienen häufig zur Beurteilung der Auswirkungen von bridging Biomaterial-Therapien. Der Vorteil der Verwendung einer Hemisektion-Modell ist, dass es mehr Stabilität für die Überbrückung Konstrukt im Vergleich zum kompletten Durchtrennung bietet. In Hemisektion Modelle ist es jedoch schwer nachzuweisen Axon Regeneration als Ergebnis der angewandten therapeutischen Methode aufgrund des Vorhandenseins von verschont Gewebe. Die vollständige Durchtrennung Modell ist die strengste Methode Axon Regeneration zu demonstrieren.
Verschiedene natürliche und synthetische Materialien sind für den Einsatz als ein injizierbares Gel untersucht worden, eine vorgeformte Gel Prellung oder Hemisektion Modelle oder als strukturierte Kanal in Hemisektion oder komplette Durchtrennung Modelle (siehe Bewertungen23 , 24 , 25). in Situ gelling eine injizierbare Matrix/SC-Mischung schafft eine freizügige Schnittstelle zwischen der Transplantation und die Host-Schnur für Axon Kreuzung26,27 im Vergleich zu vorher gelierte Matrix/SC Implantate 5 , 18 , 19 , 28. in Situ Gelierung die Matrix, um die unregelmäßige Host-Schnittstellen Kontur, während ein strenger und strukturierte Conduit oder weniger formbare vorgeformte Gel nicht konnte erlaubt. Eine strukturierte Conduit bietet oft Kontakt Beratung und Implantat Stabilität im Gegensatz zu einer injizierbaren Matrix. Die hier vorgestellten Protokolle beschreiben einen chirurgischen Eingriff, der nutzt eine injizierbare Basalmembran Matrix (z. B. Matrigel, sehen Sie die Tabelle der Materialien, bezeichnet als injizierbare Matrix hier) und eine strukturierte Conduit Axon Regeneration im strengsten Rückenmark Verletzungen Modell zu bewerten.
Electrospun Poly-Vinylidenedifluoride-Trifluoroethylene (PVDF-TrFE) ausgerichtete faserige hohle Leitungen in unsere experimentellen Ansatz verwendet werden. PVDF-TrFE ist ein Piezo Polymer, das erzeugt einer vorübergehenden Gebühr wenn mechanisch verformt und hat gezeigt, dass Neuriten Erweiterung und Axon Regeneration zu fördern in-vitro-29,30 und in Vivo 31. Elektrospinnen ist eine gemeinsame Gerüst Herstellungsverfahren, die schnell zuverlässige faserige Gerüste mit einer Vielzahl von Polymeren mit kontrollierbaren Eigenschaften wie Faserausrichtung, Faserdurchmesser und Dicke des Gerüstes für produzieren kann neuronale und andere Anwendungen32,33,34.
Zahlreiche Studien der Ratte SCs in Rückenmark Verletzungen Standorte verpflanzt haben Behandlung Wirksamkeit5,9,18,19,20,21 gezeigt. ,26. Diese Transplantationen sind neuroprotektive für Gewebe um die Läsion, Läsion Hohlraum verkleinern und Axon Regeneration in die Läsion/Transplantation Website und Myelinisierung der regenerierten Axone zu fördern. Menschlichen SCs autologously transplantiert werden können, ein Vorteil im Vergleich zu den meisten anderen im Zusammenhang mit neuronalen Zellen24. Nach einer peripheren Nervenbiopsie SCs isoliert und gereinigt und wird auf den gewünschten Wert für die Transplantation in den Menschen vermehren. Autologe Transplantation der SC bei querschnittgelähmten Patienten nachgewiesen wurde, im Iran35,36,37,38, China39,40, sicher zu sein und die Vereinigten Staaten41,42. SCs sind zahlreiche neurotrophen Faktoren und extrazelluläre Matrixproteine wichtig für das Wachstum der Axon absondern und spielen eine wesentliche Rolle im Axon Regeneration nach periphere Nervenverletzung bekannt. Unser Ziel ist es, Methoden zu beschreiben, die Conduit-Designs, um das Ergebnis der SC-Transplantation in einem kompletten Rückenmark Durchtrennung Rattenmodell zu verbessern untersuchen können.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryogenic vials</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5000-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium: nutrient mixture F-12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11039-021</td>
			<td>&#34;DMEM/F12&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&#34;Pen/Strep&#34; in protcol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH300-70-03</td>
			<td>&#34;FBS&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pituitary extract</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>BT-215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heregulin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>396-HB/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2636</td>
			<td>&#34;PLL&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>&#34;DMEM&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14170-112</td>
			<td>&#34;HBSS&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryspin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Fischer rat (160-180g)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissor, straight</td>
			<td>FST</td>
			<td>15018-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>Vedco Inc</td>
			<td>5098976106</td>
			<td>100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Lloyd Inc</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>20 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>APP Pharmaceuticals</td>
			<td>NDC 63323-010-02</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Spatula</td>
			<td>FST</td>
			<td>10089-11</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors with blunt end</td>
			<td>FST</td>
			<td>14017-18</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11006-12</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rongeur</td>
			<td>FST</td>
			<td>16121-14</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled spring scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15006-09</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorption triangles</td>
			<td>FST</td>
			<td>18105-03</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>9083300</td>
			<td>&#34;Compressed foam&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#10 blades</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>06-3010</td>
			<td>Can be any brand of choice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>&#34;Injectable matrix&#34; in protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-green fluorescent protein antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB16901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse RT97 hybridoma antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>RT97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-neurofilament antibody</td>
			<td>Encor Biotechnology, Inc</td>
			<td>PRCA-NF-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody</td>
			<td>Dako</td>
			<td>Z033401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>clsi</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transplantation of schwann cells inside pvdf-trfe conduits to bridge transected rat spinal cord stumps to promote axon regeneration across the gap

Unter verschiedenen Modellen für Rückenmarksverletzungen bei Ratten ist die Prellung Modell am häufigsten verwendet, weil es die häufigste Form der menschlichen Rückenmarksverletzungen ist. Die vollständige Durchtrennung Modell ist zwar nicht als klinisch relevant als Prellung Modell, die strengsten Methode, Axon Regeneration zu bewerten. In der Prellung-Modell ist es schwierig, regenerierte aus gekeimten oder verschont Axone aufgrund des Vorhandenseins der verbleibenden Post Gewebeverletzungen zu unterscheiden. Im kompletten Durchtrennung-Modell ist eine Überbrückung Methode notwendig, um die Lücke zu füllen und schaffen Kontinuität von der Höhlung an der kaudalen Stümpfe für die Beurteilung der Wirksamkeit der Behandlungen. Eine zuverlässige Überbrückung Chirurgie unbedingt Zielparameter durch die Reduzierung der Variabilität durch die chirurgische Methode zu testen. Die hier beschriebenen Protokolle werden verwendet, um Schwann Zellen (SCs) vorbereiten und Leitungen vor der Transplantation, vollständige Durchtrennung des Rückenmarks bei thorakalen Stufe 8 (T8), legen Sie die Leitung und verpflanzen SCs in der Leitung. Dieser Ansatz verwendet auch in Situ gelling eine injizierbare Basalmembran Matrix mit SC-Transplantation, die verbesserte Axon Wachstum über die rostral und kaudalen Schnittstellen mit dem Host-Gewebe ermöglicht.

Das Ziel der Verwendung dieser Operationstechnik ist bewerten die Verwendung eines strukturierten Conduit und injizierbaren Matrix, die nach der Transplantation in abgeschlossenen durchtrennten Rückenmark SC Funktion maximiert. Drei Wochen nach der Transplantation, die Tiere sind mit 4 % Paraformaldehyd durchblutet und die Wirbelsäulen sind grob zerlegt und in der gleichen Fixiermittel für ein weiteres 24 h behoben. Das Rückenmark wird dann durchschnitten und die Proben für Kryostat ...

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Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zum Einfügen eines hohlen Bindeglied zwischen Rückenmark Stümpfe nach vollständige Durchtrennung und mit Schwann-Zellen (SCs) und injizierbare Basalmembran Matrix zu überbrücken und zur Förderung Axon Regeneration über die Lücke füllen.

Transplantation von Schwann-Zellen im Inneren PVDF-TrFE Conduits, durchtrennten Ratte Rückenmark Stümpfe zur Förderung der Axon Regeneration über die Lücke zu überbrücken

Among various models for spinal cord injury in rats, the contusion model is the most often used because it is the most common type of human spinal cord ...

Research

JoVE Journal

Medicine

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Orthotopen Aorten-Transplantation: Ein Rattenmodell die Entwicklung von chronischen Vaskulopathie Study

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

Forschung

Medizin

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Akute und chronische taktile Sensorische Testung nach Verletzungen des Rückenmarks bei der Ratte

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Die Messung und Behandlung von Unterdrückung in Amblyopie

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

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Controlled Cortical Impact-Modell für traumatische Hirnverletzung

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

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Ein Radio-Telemetrie-System zur Herz-Kreislauf-Funktion bei Ratten mit Rückenmarksdurchtrennung und embryonalen Neural Stem Cell Grafts überwachen

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

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